This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

1. Numune Hazırlama <ol><li> (P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118 w) UAS-GCaMP5G 19 sinekler Gal4 3,22 sürücü çizgiyi. Çapraz 25 ° C&#39;de büyümeye olanak sağlar. Not: Yaratma floresan sinyal yoğunluğu arttırmak için yardımcı olabilir Gal4 veya UAS-GCaMP transgenlerin birden fazla kopya ile uçar. Gr68a-Gal4 sürücünün kontrolü altında eksprese edildiği zaman, UAS GCaMP transgeni (UAS GCaMP3) daha önceki bir versiyonu çok zayıf floresan yoğunluk gösterdi. <ol><li> Toplayın ve seks yeni eclosed yetişkin sinekler tarafından ayrı ve 25 ° C&#39;de yükseltmek. Not: GCaMP5G çiçeklenme bazal seviyesi 14-28 gün arasında değişen sinekler uygunudur. Cinsiyete göre sinekler Yalıtımlı nöral yanıtları etkileyebilir sosyal etkileşimler olasılığını engeller. </li></ol></li><li> CO 2 hafif bir akımı altında bir sinek uyutmak. </li><li> f takınly ilk 0,17 mm lamel merkezinde oje küçük bir damla koyarak bir cam lamel. Yavaşça net oje damla üzerinde yan bir sinek yerleştirin ve tüm damla anında kapsamında olduğundan emin olun. </li><li> 8X büyütme kullanılan bir diseksiyon stereomikroskop altında adımları 1.5 ve 1.6 gerçekleştirin. </li><li> sineğin bir ön bacağını uzatmak için ıslak bir fırça kullanın. Birinci ve beşinci tarsal kesimleri (Şekil 2A) üzerinden bant iki ince şeritler yerleştirerek pozisyonda ön bacağını elde edin. Bu görüntüleme (Şekil 2B) için tarsal segmanları T2 T4 gösterecektir. </li><li> Burnumun görüntü nöronlar, labellum (Şekil 2C, D) maruz burnumun kürsüden üzerinde bant ince bir şerit yerleştirin. </li><li> lamel yüzeyi üzerinde akan çözelti önlemek için bir PAP kalem ile anında yaklaşık bir hidrofobik bariyer çizin. Montaj 30 dakika içinde ölçüm yapmak. </li></ol> Stimulus 2. HazırlıkÇözüm <ol><li> Lipofilik ligandlan seyreltik PBST solüsyonu (örneğin, bu çalışmada kullanılan CH503 gibi): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4,% 0.1 Triton X-100 (v / v ); pH 7.4. <ol><li> PBST kullanarak ligand 1 mg / ml stok çözelti yapmak. PBST kullanarak stok çözeltisi Müteakip tüm seyreltiler hazırlanır. Not: ilgi ligandın çözünürlüğüne bağlı olarak, farklı çözücüler ligandın çözülmesi için gerekli olabilir. Çeşitli çözücüler içinde CH503 çözünürlüğü Tablo 1&#39;de tarif edilmektedir. Diğer çözücüler farklı olarak, PBST floresansta bir artış sağlamamıştır. </li></ol></li></ol> Tat Nöronlar ve Image Acquisition 3. stimülasyonu <ol><li> 10 ul pipet kullanarak tarsal kesimleri üzerine PBST 10 ul yerleştirin. Not: Bu adım bacak nemlendirir ve sürüklenen gelen tarsal segmentleri engeller. </li><li> su bir kameraya sahip bir optik sistemini kullanınfficient hız ve hassasiyet yüksek zaman çözünürlüğü iyi floresan sinyal elde etmek. Not: Bu çalışma için biz dönen bir disk konfokal mikroskop ve bir sCMOS kamera (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Belirli tarsal segment ve nöronlar seçin yansıması. üç ön stimülasyon konfokal Z-yığınlarının edinin. <ol><li> İdeal olarak, kullanım edinme ayarları hala tüm hücre hacmi çekerken maksimum süre çözünürlüğü izin verecek kadar hızlı. Örnek edinme ayarları şunlardır: her 2 saniyede yakalanan x 2 2 ve 6 x 0,5 mikron 2 optik bölümleri, binning 200 msn pozlama. Not: İmmobilize bacak GCaMP sinyalinin hiç bir farkedilebilir ağartılması ile, 30 saniye aralıklarla, en fazla 10 dakika için başarılı bir şekilde görüntülenmiştir edilmiştir. uzun kayıt süreleri için, bacaklar lamel yerinde çok sıkı tutulur emin olun. </li><li> en yüksek sinyal-gürültü bütün ima boyunca en az photobleaching ile elde için lazer gücünü optimizerejimi ging. Burada tarif edilen deneyler için, görüntüleme için% 30 iletim de bacaklar ve burnumun üzerinde Gr68a ve ppk23 tat nöronlar hem 491 nm diyot lazer (100 mW) kullanın. hala yeterli uzaysal çözünürlüğü elde ederken kısa pozlama süreleri için izin vermek için 2 x 2 binning kullanın. Not: lazer gücü ayarlar 1.2- 4.5 katlık bir artışa kadar fluoresan değişim saptanmasına olanak tanınması için optimize edilmiştir. </li></ol></li><li> Pipet tarsal kesimleri üzerine uyarıcı çözeltisinin 10 ul. Kontrol deneyleri için PBST bir 10 ul ekle. Hemen 117 sonrası uyarım görüntüler elde. Not: edinilen sonrası stimülasyon görüntülerin sayısı floresan maksimal değişiklik ulaşıldı edildiği süreyi (yaklaşık 2 dakika) dayanmaktadır. <ol><li> KRİTİK ADIM: Bu ön ayağı konumunun dışına hareket etmesine sebep olacağından hazırlama çözüm pipetleme iken, pipet ile sinek dokunmak yok. Not: Alternatif olarak, kullanımıdoğru tarsal segment uyaran yakın içeren bir cam kılcal konumlandırmak için bir mikromanipülatör yansıması. üreticinin talimatlarına göre bir hücre içi mikroenjeksiyon dağıtıcı kullanarak uyaran kontrol birimleri verin. