Name: measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

1. Numune Hazırlama <ol><li> (P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40 1118 w) UAS-GCaMP5G 19 sinekler Gal4 3,22 sürücü çizgiyi. Çapraz 25 ° C&#39;de büyümeye olanak sağlar. Not: Yaratma floresan sinyal yoğunluğu arttırmak için yardımcı olabilir Gal4 veya UAS-GCaMP transgenlerin birden fazla kopya ile uçar. Gr68a-Gal4 sürücünün kontrolü altında eksprese edildiği zaman, UAS GCaMP transgeni (UAS GCaMP3) daha önceki bir versiyonu çok zayıf floresan yoğunluk gösterdi. <ol><li> Toplayın ve seks yeni eclosed yetişkin sinekler tarafından ayrı ve 25 ° C&#39;de yükseltmek. Not: GCaMP5G çiçeklenme bazal seviyesi 14-28 gün arasında değişen sinekler uygunudur. Cinsiyete göre sinekler Yalıtımlı nöral yanıtları etkileyebilir sosyal etkileşimler olasılığını engeller. </li></ol></li><li> CO 2 hafif bir akımı altında bir sinek uyutmak. </li><li> f takınly ilk 0,17 mm lamel merkezinde oje küçük bir damla koyarak bir cam lamel. Yavaşça net oje damla üzerinde yan bir sinek yerleştirin ve tüm damla anında kapsamında olduğundan emin olun. </li><li> 8X büyütme kullanılan bir diseksiyon stereomikroskop altında adımları 1.5 ve 1.6 gerçekleştirin. </li><li> sineğin bir ön bacağını uzatmak için ıslak bir fırça kullanın. Birinci ve beşinci tarsal kesimleri (Şekil 2A) üzerinden bant iki ince şeritler yerleştirerek pozisyonda ön bacağını elde edin. Bu görüntüleme (Şekil 2B) için tarsal segmanları T2 T4 gösterecektir. </li><li> Burnumun görüntü nöronlar, labellum (Şekil 2C, D) maruz burnumun kürsüden üzerinde bant ince bir şerit yerleştirin. </li><li> lamel yüzeyi üzerinde akan çözelti önlemek için bir PAP kalem ile anında yaklaşık bir hidrofobik bariyer çizin. Montaj 30 dakika içinde ölçüm yapmak. </li></ol> Stimulus 2. HazırlıkÇözüm <ol><li> Lipofilik ligandlan seyreltik PBST solüsyonu (örneğin, bu çalışmada kullanılan CH503 gibi): 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4,% 0.1 Triton X-100 (v / v ); pH 7.4. <ol><li> PBST kullanarak ligand 1 mg / ml stok çözelti yapmak. PBST kullanarak stok çözeltisi Müteakip tüm seyreltiler hazırlanır. Not: ilgi ligandın çözünürlüğüne bağlı olarak, farklı çözücüler ligandın çözülmesi için gerekli olabilir. Çeşitli çözücüler içinde CH503 çözünürlüğü Tablo 1&#39;de tarif edilmektedir. Diğer çözücüler farklı olarak, PBST floresansta bir artış sağlamamıştır. </li></ol></li></ol> Tat Nöronlar ve Image Acquisition 3. stimülasyonu <ol><li> 10 ul pipet kullanarak tarsal kesimleri üzerine PBST 10 ul yerleştirin. Not: Bu adım bacak nemlendirir ve sürüklenen gelen tarsal segmentleri engeller. </li><li> su bir kameraya sahip bir optik sistemini kullanınfficient hız ve hassasiyet yüksek zaman çözünürlüğü iyi floresan sinyal elde etmek. Not: Bu çalışma için biz dönen bir disk konfokal mikroskop ve bir sCMOS kamera (Malzeme listesi bakınız). </li><li> Belirli tarsal segment ve nöronlar seçin yansıması. üç ön stimülasyon konfokal Z-yığınlarının edinin. <ol><li> İdeal olarak, kullanım edinme ayarları hala tüm hücre hacmi çekerken maksimum süre çözünürlüğü izin verecek kadar hızlı. Örnek edinme ayarları şunlardır: her 2 saniyede yakalanan x 2 2 ve 6 x 0,5 mikron 2 optik bölümleri, binning 200 msn pozlama. Not: İmmobilize bacak GCaMP sinyalinin hiç bir farkedilebilir ağartılması ile, 30 saniye aralıklarla, en fazla 10 dakika için başarılı bir şekilde görüntülenmiştir edilmiştir. uzun kayıt süreleri için, bacaklar lamel yerinde çok sıkı tutulur emin olun. </li><li> en yüksek sinyal-gürültü bütün ima boyunca en az photobleaching ile elde için lazer gücünü optimizerejimi ging. Burada tarif edilen deneyler için, görüntüleme için% 30 