Name: measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

לדוגמא הכנה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצות את קו הנהג 3,22 Gal4 כדי כטב&quot;מ-GCaMP5G 19 זבובים (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). לאפשר לצלב לגדול ב 25 מעלות צלזיוס. הערה: יצירת טס עם מספר עותקים של transgenes Gal4 או כטב&quot;מ-GCaMP יכול לעזור כדי לשפר את עוצמת האות ניאון. גירסה קודמת של transgene כטב&quot;מ-GCaMP (כטב&quot;מ-GCaMP3) הראה עוצמת הקרינה חלשה מאוד כאשר הביע בשליטת הנהג Gr68a-Gal4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף נפרד על ידי זבובים בוגרים eclosed החדש סקס ולהעלות על 25 מעלות צלזיוס. הערה: רמת הבסיס של בתפרחת GCaMP5G היא אופטימלית אצל זבובים בגילאי 14-28 ימים. בידוד זבובים לפי מין מונע את האפשרות של אינטראקציות חברתיות שעלולים להשפיע על התגובות העצביות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זבוב תחת זרם עדין של CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את fly כדי coverslip זכוכית על ידי הנחת הראשון טיפה קטנה של לק במרכז של coverslip 0.17 מ&quot;מ. הנח בעדינות זבוב על צידו על טיפת לק ברור ולהבטיח כי הירידה כולו מכוסה על ידי זבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שלבים 1.5 ו -1.6 תחת סטראו לנתח, להשתמש בהגדלה 8X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכחול רטוב להאריך רגל קדמית של הזבוב. אבטח את רגלו הקדמית בעמדה על ידי הצבת שתי רצועות דקות של סרט על המגזרים tarsal הראשון והחמישי (איור 2 א). זה יחשוף מגזרים tarsal-T4 T2 הדמיה (איור 2 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי נוירונים תמונה על החוטם, במקום רצועה דקה של סרט על הדוכן של החוטם לחשוף את השפית (איור 2 ג, ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר מחסום הידרופובי סביב לטוס עם עט PAP כדי למנוע פתרון לזרום על פני השטח coverslip. לבצע מדידות תוך 30 דקות של הרכבה. </li></ol> 2. הכנת Stimulusפִּתָרוֹן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל הליגנדים lipophilic (כגון CH503, השתמשו במחקר זה) בתמיסה PBST: 137 mM NaCl, 2.7 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ Na 2 4 HPO, 1.8 מ&quot;מ KH 2 4 PO, 0.1% Triton X-100 (V / V ); pH 7.4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון המניה 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של ליגנד באמצעות PBST. הכן את כל הדילולים הבאים של פתרון המניות באמצעות PBST. הערה: בהתאם המסיסות של ליגנד של עניין, ממסים שונים עשויים להיות נחוצים כדי לפזר את ליגנד. המסיסות של CH503 בממסים שונים מתוארת בטבלת 1. בניגוד ממסים אחרים, PBST לא לייצר גידול הקרינה. </li></ol></li></ol> 3. גירוי של נוירונים Gustatory ורכישת תמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipettor 10 μl, מקום 10 μl של PBST על מגזרים tarsal. הערה: שלב זה מרטיב את הרגל ומונע מגזרי tarsal נסחף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במערכת אופטית שיש לו מצלמה של suמהירויות ורגישות fficient להשיג אות קרינה טובה ברזולוציה גבוהה בזמן. הערה: במחקר זה אנו השתמשנו במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב ומצלמת sCMOS (ראה רשימת חומרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את המגזר נוירונים הספציפיים tarsal להיות צלם. רוכש שלוש Z- ערימות confocal מראש גירוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן אידיאלי, הגדרות רכישת השימוש כי הם מהירים מספיק כדי לאפשר ברזולוצית זמן מקסימלי, תוך עדיין לכיד נפח התא כולו. דוגמא הגדרות רכישה הן: 200 חשיפה msec, binning 2 x 2 ו -6 x 0.5 מיקרומטר 2 חלקים אופטיים, כבשו כל sec 2. הערה: רגליות ללא יכולת לזוז כבר צילמו בהצלחה עד 10 דקות, ב 30 מרווחי שניות, ללא הלבנה ניכרת של האות GCaMP. עבור הקלטה פעמים כבר, להבטיח כי הרגליים בחוזקה מאוד במקום על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב כוח לייזר עבור אות לרעש הכי גבוהות שניתן עם photobleaching מינימלית במהלך הר&quot;י כולוגינג המשטר. עבור הניסויים שתוארו כאן, להשתמש דיודת לייזר 491 ננומטר (100 mW) בשעה שידור 30% הדמיה הן Gr68a ו gustatory ppk23 נוירונים על הרגליים חוטם. השתמש 2 X 2 binning כדי לאפשר פעמים חשיפה קצרה תוך השגת רזולוציה מרחבית מספיק. הערה: הגדרות צריכת החשמל לייזר היו אופטימיזציה כדי לאפשר זיהוי של שינוי ניאון החל גידול 1.2- ל -4.5 פי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 10 μl של פתרון הגירוי על מגזרי tarsal. בניסויים שליטים, להוסיף עוד 10 μl של PBST. מיד לרכוש 117 תמונות שלאחר גירוי. הערה: מספר התמונות שלאחר גירוי רכשה מבוסס על משך הזמן שבו שינוי מרבי קרינה הושג (כ 2 דקות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב קריטי: בעוד pipetting פתרון הכנה, לא לגעת לטוס עם קצה פיפטה מאז זה יגרום הרגל הקדמית לזוז ממקומן. הערה: לחילופין, להשתמשעל micromanipulator למצב כוס נימים המכילות גירוי קרוב במדויק למגזר tarsal להיות צלם. לספק כמויות מבוקרות של גירוי באמצעות מתקן microinjection תאי על פי הוראות היצרן. </li></ol></li></ol> עיבוד תמונה 4. וניתוח: כימות של התגובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח סדרה של ערימות-Z confocal באמצעות פיג&#39;י ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 או ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 24 תמונות תוכנה לניתוח ועיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערוך הקרנת