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Analiz: Tepki sayısallaştırılması <ol><li> Fiji (kullanarak konfokal Z-yığınlarının bir dizi aç <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 veya ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 24 görüntü analizi ve işleme yazılımı. </li><li> 120 kez noktalarının her biri için altı Z dilim toplamı yoğunluklu projeksiyonu yapın. <ol><li> &quot;Image&quot; altında &quot;Yığın&quot; seçeneğini seçin. Ayrıca, &quot;Z projeksiyon&quot; seçeneğini seçin ve durdurma dilim olarak başlangıç ​​dilim ve &quot;4&quot; olarak &quot;1&quot; girin. projeksiyon tipi için, R seçin20; toplamı dilimleri Tüm zaman dilimlerini &quot;açılır menüden, ve seçim&quot; &quot;. </li></ol></li><li> bir hücrenin vücuda ya da nöronal projeksiyon etrafında bir sınır çizmek için serbest seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgesini tanımlar. &quot;Analiz&quot; etiketi tıklayın ve &quot;Araçlar&quot; altında &quot;ROI yöneticisi&quot; seçeneğini seçin. </li><li> , &quot;Analiz&quot; menüsü altında, &quot;Set ölçümler&quot; seçeneğini seçerek ve entegre yoğunluğu, alan için kutuları işaretleyerek ROI floresan ölçmek ortalama ve maksimum gri değer ve etiket. Ardından, YG yöneticisi menüsü altında &quot;Diğer&quot; seçeneğini seçin ve daha sonra &quot;Çok önlem&quot; seçeneğini seçin. Not: Bu, seçilen parametrelerin her biri için değerleri ile bir pop-up kutusu oluşturur. </li><li> Piksel hiçbirinin doygunluğa ulaşmıştır sağlamak için maksimum gri değerleri kontrol (örneğin, 16-bit kamera 65.535). Not: deneylerde, T gösterilenonun kağıt, yanıtlar kadar taşınmış / F maksimal artış gözlendi yere bağlı olarak hücre gövdeleri veya nöronal projeksiyonları, gelen ya ölçüldü. </li><li> Aşağıdaki gibi bir zaman noktasında t floresan (mesafe kadar taşınmış / F) maksimum bağıl değişim hesaplamak: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Her bir F (hücre) değerinden Çıkar eşiğe. Arka plan floresan ölçmek için, tespit edilebilir nöronların yoksun ön ayağın (ya da hortum) bir alandan eşdeğer boyut ve şekilde bir ROI entegre yoğunluğunu ölçer. </li><li> Post-stimülasyon floresan, F (hücre) t ölçmek için uyarılmasından sonra zaman noktası &quot;t&quot; hücre gövdesinin veya sürecin ROI entegre yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Ön stimülasyon floresan ölçmek için, F (hücre) t = 0, aynı şekilde olarak hücre gövdesi veya sürecin öncesi uyaran görüntüleri analizPost-stimülasyon sinyali. F (hücre) t = 0 belirlemek için 3 görüntülerin ortalama entegre yoğunluğunu kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+taste+receptors+in+Drosophila.">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li><li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system.">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li><li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship.">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li><li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23(+)+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior.">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li><li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity.">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).</li><li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).</li><li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors.">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors.">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li><li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster:+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2.">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila.">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li><li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors.">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li><li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila.">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li><li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila.">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li><li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla.">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355 (2014).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode.">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li><li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor.">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design.">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li><li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2++imaging+of+single+chemosensory+neurons.">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+synthesis.+Part+250:+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster,+as+(3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers.">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li><li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila.">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li><li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship.">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance.">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements.">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li><li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems.">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53 (2010).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+signaling+from+O(2)+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state.">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li></ol>