iletim de bacaklar ve burnumun üzerinde Gr68a ve ppk23 tat nöronlar hem 491 nm diyot lazer (100 mW) kullanın. hala yeterli uzaysal çözünürlüğü elde ederken kısa pozlama süreleri için izin vermek için 2 x 2 binning kullanın. Not: lazer gücü ayarlar 1.2- 4.5 katlık bir artışa kadar fluoresan değişim saptanmasına olanak tanınması için optimize edilmiştir. </li></ol></li><li> Pipet tarsal kesimleri üzerine uyarıcı çözeltisinin 10 ul. Kontrol deneyleri için PBST bir 10 ul ekle. Hemen 117 sonrası uyarım görüntüler elde. Not: edinilen sonrası stimülasyon görüntülerin sayısı floresan maksimal değişiklik ulaşıldı edildiği süreyi (yaklaşık 2 dakika) dayanmaktadır. <ol><li> KRİTİK ADIM: Bu ön ayağı konumunun dışına hareket etmesine sebep olacağından hazırlama çözüm pipetleme iken, pipet ile sinek dokunmak yok. Not: Alternatif olarak, kullanımıdoğru tarsal segment uyaran yakın içeren bir cam kılcal konumlandırmak için bir mikromanipülatör yansıması. üreticinin talimatlarına göre bir hücre içi mikroenjeksiyon dağıtıcı kullanarak uyaran kontrol birimleri verin. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü İşleme ve Analiz: Tepki sayısallaştırılması <ol><li> Fiji (kullanarak konfokal Z-yığınlarının bir dizi aç <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 veya ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) 24 görüntü analizi ve işleme yazılımı. </li><li> 120 kez noktalarının her biri için altı Z dilim toplamı yoğunluklu projeksiyonu yapın. <ol><li> &quot;Image&quot; altında &quot;Yığın&quot; seçeneğini seçin. Ayrıca, &quot;Z projeksiyon&quot; seçeneğini seçin ve durdurma dilim olarak başlangıç ​​dilim ve &quot;4&quot; olarak &quot;1&quot; girin. projeksiyon tipi için, R seçin20; toplamı dilimleri Tüm zaman dilimlerini &quot;açılır menüden, ve seçim&quot; &quot;. </li></ol></li><li> bir hücrenin vücuda ya da nöronal projeksiyon etrafında bir sınır çizmek için serbest seçim aracını kullanarak ilgi (ROI) bölgesini tanımlar. &quot;Analiz&quot; etiketi tıklayın ve &quot;Araçlar&quot; altında &quot;ROI yöneticisi&quot; seçeneğini seçin. </li><li> , &quot;Analiz&quot; menüsü altında, &quot;Set ölçümler&quot; seçeneğini seçerek ve entegre yoğunluğu, alan için kutuları işaretleyerek ROI floresan ölçmek ortalama ve maksimum gri değer ve etiket. Ardından, YG yöneticisi menüsü altında &quot;Diğer&quot; seçeneğini seçin ve daha sonra &quot;Çok önlem&quot; seçeneğini seçin. Not: Bu, seçilen parametrelerin her biri için değerleri ile bir pop-up kutusu oluşturur. </li><li> Piksel hiçbirinin doygunluğa ulaşmıştır sağlamak için maksimum gri değerleri kontrol (örneğin, 16-bit kamera 65.535). Not: deneylerde, T gösterilenonun kağıt, yanıtlar kadar taşınmış / F maksimal artış gözlendi yere bağlı olarak hücre gövdeleri veya nöronal projeksiyonları, gelen ya ölçüldü. </li><li> Aşağıdaki gibi bir zaman noktasında t floresan (mesafe kadar taşınmış / F) maksimum bağıl değişim hesaplamak: <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Her bir F (hücre) değerinden Çıkar eşiğe. Arka plan floresan ölçmek için, tespit edilebilir nöronların yoksun ön ayağın (ya da hortum) bir alandan eşdeğer boyut ve şekilde bir ROI entegre yoğunluğunu ölçer. </li><li> Post-stimülasyon floresan, F (hücre) t ölçmek için uyarılmasından sonra zaman noktası &quot;t&quot; hücre gövdesinin veya sürecin ROI entegre yoğunluğunu ölçmek. </li><li> Ön stimülasyon floresan ölçmek için, F (hücre) t = 0, aynı şekilde olarak hücre gövdesi veya sürecin öncesi uyaran görüntüleri analizPost-stimülasyon sinyali. F (hücre) t = 0 belirlemek için 3 görüntülerin ortalama entegre yoğunluğunu kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candidate+taste+receptors+in+Drosophila.">Candidate taste receptors in Drosophila.