עצמת הסכום של כל שש פרוסות Z עבור כל אחת מן הנקודות 120 זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;סטאק&quot; תחת &quot;תמונה&quot;. יתר על כן, ובחר באפשרות &quot;הקרנת Z&quot; וזן &quot;1&quot; כמו פרוסת ההתחלה &quot;4&quot; כמו פרוסה להפסיק. עבור סוג הקרנה, בחר R20; פרוסות סכום &quot;מהתפריט לנתץ, ובחר באפשרות&quot; הכל מסגרות זמן &quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר באזור (ROI) ריבית על ידי שימוש באפשרות הבחירה ביד חופשית לצייר גבול סביב גוף התא או השלכה העצבית. לחץ על התווית &quot;נתח&quot; ובחר באפשרות &quot;מנהל החזר על השקעה&quot; תחת &quot;כלים&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את הקרינה של ROI על ידי בחירה באפשרות &quot;מדידות גדר&quot;, תחת תפריט &quot;נתח&quot; סימון התיבות עבור משולבים בצפיפות, אזור, אומר וערך אפור מקסימלית תווית. לאחר מכן, בחר באפשרות &quot;עוד&quot; תחת תפריט מנהל ROI, ובהמשך לבחור באפשרות &quot;מידה רבה&quot;. הערה: זה יפיק תיבה קופץ עם ערכים עבור כל אחד הפרמטרים שנבחרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ערכי האפור מקסימלית כדי להבטיח שאף אחד פיקסלים הגיעו לרוויה (למשל, 65,535 עבור מצלמה 16-bit). הערה: לקבלת הניסויים מוצג tהנייר, התגובות שלו נמדדו או מגופי תא או תחזיות עצביות, תלוי איפה הגידול המקסימאלי ΔF / F נצפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השינוי היחסי מקסימום הקרינה (ΔF / F) בזמן t נקודת זמן הוא כדלקמן: <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרינת רקע פחת מכל ערך F (תא). כדי לכמת קרינת רקע, למדוד את הצפיפות המשולבת של החזר השקעה בשיעור של גודל וצורה מקבילים שטח של הרגל הקדמית (או החוטם) נטולת נוירונים לזיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את קרינת גירוי פוסט, F (תא) t, למדוד את הצפיפות המשולבת של ROI של גוף התא או תהליך בנקודת זמן &quot;t&quot; לאחר גירוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את הקרינה מראש גירוי, F (תא) t = 0, לנתח תמונות גירוי מראש של הגוף או תהליך התא באותו אופן כפיהאות שלאחר הגירוי. השתמש משולבים בצפיפות ממוצעת של 3 תמונות כדי לקבוע F (תא) t = 0. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+taste+receptors+in+Drosophila.">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li><li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system.">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li><li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship.">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li><li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23(+)+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior.">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li><li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity.">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).</li><li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).</li><li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors.">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors.">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li><li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster:+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2.">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila.">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li><li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors.">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li><li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila.">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li><li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila.">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li><li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla.">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355 (2014).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode.">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li><li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor.">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design.">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li><li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2++imaging+of+single+chemosensory+neurons.">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+synthesis.+Part+250:+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster,+as+(3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers.">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li><li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila.">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li><li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship.">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance.">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements.">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li><li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems.">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53 (2010).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+signaling+from+O(2)+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state.">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li></ol>