The authors declare that there are no competing financial interests.

Biz burada 2 farklı duyu organları Drosophila periferik nöronların canlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ca + 2 CH503 doza bağımlı ve nicel olduğu feromon ligand ile uyarılan Gr68a-nöronlarda GCaMP fluoresan yanıt -evoked. Böyle fazik ve tonik yanıtlar gibi farklı nöral yanıt desenleri ayırt etmek de mümkündü. Fazik tepkiler gösteren nöronlar sürekli uyaranlara hızlı uyum sağlamak olduğuna inanıl...

Hayvanlar hayatta kalma ve üreme için gerekli kararları arabuluculuk koku ve tat bilgilere güveniyor. Algılanabilir ve sinir sistemi tarafından nasıl işlendiğini kimyasal duyu ipuçları anlama duyu reseptör (ler) ve karşılık gelen kimyasal ligand tanımlanmasını gerektirir., Drosophila uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin şaşırtıcı bir dizi tespit etmek ve fizyolojik olarak incelenmesi için mükemmel bir modeldir mekanizmalar chemosensation altında yatan. koku organları uçucu moleküller algıladıkları iken, tat organları düşük volatilite bileşikleri tespit etmek için uzman bulunmaktadır. Burada, doğrudan düşük volatilite, lipofilik ligandlara Drosophila melanogaster tat organlarından nöronal tepkilerini ölçmek için bir yöntem mevcut. sinek tat organları kol, burnumun ve kanatları dahil. s yanıt Sensilla olarak bilinen saç benzeri yapılar tat organları yüzeyi üzerinde dağıtılırugars, bitters, tuzlar, su ve feromonlar 8. Sensilla tat kıllar içine morfolojik tasnif edilmiş ve tat 9 mandal. uzun (L-tip) sınıflandırılır labellum yaklaşık 31 tat kılların kısa (S-tipi) ve ara madde (I-tipi) morfolojileri vardır. Şeker fizyolojik yanıt &#39;L&#39; ve &#39;S&#39; Sensilla evi 4 duyu nöronları (S hücresi), düşük tuzlu (L1 hücresi), tuz ve acı bileşikleri (L2 hücre) ve su (W hücresi) 10 11. Diğer cevaplarından ise yüksek tuz 12 düşük tuz ve şeker hem tepki biri &#39;i Sensilla evi 2 duyusal nöronlar,. erkeklerde yaklaşık 41 tat Sensilla ve Ön ayakların her dağıtılmış kadınlarda 26 Sensilla vardır. Her iki erkek ve kadınlarda, midleg 21 Sensilla ve hindleg 13 yaklaşık 22 Sensilla vardır. ayakları üzerinde tat Sensilla çevrili tat nöronlar da c vardırL1, L2, W ve S tipe lassified. tek nöronların elektrik aktivitesini ölçmek için bir standart yöntem iyon akışını kaydetmek için hücre dışı ya da hücre içi elektrotlar kullanır. Elektrot ölçümleri nöronal fonksiyonu, Drosophila türüne, kelebekler ve nöral etiketleme için geniş genetik araçları yoksun arılar gibi non-model organizmaların incelenmesi gereken sağlar. Elektrofizyolojik yöntemler rutin bu yaklaşımı uygulayarak, 4,13,14 Sensilla Drosophila tadı aktivitesini ölçmek için kullanılır olmuştur Bununla birlikte, birçok teknik zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kıllar morfolojisi ve uzamsal yere göre tespit edilmesi gerekir tadı. kimlik üzerine, elektrofizyolojik ölçümler, Sensilla küçük boyutu ile engellenmiş olabilir pozisyona bağlı erişilebilirlik sınırlıdır ve bir tat kimyasal uyarıcı kontrollü hacimleri uygulayarak zorluk kıl. Ayrıca, Sensilla uyarılması birden fazla sinyal oluşturabilirnöronal tip 15. İkinci olarak, elektrik sinyallerinin tespiti elektronik cihazların mekanik titreşim ve gürültü kaynaklanan arka plan gürültüsünü tarafından eleştirilmiştir olabilir. Yanlış 14 kullanıldığı takdirde Üçüncü olarak, bir bilenmiş elektrodun kullanılması, sinek hazırlık zarar verebilir. Son olarak, bir elektrofizyoloji teçhizat montaj uyaran teslim sinyal kayıt ve veri analizi için özel elektronik bileşenleri gerektirir ve masraflı olabilir. D. melanogaster, genetik olarak kodlanmış araçların kullanılabilirliği nöronların küçük popülasyonlarının yanıtları okudu izin görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu tür bir yaklaşım CaLexA raportör 16 kullanımıdır. Bu yöntemde, LexA-VP16 transkripsiyon faktörü ve kalsiyuma duyarlı bir protein NFAT kodlayan gen dizileri birbirine birleştirilir. protein fosfataz calcineurin&#39;in kalsiyum aktivasyon dönüş, facilita içinde, NFAT de-fosforilasyon katalize veçekirdeğin içine ithal TES. çekirdeğin içinde, LexA alan, böylece, işlevsel aktif nöronların sürekli teşhisine izin veren, yeşil flüoresan proteini (GFP) raportörün ifadesini yöneten bir LexAOp-DNA bağlanma motifi ile bağlanır. Yaklaşım odorant 16 canlı sinek maruz kaldıktan sonra antennal lobda özel koku glomerulusların tepkisini ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, IR52c tat reseptör nöronların fizyolojik yanıtlar CaLexA 7 kullanılarak canlı sinekler ölçüldü. 