</a> Science. 287, 1830-1834 (2000).</li><li>Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+restricted+expression+of+candidate+taste+receptors+in+the+Drosophila+gustatory+system.">Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system.</a> Curr. Biol. 11, 822-835 (2001).</li><li>Thistle, R., Cameron, P., Ghorayshi, A., Dennison, L., Scott, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+chemoreceptors+mediate+male-male+repulsion+and+male-female+attraction+during+Drosophila+courtship.">Contact chemoreceptors mediate male-male repulsion and male-female attraction during Drosophila courtship.</a> Cell. 149, 1140-1151 (2012).</li><li>Toda, H., Zhao, X., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+female+aphrodisiac+pheromone+activates+ppk23(+)+sensory+neurons+to+elicit+male+courtship+behavior.">The Drosophila female aphrodisiac pheromone activates ppk23(+) sensory neurons to elicit male courtship behavior.</a> Cell Rep. 1, 599-607 (2012).</li><li>Vijayan, V., Thistle, R., Liu, T., Starostina, E., Pikielny, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pheromone-sensing+neurons+expressing+the+ppk25+ion+channel+subunit+stimulate+male+courtship+and+female+receptivity.">Drosophila pheromone-sensing neurons expressing the ppk25 ion channel subunit stimulate male courtship and female receptivity.</a> PLoS Genet. 10, 1004238 (2014).</li><li>Lu, B., LaMora, A., Sun, Y., Welsh, M. J., Ben-Shahar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppk23-Dependent+chemosensory+functions+contribute+to+courtship+behavior+in+Drosophila+melanogaster.">ppk23-Dependent chemosensory functions contribute to courtship behavior in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Genet. 8, e1002587 (2012).</li><li>Koh, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+IR20a+Clade+of+Ionotropic+Receptors+Are+Candidate+Taste+and+Pheromone+Receptors.">The Drosophila IR20a Clade of Ionotropic Receptors Are Candidate Taste and Pheromone Receptors.</a> Neuron. 83, 850-865 (2014).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+taste+of+the+Drosophila+gustatory+receptors.">A taste of the Drosophila gustatory receptors.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 345-353 (2009).</li><li>Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gustatory+organs+of+Drosophila+melanogaster:+fine+structure+and+expression+of+the+putative+odorant-binding+protein+PBPRP2.">Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2.</a> Cell Tissue Res. 304, 423-437 (2001).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+bitter+taste+in+Drosophila.">Peripheral coding of bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 56, 139-152 (2003).</li><li>Rodrigues, V., Siddiqi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gustatory+mutant+of+Drosophila+defective+in+pyranose+receptors.">A gustatory mutant of Drosophila defective in pyranose receptors.</a> Mol. Genet. Genomics. 181, 406-408 (1981).</li><li>Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+antagonistic+gustatory+receptor+neurons+responding+to+sweet-salty+and+bitter+taste+in+Drosophila.">Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila.</a> J. Neurobiol. 61, 333-342 (2004).</li><li>Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+basis+of+taste+coding+in+the+legs+of+Drosophila.">The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila.</a> J. Neurosci. 34, 7148-7164 (2014).</li><li>Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+from+Drosophila+labellar+taste+sensilla.">Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla.</a> J. Vis. Exp. , e51355 (2014).