The authors declare that there are no competing financial interests.

אנו מתארים כאן שיטה יש לבצע הדמית סידן חיה של נוירונים היקפיים לתסיסנית 2 אברי חישה שונים. Ca 2 + -evoked תגובות פלורסנט GCaMP ב Gr68a-נוירונים המושרים על ידי ליגנד פרומון CH503 היה תלוי מינון וכמותיים. זה היה גם ניתן להבחין דפוסי תגובה עצבית שונים כגון phasic ותגובות טוניק....

בעלי חיים להסתמך על מידע חוש הריח gustatory לתווך החלטות חיוניות להישרדות ולרבייה. הבנה כיצד רמזי chemosensory מזוהים ועובד על מערכת העצבים דורשת זיהוי של קולטן החישה (S) ואת הליגנדים הכימיים המתאימים. תסיסנית לזהות מגוון מדהים של תרכובות נדיפות ו בלתי נדיף מהווה מודל מצוין בו כדי ללמוד את פיזיולוגיים מנגנוני chemosensation. בעוד איברי ההרחה תופסים מולקולות נדיפות, איברי gustatory מתמחים לזהות תרכובות תנודתיות נמוכות. כאן, אנו מציגים שיטה למדוד תגובות עצביות ישירות מאיברי הטעם של תסיסנית אל תנודתיות נמוכה, הליגנדים lipophilic. איברי Gustatory של הזבוב כוללים את הרגליים הקדמיות, חוטם, וכנפיים. מבוזרת על פני השטח של אברי טעם הם מבנים דמויי שיער המכונה sensilla המגיבים sugars, ביטר, מלחים, מים פרומונים 8. Sensilla סווג מורפולוגית לתוך זיפי טעם וטעם יתדות 9. ישנם כ 31 זיפי טעם על השפית כי המסווגים (L-type) הארוך, קצר (s-type) ביניים (i-סוג) מורפולוגיות. עצב סנסורי &#39;l&#39; ו &#39;s&#39; sensilla בית 4 מגיבים פיסיולוגיים לסוכר (תא S), מלח נמוך (תא L1), מלח גבוה ותרכובות מרירות (תא L2) ומים (תא W) 10 , 11. ה&#39;אני &#39;עצב סנסורי בית 2 sensilla, שאחד מהם מגיב הן מלח נמוך וסוכר, בעוד מגיב אחרת מלח גבוה 12. ישנם כ 41 טעם sensilla בזכרים ו -26 sensilla אצל נקבות מופצות על כל אחד הרגליים הקדמיות. עבור גברים ונשים כאחד, יש 21 sensilla על midleg, וכ -22 sensilla על hindleg 13. הנוירונים gustatory מוקפים הטעם sensilla על הרגליים גם גlassified לתוך L1, L2, W ו- S סוגים. שיטה סטנדרטית אחת למדידת פעילות חשמלית מתא עצב יחיד בעזרת אלקטרודות תאיות או תאי להקליט זרימת יונים. מדידות אלקטרודה לאפשר תפקוד עצבי להיחקר באורגניזמים שאינם מודל כגון מינים תסיסנית, עש, ודבורים אשר חסרים כלים גנטיים נרחבים עבור תיוג עצבי. עם זאת, בעוד שיטות אלקטרו שימשו באופן שגרתי כדי למדוד את פעילות מן הטעם תסיסנית sensilla 4,13,14, החלת גישה זו מציגה מספר אתגרים טכניים. ראשית, לטעום זיפים צריכים להיות מזוהים המבוססים על מורפולוגיה ומיקום מרחבים. עם זיהוי, מדידות אלקטרו יכולות להתעכב על ידי גודלו הקטן של sensilla, מוגבל נגישות בשל מיקום, וקושי ביישום כרכים מבוקרים של גירוי כימי טעם זיפים. כמו כן, גירוי של sensilla עלול ליצור אותות יותר מאחדסוג עצבי 15. שנית, זיהוי של אותות חשמליים ניתן בתוהו בשל רעשי רקע נובעות תנודות מכאניות ורעש מציוד אלקטרוני. שלישית, השימוש של אלקטרודה