6 haftaya kadar GFP transkripsiyonu geliştirmek için Ancak, bu çalışma için, bu yaş sinekler gerekliydi. Bir anti-GFP antikoruyla immün CaLexA sinyali artırmak için kullanılabilir, ancak bu durumda, yöntem, canlı hücre görüntüleme olasılığını engelleyen, doku fiksasyon gerektirir. genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi proteini GCaMP da kapsamlı bir dizi nöronal yanıtları incelemek için kullanılmıştırtürler 17. Protein GCaMP nöronal uyarım önce düşük yoğunluklu fluoresces. Uyarıcı uygulanması Ca2 + akışı ile sonuçlanır nöron bir eylem potansiyeli tetikler. Ca + 2 bağlı GCaMP, bu daha parlak yoğunluk (Şekil 1) ile floresan neden konformasyonel değişime uğrar. Son yıllarda geliştirilmiş olan tek nöron kalsiyum görüntüleme yaklaşımı ön ayağı belirli bir Gr61a tat nöronlar 18 için ligand olarak glükoz tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada, Gr61a tat nöronlarda GCaMP eksprese Drosophila kesilerek ön bacakları görüntüleme önce agaroz tabakası ile kaplanmıştır. Bununla birlikte, kesilerek doku kullanımı, böylece ölçüm süresi ve saptama hassasiyetini sınırlayıcı GCaMP ifade nihai özet neden olabilir. Buna ek olarak, agaroz, yüksek floresan arka plan seviyeleri ve ışık saçma özelliklerine duyarlılık sınırlayabilir. To Bu sakıncalardan bazılarının ele, biz ön ayağın ve burnumun bozulmamış hayvanların tat nöronlar gelen fizyolojik yanıtları kaydetmek için GCaMP aracılı kalsiyum görüntüleme kullanımını tarif eder. Biz, bir Drosophila lipit feromon genetik olarak kodlanmış GCaMP5G 19 ifade eden fizyolojik Gr68a cevaplan ve ppk23 nöronlar, (3R, 11 Z, 19 Z) -3-asetoksi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503), 20 göstermektedir 21. Nöronal tepkiler feromon uyarımı esnasında GCaMP5G sinyalinin floresanstaki artışı miktarının ile ölçülür. Bu protokolde, nöronlar bireysel hücrelerin nöronal aktivasyon kalıplarını ayırt etmek yeterlidir 120 sn, toplam süresi görüntülenmiş.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gr68a-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from H. Amrein (Texas A&#38;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ppk23-Gal4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GCaMP5&#160;</td>
			<td></td>
			<td>42037</td>
			<td>Bloomington Drosophila&#160; Stock Center</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>63790-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish, &#34;Hard as Nails Clear&#34;&#160;</td>
			<td>Sally Hansen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>Z377821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>fine-tipped brush</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape&#160;</td>
			<td>Scotch brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>13021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, lab grade</td>
			<td>Merck</td>
			<td>10094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, HPLC grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>H303SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Recipe described in the protocol section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH503</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Synthesis described in Mori et al., 2010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td>
			<td>Hamamatsu&#160;</td>
			<td>C11578-22U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Ti-Eclipse)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning Disk Scan head&#160;</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td>CSU-X1-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