</li><li>Meunier, N., Marion-Poll, F., Lansky, P., Rospars, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+individual+firing+frequencies+of+two+neurons+recorded+with+a+single+electrode.">Estimation of the individual firing frequencies of two neurons recorded with a single electrode.</a> Chem. Senses. 28, 671-679 (2003).</li><li>Masuyama, K., Zhang, Y., Rao, Y., Wang, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+neural+circuits+with+activity-dependent+nuclear+import+of+a+transcription+factor.">Mapping neural circuits with activity-dependent nuclear import of a transcription factor.</a> J. Neurogenet. 26, 89-102 (2012).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+the+GCaMP+calcium+sensor+reveal+the+mechanism+of+fluorescence+signal+change+and+aid+rational+design.">Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design.</a> J. Biol. Chem. 284, 6455-6464 (2009).</li><li>Miyamoto, T., Chen, Y., Slone, J., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Drosophila+glucose+receptor+using+Ca2++imaging+of+single+chemosensory+neurons.">Identification of a Drosophila glucose receptor using Ca2+ imaging of single chemosensory neurons.</a> PloS One. 8, e56304 (2013).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging.">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).</li><li>Shikichi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromone+synthesis.+Part+250:+Determination+of+the+stereostructure+of+CH503+a+sex+pheromone+of+male+Drosophila+melanogaster,+as+(3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol+by+synthesis+and+chromatographic+analysis+of+its+eight+isomers.">Pheromone synthesis. Part 250: Determination of the stereostructure of CH503 a sex pheromone of male Drosophila melanogaster, as (3R,11Z,19Z)-3-acetoxy-11,19-octacosadien-1-ol by synthesis and chromatographic analysis of its eight isomers.</a> Tetrahedron. 68, 3750-3760 (2012).</li><li>Yew, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+male+sex+pheromone+and+novel+cuticular+cues+for+chemical+communication+in+Drosophila.">A new male sex pheromone and novel cuticular cues for chemical communication in Drosophila.</a> Curr. Biol. 19, 1245-1254 (2009).</li><li>Bray, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+putative+Drosophila+pheromone+receptor+expressed+in+male-specific+taste+neurons+is+required+for+efficient+courtship.">A putative Drosophila pheromone receptor expressed in male-specific taste neurons is required for efficient courtship.</a> Neuron. 39, 1019-1029 (2003).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Kaissling, K. E., Zack Strausfeld, C., Rumbo, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+processes+in+insect+olfactory+receptors.+Mechanisms+and+behavioral+significance.">Adaptation processes in insect olfactory receptors. Mechanisms and behavioral significance.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 510, 104-112 (1987).</li><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements.">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, 986-996 (2001).</li><li>Koepsell, K., Wang, X., Hirsch, J. A., Sommer, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+function+of+neural+oscillations+in+early+sensory+systems.">Exploring the function of neural oscillations in early sensory systems.</a> Front Neurosci. 4, 53 (2010).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Busch, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+signaling+from+O(2)+sensors+sets+neural+circuit+activity+and+behavioral+state.">Tonic signaling from O(2) sensors sets neural circuit activity and behavioral state.</a> Nat Neurosci. 15, 581-591 (2012).</li></ol>