חידד יכול לפגוע בהכנת לטוס, אם משתמשים בו בצורה לא נכונה 14. לבסוף, הרכבת אסדת אלקטרופיזיולוגיה דורשת רכיבים אלקטרוניים מיוחדים למסירת גירוי, אות הקלטה, וניתוח נתונים ויכול להיות יקר. ב ד melanogaster, הזמינות של כלי הגנטי בקידוד יש להקל את הפיתוח של טכניקות הדמיה המאפשרות התגובות של אוכלוסיות קטנות של נוירונים להיחקר. גישה אחת כזו היא שימוש כתב CaLexA 16. בשיטה זו, רצפים הגן המקודד את גורם שעתוק LexA-VP16 לבין NFAT חלבון רגיש סידן הם התמזגו יחד. הפעלת סידן של calcineurin phosphatase חלבון מזרז את זרחון-דה של NFAT, בתורו, facilitaTES היבוא שלה לתוך הגרעין. בתוך הגרעין, תחום LexA נקשר מוטיב מחייב LexAop-DNA המכוון את הביטוי של החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כתב, ובכך מאפשר זיהוי מתמשך של נוירונים מופעלים מבחינה תפקודית. הגישה נוצלה בהצלחה כדי למדוד את התגובה של glomeruli חוש ריח הספציפי באונת המחושים בעקבות חשיפת זבובים לחיות עד odorant 16. לאחרונה, התגובות הפיזיולוגיות של נוירונים קולטן gustatory IR52c נמדדו מפני זבובים חיים באמצעות CaLexA 7. עם זאת, במחקר זה, היה צורך זבובי גיל עד 6 שבועות כדי לשפר שעתוק GFP. בעוד immunostaining עם נוגדן אנטי GFP ניתן להשתמש כדי להגביר את האות CaLexA, שיטה זו תחייב קיבעון רקמות, ובכך נמנעה האפשרות אפשרות דימות תאים חיים. GCaMP חלבון מחוון סידן המקודד גנטי כמו כן נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תגובות עצביות מספרמינים 17. החלבון GCaMP מאיר בעוצמה נמוכה לפני גירוי עצבי. יישום של גירוי מעורר פוטנציאל פעולה של נוירון, וכתוצאה מכך הזרם של Ca 2 +. GCaMP, חייב Ca 2 +, עובר שינוי קונפורמציה, גורם לו לזהור בעצמה בהירה (איור 1). גישת הדמיה שפותחה לאחרונה יחיד נוירון סידן שמשה לזיהוי גלוקוז ליגנד עבור נוירונים gustatory Gr61a הספציפיים הרגל הקדמי 18. במחקר זה, הרגליים הקדמיות גזור מן מהונדס תסיסנית להביע GCaMP בנוירונים gustatory Gr61a כוסו בשכבת agarose לפני הדמיה. עם זאת, השימוש ברקמה גזורה יכול לגרום מוזנח סופי ביטוי GCaMP, ובכך להגביל זמן מדידה רגיש זיהוי. בנוסף, agarose יכול להגביל רגישות בשל רמות רקע גבוהות של קרינה ומאפייני פיזור אור שלה. To לטפל בכמה חסרונות אלה, אנו מתארים את השימוש של הדמיה סידן בתיווך GCaMP להקליט בתגובות הפיזיולוגיות רגל קדמית ו חוטם נוירונים gustatory של בבעלי חיים שלמים. אנו מציגים את התגובות הפיזיולוגיות של Gr68a ונוירונים ppk23 להביע מקודדים גנטית GCaMP5G 19 עד פרומון השומנים תסיסנית, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. תגובות עצביות נמדדות על ידי כימותי גידול הקרינה של אות GCaMP5G במהלך גירוי פרומון. בפרוטוקול זה, נוירונים הם צילמו למשך כולל של 120 שניות, וזה מספיק כדי להבחין בדפוסי ההפעלה העצבית תאים בודדים.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

בניגוד ליונקים, חרקים כגון תסיסנית יש איברי טעם מרובים. הנוירונים chemosensory על הרגליים, חוטם, כנפיים צינור ההטלה של תסיסנית לבטא קולטנים gustatory 1,2, תעלות יונים 3-6, ו ionotropic קולטנים 7 כי מעורבים זיהוי של אותות חושיים תנודתי בלתי נדיף. נוירונים אלה קשר ישיר עם tastants כגון מזון, חומרים רעילים פרומונים ולכן להשפיע התנהגויות מורכבות רבות כגון האכלה, הטלה והזדווגות. קלטות אלקטרודה והדמית סידן כבר בשימוש נרחב חרקים לכמת את התגובות העצביות עוררו על ידי tastants אלה. עם זאת, אלקטרופיזיולוגיה דורש ציוד מיוחד ומדידות קבלה מתוך sensillum טעם יחיד יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית כתלות בתא-הסוג, הגודל, ואת המיקום. בנוסף, ברזולוציה נוירון בודד תסיסנית יכול להיות קשה להשיג מאז טעם sensilla house יותר מסוג אחד של נוירון chemosensory. שיטת הדמית סידן לחיות המתוארת כאן מאפשרת תגובות של נוירונים gustatory היחידים בזבובים חיים כדי להימדד. שיטה זו מתאימה במיוחד עבור הדמית תגובות עצביות פרומונים שומנים וסוגים ליגנד אחרים שיש להם מסיסות נמוכה ממס על בסיס מים.

מחוון סידן GCaMP התבטא גנטי באמצעות Gr68a-Gal4 או נהגי ppk23-Gal4. אוכלוסיות נפרדות של נוירונים רגל קדמיים ותאי תמיכה הלא עצביים מסומנות על ידי כל נהג (איור 3A-C). ליגנד ספציפי התגובות CH503 פרומון lipophilic נצפו Gr68a-Gal4 ותאי ppk23-Gal4 להביע GCaMP (איור 3D). השי...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

מדידת תגובות פיזיולוגיות של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עצב סנסורי כדי ליפידים פרומונים שימוש סידן הדמיה חיה

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K Views.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

Video: Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

טוען תסיסנית מסופי עצב עם אינדיקטורים סידן

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Biology

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

סידן הדמיה של ריח עוררו התגובות תסיסנית מחושים האונה

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscience

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובות עצביות הנגרמות על ידי טעם בדרוזופילה בוגרת

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

ב Vivo הדמיית סידן באמצעות חיישני סידן סינפטיים מקומיים בדרוזופילה מלנוגסטר

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

דרוזופילה אין ויוו דימות סידן: שיטה לדימות פונקציונלי של פעילות עצבית

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
...

Drosophila melanogaster (fruit fly)

Adult

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

Source: Shankar, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53392">Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

זיהוי תגובות פיזיולוגיות מתאי עצב חושיים בדרוזופילה

1. Sample Preparation

	Cross the Gal4 driver line to UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster flies (w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Allow the cross to grow ...

מדידת תגובות פיזיולוגיות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video