Memeliler aksine, örneğin Drosophila olarak böcekler birden tat organları vardır. Bacaklar, burnumun, kanat ve Drosophila ovipositor üzerine nöronların tat reseptörleri 1,2, iyon kanalları 3-6 ve uçucu ve uçucu olmayan duyusal ipuçlarının saptanmasında katılan iyonotropik reseptörler 7 ifade eder. Bu nöronlar doğrudan gıda, zararlı maddeler ve feromonlar gibi tat yoğunluğu arttırıcı başvurun ve bu nedenle bu tür beslenme, yumurtlama ve çiftleşme gibi birçok karmaşık davranışlar etkilemektedir. Elektrot kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yaygın olarak bu tat yoğunluğu arttırıcı tarafından uyarılmış nöronal yanıtları ölçmek için böcekler kullanılmaktadır. Ancak, elektrofizyoloji hücre tipi, boyutu ve konumuna bağlı olarak teknik olarak zor olabilir, tek bir tat Sensillum gelen özel ekipman ve elde ölçümleri gerektirir. Buna ek olarak, Drosophila tek nöron çözünürlüğü tat Sensilla hou beri elde etmek zor olabilirkimyasal duyu nöron se birden fazla türü. Burada anlatılan canlı kalsiyum görüntüleme yöntemi canlı sinekler tek tat nöronların yanıtları ölçülecek sağlar. Bu yöntem, su bazlı çözücüler içinde düşük çözünürlüğe sahip, lipid feromonlar ve diğer ligand türlerine nöronal yanıtları görüntüleme için özellikle uygundur.