The authors declare that there are no competing financial interests.

Biz burada 2 farklı duyu organları Drosophila periferik nöronların canlı kalsiyum görüntüleme gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ca + 2 CH503 doza bağımlı ve nicel olduğu feromon ligand ile uyarılan Gr68a-nöronlarda GCaMP fluoresan yanıt -evoked. Böyle fazik ve tonik yanıtlar gibi farklı nöral yanıt desenleri ayırt etmek de mümkündü. Fazik tepkiler gösteren nöronlar sürekli uyaranlara hızlı uyum sağlamak olduğuna inanıl...

Hayvanlar hayatta kalma ve üreme için gerekli kararları arabuluculuk koku ve tat bilgilere güveniyor. Algılanabilir ve sinir sistemi tarafından nasıl işlendiğini kimyasal duyu ipuçları anlama duyu reseptör (ler) ve karşılık gelen kimyasal ligand tanımlanmasını gerektirir., Drosophila uçucu ve uçucu olmayan bileşiklerin şaşırtıcı bir dizi tespit etmek ve fizyolojik olarak incelenmesi için mükemmel bir modeldir mekanizmalar chemosensation altında yatan. koku organları uçucu moleküller algıladıkları iken, tat organları düşük volatilite bileşikleri tespit etmek için uzman bulunmaktadır. Burada, doğrudan düşük volatilite, lipofilik ligandlara Drosophila melanogaster tat organlarından nöronal tepkilerini ölçmek için bir yöntem mevcut. sinek tat organları kol, burnumun ve kanatları dahil. s yanıt Sensilla olarak bilinen saç benzeri yapılar tat organları yüzeyi üzerinde dağıtılırugars, bitters, tuzlar, su ve feromonlar 8. Sensilla tat kıllar içine morfolojik tasnif edilmiş ve tat 9 mandal. uzun (L-tip) sınıflandırılır labellum yaklaşık 31 tat kılların kısa (S-tipi) ve ara madde (I-tipi) morfolojileri vardır. Şeker fizyolojik yanıt &#39;L&#39; ve &#39;S&#39; Sensilla evi 4 duyu nöronları (S hücresi), düşük tuzlu (L1 hücresi), tuz ve acı bileşikleri (L2 hücre) ve su (W hücresi) 10 11. Diğer cevaplarından ise yüksek tuz 12 düşük tuz ve şeker hem tepki biri &#39;i Sensilla evi 2 duyusal nöronlar,. erkeklerde yaklaşık 41 tat Sensilla ve Ön ayakların her dağıtılmış kadınlarda 26 Sensilla vardır. Her iki erkek ve kadınlarda, midleg 21 Sensilla ve hindleg 13 yaklaşık 22 Sensilla vardır. ayakları üzerinde tat Sensilla çevrili tat nöronlar da c vardırL1, L2, W ve S tipe lassified. tek nöronların elektrik aktivitesini ölçmek için bir standart yöntem iyon akışını kaydetmek için hücre dışı ya da hücre içi elektrotlar kullanır. Elektrot ölçümleri nöronal fonksiyonu, Drosophila türüne, kelebekler ve nöral etiketleme için geniş genetik araçları yoksun arılar gibi non-model organizmaların incelenmesi gereken sağlar. Elektrofizyolojik yöntemler rutin bu yaklaşımı uygulayarak, 4,13,14 Sensilla Drosophila tadı aktivitesini ölçmek için kullanılır olmuştur Bununla birlikte, birçok teknik zorluklar getirmektedir. İlk olarak, kıllar morfolojisi ve uzamsal yere göre tespit edilmesi gerekir tadı. kimlik üzerine, elektrofizyolojik ölçümler, Sensilla küçük boyutu ile engellenmiş olabilir pozisyona bağlı erişilebilirlik sınırlıdır ve bir tat kimyasal uyarıcı kontrollü hacimleri uygulayarak zorluk kıl. Ayrıca, Sensilla uyarılması birden fazla sinyal oluşturabilirnöronal tip 15. İkinci olarak, elektrik sinyallerinin tespiti elektronik cihazların mekanik titreşim ve gürültü kaynaklanan arka plan gürültüsünü tarafından