תרבית יבלות צמחיות מספקת פתרון להערכה מדויקת, יעילה ומהירה של פירוק מטבולי של קסנוביוטיקה בצמחים. תרבית יבלות צמחיות יכולה למנוע הפרעות מיקרוביום או פטריות ופירוק פוטוכימי, לפשט את אפקט המטריצה של צמחים שלמים, לתקנן את תנאי הגידול, לקצר את משך הטיפול ולדרוש פחות מאמץ ניסיוני. השיטה המוצעת כאן יכולה לספק תובנה לגבי התנהגות הקליטה והמנגנונים המטבוליים של מזהמים אורגניים שונים בגידולים חקלאיים והם שימושיים למאמצים בהערכת סיכונים סביבתיים.
כדי להתחיל, autoclave כל הציוד ולבצע את כל הפעולות בספסל עבודה מעוקר UV אולטרה נקי. יש לעקר את משטח הזרעים הוורנליים עם אתנול 75% למשך 20 דקות. שטפו אותם במים סטריליים שעברו דה-יוניזציה שלוש פעמים ושוב עקרו אותם עם 20% מי חמצן למשך 20 דקות.
לאחר שטיפת הזרעים במים מעוקרים שעברו דה-יוניזציה שש פעמים, יש להנביט אותם על ידי זריעה על מדיום Murashige ו-Skoog נטול הורמונים בעלי pH 5.8 המכיל 1% ג'ל אגר ולדגור ב-26 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות למשך 15 יום. לאחר 15 ימים של דגירה זרעים, לחתוך את hypocotyl ו cotyledon של שתיל לחתיכות קטנות של 0.5 ס"מ כדי לקבל את explants. הפכו את הצמחים בצלחת פטרי המכילה 15 עד 20 מיליליטר של מדיום מורשיג וסקוג עם תוספת של אוקסימון ופיקוציאנין ודגרו בחושך בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה שבועות כדי לגרום ליבלת.
בעזרת אזמל סטרילי ומלקחיים, מפרידים את היבלת בקוטר של כסנטימטר אחד שנוצרה מהצמחים הראשוניים. לטיפול, להמיס 2, 4-dibromophenol ב 10 מיליליטר של נוזל אספטי Murashige ו Skoog בינוני. לאחר מכן מוסיפים שלושה גרם של יבלת גזר מופרדת לתמיסת 2, 4-dibromophenol המוכנה.
לאחר הכנת המדיום בשליטה ריקה כמתואר בכתב היד, דוגרים על כל הצלוחיות בחושך. כדי להכין את הדגימה, להפריד את היבלת בזהירות מן הטיפול 2, 3-dibromophenol טיפול צלוחיות בקרה על ידי סינון עם מסנני סיבי זכוכית 0.45 מיקרון. לשטוף את יבלת שלוש פעמים עם מים טהורים במיוחד לפני איסוף אותו.
להקפיא לייבש את כל יבלות שנאספו הומוגניזציה 0.2 גרם של יבלת מיובשת עם מטחנת רקמות תפוקה גבוהה ב 70 הרץ במשך שלוש דקות. השתמש במיקרומזרק זכוכית כדי להוסיף 50 מיקרוליטר של 4-n-nanophenol חלופי לתוך יבלת הומוגנית ומערבולת במשך דקה אחת. הוסף חמישה מיליליטר של התמיסה המכילה יחס שווה של מתנול ומים ליבלת הקוצנית וסוני אותו במשך 30 דקות כדי לחלץ את 2, 4-dibromophenol ומטבוליטים.
לאחר החילוץ, צנטריפוגה את המתלה ב 8, 000 G ב ארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאסוף את supernatant על ידי pipetting. העבירו את התמצית דרך מיצוי שלב מוצק הידרופילי ליפופילי מאוזן או מחסנית HLB-SPE בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לדלל את האנליטים על ידי העברת שישה מיליליטר מתנול דרך מחסנית HLB-SPE.
לאחר מכן רכז את ה- eluent המתקבל למיליליטר אחד תחת זרם עדין של גז חנקן לניתוח אינסטרומנטלי. לניתוח, פתח את דלת מחמם העמודים. לאחר מכן התקן את עמודת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים במיוחד על ידי חיבור כניסת העמודה לשסתום ההזרקה והשקע לכניסת ספקטרומטר המסות.
הכנס את קצה צינורות הממס A ו- B לבקבוקי הממס המתאימים. מקם את בקבוקוני הדגימה לפי מספר סידורי במיקומים המתאימים של מגשי הדגימה והכנס מחדש את מגשי הדגימה לתא הדגימה. בחלון התוכנה, לחץ על מכשיר ולאחר מכן על שיטת כניסה כדי לערוך את התנאים עבור הכרומטוגרמה הנוזלית.
בחר MS שיטה ולהגדיר את הפרמטרים של ניתוח ספקטרום המסה. לחץ על קובץ ולאחר מכן חדש כדי ליצור את מסד הנתונים ולתת לו שם. טען את התוכנית לדוגמה שנוצרה לעיל על ידי בחירת MS File, ואחריו Inlet File ו- Inject Volume.
שמור את מסד הנתונים בתיקיה לדוגמה של הפרוייקט על-ידי לחיצה על קובץ ושמור. לאחר מכן, בחר הפעל והתחל בחלון התוכנה הראשי ולחץ על רכוש נתונים לדוגמה, ואחריו בסדר כפתור ברשימת התחל לדוגמה לרוץ כדי לאסוף נתונים. כדי לעבד את הנתונים, בחר את שורת נתוני היעד ולחץ על חלון הכרומטוגרמה כדי להציג את כרומטוגרמה סריקת MS.
בחלון הכרומטוגרמה, לחץ על תצוגה, ואחריו TIC. לאחר לחיצה על גל הסריקה DS, הוסף מעקב ואישור כדי לקבל את סריקת ספקטרום המסה של הבת. הכרומטוגרמה של 2, 4-dibromophenol טיפול גזר callus לחלץ הראה נוכחות של שמונה מטבוליטים שונים לעומת דגימות הביקורת.
בנוסף, היעדר שיא הורה 2, 4-dibromophenol מן הכרומטוגרמה מצביע על חילוף חומרים מהיר של 2, 4-dibromophenol בגזר callus בתנאי ניסוי. יתר על כן, 2, 4-dibromophenol מודגר יבלת גזר הוביל להיווצרות של מטבוליטים על ידי צימוד ישיר עם גלוקוז וחומצות אמינו. כל הציוד, כמו גם מדיום Murashige ו Skoog צריך להיות autoclaved כדי לוודא כי בידול ותחזוקה של הצמח callus מבוצעים בתנאים אספטיים.
גישות Omics בעקבות הליך זה מאפשרות ליצור תמונה מכניסטית פיטוקסית ברורה של מזהמים סביבתיים.