GCaMP kalsiyum göstergesi genetik Gr68a-Gal4 veya ppk23-Gal4 sürücüleri kullanarak ifade edildi. Kol nöronlar ve nöral olmayan destek hücrelerinin ayrı nüfus her sürücü (Şekil 3A-C) tarafından sınıflandırılmıştır. Lipofilik feromon CH503 ligand spesifik yanıtlar Gr68a-Gal4 gözlendi ve ppk23-Gal4 hücreleri GCaMP (Şekil 3D) ifade. Görece GCaMP5G sinyali (kadar taşınmış / F) flüoresan yoğunluğundaki değişim ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K Görüntüleme.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

Video: Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. Although understanding the disease dynamics for each of these pathogens independently is vital, it is also important that the interactions between these pathogens are investigated and understood. 
We have developed a versatile in vitro model of HIV-malaria co-infection to study host immune responses to malaria in the context of HIV infection. Our model allows the study of secreted factors in cellular supernatants, cell surface and intracellular protein markers, as well as RNA expression levels. The experimental design and methods used limit variability and promote data reliability and reproducibility. 
All pathogens used in this model are natural human pathogens (Plasmodium falciparum and HIV-1), and all infected cells are naturally infected and used fresh. We use human erythrocytes parasitized with P. falciparum and maintained in continuous in vitro culture. We obtain freshly isolated peripheral blood mononuclear cells from chronically HIV-infected volunteers. Every condition used has an appropriate control (P. falciparum parasitized vs. normal erythrocytes), and every HIV-infected donor has an HIV uninfected control, from which cells are harvested on the same day. This model provides a realistic environment to study the interactions between malaria parasites and human immune cells in the context of HIV infection.

An In Vitro Model for Measuring Immune Responses to Malaria in the Context of HIV Co-infection

Human co-infection is difficult to replicate in vitro. However, human malaria parasites can readily be cultured in vitro, as can freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells naturally infected with HIV. This provides an excellent model for studying early immune responses to malaria parasites in the context of HIV co-infection.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; HIV Co-enfeksiyon Bağlamında Sıtma için Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Modeli

Malaria and HIV co-infection is a growing health priority. However, most research on malaria or HIV currently focuses on each infection individually. ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ cytosolic concentrations, linked to release from internal stores or an influx through plasma membrane channels, regulate cortical cell processes. Pathogens that adhere to or invade host cells trigger a reorganization of the actin cytoskeleton underlying the host plasma membrane, which likely affects both global and local Ca2+ signaling. Because these events may occur at low frequencies in a pseudo-stochastic manner over extended kinetics, the analysis of Ca2+ signals induced by pathogens raises major technical challenges that need to be addressed.
Here, we report protocols for the detection of global and local Ca2+ signals upon a Shigella infection of epithelial cells. In these protocols, artefacts linked to a prolonged exposure and photodamage associated with the excitation of Ca2+ fluorescent probes are troubleshot by stringently controlling the acquisition parameters over defined time periods during a Shigella invasion. Procedures are implemented to rigorously analyze the amplitude and frequency of global cytosolic Ca2+ signals during extended infection kinetics using the chemical probe Fluo-4.

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

Here, we present protocols to visualize calcium (Ca2+) responses elicited by HeLa cells infected by Shigella. By optimizing the parameters of bacterial infection and imaging with Ca2+ fluorescent probes, atypical global and local Ca2+ signals induced by bacteria over a large range of infection kinetics are characterized.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Bir

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA^{2 +} yanıtları görüntüleme

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Tüm Yaprak Görüntüleme kullanarak Bakteriyel Hücreler Live Stoma Tepki Değerlendirilmesi

Ile Enfekte Fare Bakteriyel Yük ve Bağışıklık Yanıtları Ölçüm Listeria monocytogenes

Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi

Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Faj Phenomics: Fizyolojik Yaklaşımlar Roman Viral Proteinler karakterize etmek

Bir

Yöntemler lipid Nötrofiller değişiklikler ve Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar sonraki oluşumunu incelemek

MDCK-SIAT1 hücreleri kullanarak antikor yanıt için Microneutralization tarafından insan Sera A(H3N2) virüsleri nötralize grip ölçme deneyi

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA^{2 +} yanıtları görüntüleme