eleştirilmiştir olabilir. Yanlış 14 kullanıldığı takdirde Üçüncü olarak, bir bilenmiş elektrodun kullanılması, sinek hazırlık zarar verebilir. Son olarak, bir elektrofizyoloji teçhizat montaj uyaran teslim sinyal kayıt ve veri analizi için özel elektronik bileşenleri gerektirir ve masraflı olabilir. D. melanogaster, genetik olarak kodlanmış araçların kullanılabilirliği nöronların küçük popülasyonlarının yanıtları okudu izin görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu tür bir yaklaşım CaLexA raportör 16 kullanımıdır. Bu yöntemde, LexA-VP16 transkripsiyon faktörü ve kalsiyuma duyarlı bir protein NFAT kodlayan gen dizileri birbirine birleştirilir. protein fosfataz calcineurin&#39;in kalsiyum aktivasyon dönüş, facilita içinde, NFAT de-fosforilasyon katalize veçekirdeğin içine ithal TES. çekirdeğin içinde, LexA alan, böylece, işlevsel aktif nöronların sürekli teşhisine izin veren, yeşil flüoresan proteini (GFP) raportörün ifadesini yöneten bir LexAOp-DNA bağlanma motifi ile bağlanır. Yaklaşım odorant 16 canlı sinek maruz kaldıktan sonra antennal lobda özel koku glomerulusların tepkisini ölçmek için başarıyla kullanılmaktadır. Son zamanlarda, IR52c tat reseptör nöronların fizyolojik yanıtlar CaLexA 7 kullanılarak canlı sinekler ölçüldü. 6 haftaya kadar GFP transkripsiyonu geliştirmek için Ancak, bu çalışma için, bu yaş sinekler gerekliydi. Bir anti-GFP antikoruyla immün CaLexA sinyali artırmak için kullanılabilir, ancak bu durumda, yöntem, canlı hücre görüntüleme olasılığını engelleyen, doku fiksasyon gerektirir. genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi proteini GCaMP da kapsamlı bir dizi nöronal yanıtları incelemek için kullanılmıştırtürler 17. Protein GCaMP nöronal uyarım önce düşük yoğunluklu fluoresces. Uyarıcı uygulanması Ca2 + akışı ile sonuçlanır nöron bir eylem potansiyeli tetikler. Ca + 2 bağlı GCaMP, bu daha parlak yoğunluk (Şekil 1) ile floresan neden konformasyonel değişime uğrar. Son yıllarda geliştirilmiş olan tek nöron kalsiyum görüntüleme yaklaşımı ön ayağı belirli bir Gr61a tat nöronlar 18 için ligand olarak glükoz tespit etmek için kullanıldı. Bu çalışmada, Gr61a tat nöronlarda GCaMP eksprese Drosophila kesilerek ön bacakları görüntüleme önce agaroz tabakası ile kaplanmıştır. Bununla birlikte, kesilerek doku kullanımı, böylece ölçüm süresi ve saptama hassasiyetini sınırlayıcı GCaMP ifade nihai özet neden olabilir. Buna ek olarak, agaroz, yüksek floresan arka plan seviyeleri ve ışık saçma özelliklerine duyarlılık sınırlayabilir. To Bu sakıncalardan bazılarının ele, biz ön ayağın ve burnumun bozulmamış hayvanların tat nöronlar gelen fizyolojik yanıtları kaydetmek için GCaMP aracılı kalsiyum görüntüleme kullanımını tarif eder. Biz, bir Drosophila lipit feromon genetik olarak kodlanmış GCaMP5G 19 ifade eden fizyolojik Gr68a cevaplan ve ppk23 nöronlar, (3R, 11 Z, 19 Z) -3-asetoksi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503), 20 göstermektedir 21. Nöronal tepkiler feromon uyarımı esnasında GCaMP5G sinyalinin floresanstaki artışı miktarının ile ölçülür. Bu protokolde, nöronlar bireysel hücrelerin nöronal aktivasyon kalıplarını ayırt etmek yeterlidir 120 sn, toplam süresi görüntülenmiş.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

Memeliler aksine, örneğin Drosophila olarak böcekler birden tat organları vardır. Bacaklar, burnumun, kanat ve Drosophila ovipositor üzerine nöronların tat reseptörleri 1,2, iyon kanalları 3-6 ve uçucu ve uçucu olmayan duyusal ipuçlarının saptanmasında katılan iyonotropik reseptörler 7 ifade eder. Bu nöronlar doğrudan gıda, zararlı maddeler ve feromonlar gibi tat yoğunluğu arttırıcı başvurun ve bu nedenle bu tür beslenme, yumurtlama ve çiftleşme gibi birçok karmaşık davranışlar etkilemektedir. Elektrot kayıtları ve kalsiyum görüntüleme yaygın olarak bu tat yoğunluğu arttırıcı tarafından uyarılmış nöronal yanıtları ölçmek için böcekler kullanılmaktadır. Ancak, elektrofizyoloji hücre tipi, boyutu ve konumuna bağlı olarak teknik olarak zor olabilir, tek bir tat Sensillum gelen özel ekipman ve elde ölçümleri gerektirir. Buna ek olarak, Drosophila tek nöron çözünürlüğü tat Sensilla hou beri elde etmek zor olabilirkimyasal duyu nöron se birden fazla türü. Burada anlatılan canlı kalsiyum görüntüleme yöntemi canlı sinekler tek tat nöronların yanıtları ölçülecek sağlar. Bu yöntem, su bazlı çözücüler içinde düşük çözünürlüğe sahip, lipid feromonlar ve diğer ligand türlerine nöronal yanıtları görüntüleme için özellikle uygundur.

GCaMP kalsiyum göstergesi genetik Gr68a-Gal4 veya ppk23-Gal4 sürücüleri kullanarak ifade edildi. Kol nöronlar ve nöral olmayan destek hücrelerinin ayrı nüfus her sürücü (Şekil 3A-C) tarafından sınıflandırılmıştır. Lipofilik feromon CH503 ligand spesifik yanıtlar Gr68a-Gal4 gözlendi ve ppk23-Gal4 hücreleri GCaMP (Şekil 3D) ifade. Görece GCaMP5G sinyali (kadar taşınmış / F) flüoresan yoğunluğundaki değişim ve ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm<em&gt; Drosophila</em&gt; Canlı Kalsiyum Görüntüleme kullanma Lipit Feromonlar Sensory Nöronlar

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K Görüntüleme.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

Video: Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Kalsiyum Göstergeleri ile yükleme Drosophila Sinir Terminalleri

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Biyoloji

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Koku-uyarılmış Cevaplarının Kalsiyum Görüntüleme Drosophila Antennal Lob

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Nörobilim

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Drosophila melanogaster Öğrenme Kaynaklı Sinaptik Plastisite Vivo Optik Kalsiyum Görüntüleme

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo (İn canlı) Erişkin Drosophila'da Tat Kaynaklı Nöral Yanıtların Kalsiyum Görüntülemesi

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

In vivo (İn canlı) Drosophila melanogaster'de Sinaptik Lokalize Kalsiyum Sensörleri Kullanılarak Kalsiyum Görüntüleme

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

Drosophila In Vivo Kalsiyum Görüntüleme: Nöronal Aktivitenin Fonksiyonel Görüntülenmesi İçin Bir Yöntem

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
...

Drosophila melanogaster (meyve sineği)

Yetişkin

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

Source: Shankar, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53392">Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Drosophila'da Duyusal Nöronlardan Gelen Fizyolojik Tepkilerin Saptanması

1. Sample Preparation

	Cross the Gal4 driver line to UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster flies (w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Allow the cross to grow ...

Fizyolojik Yanıtları Ölçüm

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler