Name: measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

1. Preparación de muestras <ol><li> Cruzar la línea Gal4 3,22 controlador de UAS-GCaMP5G 19 moscas (1118 w; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Deje que la cruz de crecer a 25 ° C. Nota: Generación vuela con múltiples copias de los transgenes o Gal4 UAS-GCaMP puede ayudar a aumentar la intensidad de la señal fluorescente. Una versión anterior del transgén UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostró intensidad de fluorescencia muy débil cuando se expresa bajo el control del controlador de Gr68a-Gal4. <ol><li> Recoger y separada por sexo recién eclosed moscas adultas y elevar a 25 ° C. Nota: El nivel básico de GCaMP5G florescencia es óptima en las moscas de edades comprendidas entre los 14-28 días. El aislamiento de las moscas por sexo se opone a la posibilidad de interacciones sociales que pueden influir en las respuestas neuronales. </li></ol></li><li> Anestesiar a una mosca en una corriente suave de CO 2. </li><li> Una el fLy a un cubreobjetos de vidrio colocando primero una pequeña gota de esmalte de uñas en el centro de un 0,17 mm cubreobjetos. Con cuidado, coloque una mosca en su lado de la gota de esmalte de uñas transparente y asegurar que toda la gota está cubierto por la mosca. </li><li> Realice los pasos 1.5 y 1.6 bajo un microscopio estereoscópico de disección, que se utiliza con una ampliación de 8X. </li><li> Utilice una brocha húmeda para extender una pata delantera de la mosca. Asegure la pata delantera en su posición mediante la colocación de dos finas tiras de cinta adhesiva sobre la primera y quinta segmentos tarsales (Figura 2A). Esto expondrá segmentos tarsales T2-T4 para formación de imágenes (Figura 2B). </li><li> Para neuronas imagen de la trompa, coloque una tira delgada de cinta adhesiva sobre la tribuna de la trompa para exponer el labelo (Figura 2 C, D). </li><li> Dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la mosca con un bolígrafo PAP para evitar que la solución fluya sobre la superficie del cubreobjetos. Hacer mediciones dentro de los 30 minutos de montaje. </li></ol> 2. Preparación de EstímuloSolución <ol><li> Diluir ligandos lipófilos (como CH503, utilizado en este estudio) en una solución PBST: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4. <ol><li> Hacer una solución madre de 1 mg / ml del ligando usando PBST. Preparar todas las diluciones posteriores de la solución madre usando PBST. Nota: Dependiendo de la solubilidad del ligando de interés, pueden ser necesarias diferentes disolventes para disolver el ligando. La solubilidad de CH503 en diversos disolventes se describe en la Tabla 1. A diferencia de otros disolventes, PBST no produjo un aumento en la fluorescencia. </li></ol></li></ol> 3. La estimulación de las neuronas y gustativa Adquisición de imágenes <ol><li> Usando una pipeta de 10 l, colocar 10 l de PBST en los segmentos tarsales. Nota: Este paso humedece la pierna y evita que los segmentos tarsales a la deriva. </li><li> Utilice un sistema óptico que tiene una cámara de suficiente velocidad y sensibilidad para lograr una buena señal de fluorescencia a alta resolución en el tiempo. NOTA: Para este estudio se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio y una cámara sCMOS (ver Lista de Materiales). </li><li> Elija el segmento tarsal específico y neuronas para formar una imagen. Adquirir tres pre-estimulación confocal Z-pilas. <ol><li> Idealmente, los ajustes de adquisición de uso que son lo suficientemente rápido como para permitir la resolución tiempo máximo sin dejar de reflejar la totalidad del volumen celular. Ejemplo ajustes de adquisición son los siguientes: 200 mseg exposición, binning 2 x 2 y 6 x 0,5 m 2 secciones ópticas, capturados cada 2 s. Nota: las piernas inmovilizadas han sido fotografiadas con éxito durante un máximo de 10 minutos, a intervalos de 30 seg, sin blanqueo discernible de la señal GCaMP. Para tiempos de grabación más largos, asegúrese de que las piernas se mantienen firmemente en su lugar en el cubreobjetos. </li><li> Optimizar la potencia del láser para la más alta relación señal-ruido alcanzable con photobleaching mínima durante toda la imabio de régimen. Para los experimentos descritos aquí, utilizar un diodo de láser 491 nm (100 mW) a la transmisión de 30% para obtener imágenes de las neuronas Gr68a y gustativas ppk23 en las piernas y proboscis. Utilice 2 x 2 binning para permitir tiempos de exposición más cortos sin dejar de lograr la suficiente resolución espacial. Nota: Los ajustes de potencia láser fueron optimizados para permitir la detección del cambio de fluorescencia que van desde un aumento de 1.2 a 4.5 veces. </li></ol></li><li> Pipetear 10 l de la solución de estímulo en el segmentos tarsales. Para los experimentos de control, añadir otros 10 l de PBST. Inmediatamente adquirir 117 imágenes post-estimulación. Nota: El número de imágenes post-estimulación adquiridos se basa en la cantidad de tiempo en el que se alcanzó el máximo cambio en la fluorescencia (aproximadamente 2 min). <ol><li> Paso crítico: Mientras que la solución pipeteando en la preparación, no tocar la marcha con la punta de la pipeta ya que esto hará que la extremidad un movimiento fuera de posición. Nota: Como alternativa, utiliceun micromanipulador para posicionar con precisión un capilar de vidrio que contiene estímulo cerca del segmento tarsal a explorar. Entregar volúmenes controlados de estímulo usando un dispensador de microinyección intracelular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 4. Procesamiento y Análisis de Imágenes: Cuantificación de la respuesta <ol><li> Abrir una serie de confocal Z-pilas utilizando Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 o ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) análisis y procesamiento de imágenes de software 24. </li><li> Hacer una proyección suma de intensidad de todos los seis rebanadas Z para cada uno de los 120 puntos de tiempo. <ol><li> Seleccionar la opción &quot;Pila&quot; en &quot;Imagen&quot;. Además, seleccione la opción &quot;proyección Z&quot; e introduzca &quot;1&quot; como el segmento de inicio y &quot;4&quot; como rebanada de parada. Para el tipo de proyección, seleccione R20; suma rebanadas &quot;en el menú desplegable y seleccione&quot; Todos los marcos de tiempo &quot;. </li></ol></li><li> Definir la región de interés (ROI) mediante el uso de la herramienta de selección a mano alzada para dibujar un límite alrededor de un cuerpo celular neuronal o proyección. Haga clic en la etiqueta &quot;Analizar&quot; y seleccione la opción &quot;Administrador de retorno de la inversión&quot; en &quot;Herramientas&quot;. </li><li> Cuantificar la fluorescencia del retorno de la inversión mediante la selección de la opción &quot;Establecer mediciones&quot;, en el menú &quot;Analizar&quot; y marcando las casillas para la densidad integrada, área, media y máxima y valor de gris etiqueta. A continuación, seleccione la opción &quot;Más&quot; en el menú de gestor de retorno de la inversión, y además seleccionar la opción &quot;Multi medida&quot;. Nota: Esto generará un cuadro emergente con valores para cada uno de los parámetros seleccionados. </li><li> Compruebe los valores máximos de grises para asegurar que ninguno de los píxeles han alcanzado la saturación (por ejemplo, 65 535 para una cámara de 16 bits). NOTA: Para los experimentos se muestra en tsus papel, las respuestas se midieron ya sea desde los cuerpos celulares neuronales o proyecciones, dependiendo de donde se observó el aumento máximo en Delta F / F. </li><li> Calcular el cambio relativo máximo en la fluorescencia (Delta F / F) en el punto de tiempo t es el siguiente: <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Restar el fondo de fluorescencia de cada valor F (celular). Para cuantificar la fluorescencia de fondo, medir la densidad integrada de una ROI de tamaño y la forma equivalente de una superficie de la pata delantera (o proboscis) desprovista de neuronas detectables. </li><li> Para cuantificar la fluorescencia después de la estimulación, F (celular) t, medir la densidad integrada del retorno de la inversión del cuerpo celular o proceso en el punto de tiempo &quot;t&quot; después de la estimulación. </li><li> Para cuantificar la fluorescencia pre-estimulación, F (celular) t = 0, analizar las imágenes pre-estímulo del cuerpo de la célula o proceso de la misma manera comola señal post-estimulación. Utilice la densidad integrada media de 3 imágenes para determinar F (celular) t = 0. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that there are no competing financial interests.

Se describe aquí un método para realizar las imágenes en vivo de calcio de las neuronas periféricas de Drosophila en 2 órganos sensoriales diferentes. El Ca2 + -evoked respuestas fluorescentes GCaMP en Gr68a-neuronas inducidos por el ligando feromona CH503 eran dependientes de la dosis y cuantitativa. También era posible discernir diferentes patrones de respuesta neural tales como fásica y respuestas tónicas. Se cree que las neuronas que muestran respuestas fásic...

Los animales dependen de la información olfativa y gustativa para mediar en las decisiones esenciales para la supervivencia y la reproducción. La comprensión de cómo las señales chemosensory se detectan y procesan por el sistema nervioso requiere la identificación del receptor (s) sensorial y los correspondientes ligandos químicos. Drosophila detectar una asombrosa variedad de compuestos volátiles y no volátiles y son un excelente modelo en el que estudiar la fisiológico mecanismos que subyacen chemosensation. Mientras que los órganos olfativos perciben moléculas volátiles, los órganos gustativos están especializados para detectar compuestos de baja volatilidad. A continuación, presentamos un método para medir directamente las respuestas neuronales a partir de los órganos del gusto de Drosophila melanogaster a baja volatilidad, los ligandos lipofílicos. órganos gustativos de la marcha incluyen las patas delanteras, trompa, y las alas. Distribuida en la superficie de los órganos del gusto son estructuras similares a pelos conocidos como sensilla que responden a sugars, amargos, sales, agua y feromonas 8. El sensilla han sido clasificadas morfológicamente en cerdas de sabor y gusto clavijas 9. Hay alrededor de 31 cerdas gustativas en el labelo, que se clasifican en el (tipo L) de largo, corto (de tipo s) y morfologías intermedias (de tipo I). Sensilla casa 4 neuronas sensoriales de los &#39;l&#39; y &#39;s&#39; que responden fisiológicamente al azúcar (la celda S), bajas en sal (la celda L1), alto contenido de sal y compuestos amargos (la celda L2) y agua (la célula W) 10 , 11. La &quot;i&quot; casa 2 neuronas sensoriales sensilla, uno de los cuales responde tanto a baja en sal y azúcar, mientras que el otro responde a alta concentración de sal 12. Hay aproximadamente 41 sensilla gusto en los hombres y 26 en las mujeres sensilla distribuidos en cada una de las patas delanteras. Por tanto machos como hembras, hay 21 sensilla en el midleg, y alrededor del 22 sensilla en la pata trasera 13. Las neuronas gustativas cerrados por la sensilla gusto en las piernas también son classified en tipos L1, L2, W y S. Un método estándar para medir la actividad eléctrica de las neuronas individuales utiliza electrodos extracelulares o intracelulares para grabar el flujo de iones. Mediciones de electrodos permiten la función neuronal que se estudiará en organismos modelo tales como especies de Drosophila, polillas y abejas que carecen de amplias herramientas genéticas para el etiquetado de los nervios. Sin embargo, mientras que los métodos electrofisiológicos se han utilizado habitualmente para medir la actividad de Drosophila sabor sensilla 4,13,14, la aplicación de este enfoque presenta varios retos técnicos. En primer lugar, el sabor cerdas deben ser identificados en base a la morfología y ubicación espacial. Tras la identificación, las mediciones electrofisiológicas pueden verse limitadas por el pequeño tamaño de la sensilla, con acceso limitado debido a la posición, y la dificultad en la aplicación de volúmenes controlados de un estímulo químico de una muestra de cerdas. Además, la estimulación de sensilla puede generar señales de más de unaneuronal de tipo 15. En segundo lugar, la detección de señales eléctricas puede ser confundida por el ruido de fondo resultante de las vibraciones mecánicas y el ruido de los equipos electrónicos. En tercer lugar, el uso de un electrodo de afilado puede dañar la preparación mosca, si se usa incorrectamente 14. Por último, el montaje de una plataforma de electrofisiología requiere componentes electrónicos especializados para la entrega de estímulos, la grabación de la señal, y el análisis de datos y puede ser costoso. En D. melanogaster, la disponibilidad de herramientas codificados genéticamente ha facilitado el desarrollo de técnicas de imagen que permiten estudiar las respuestas de pequeñas poblaciones de neuronas. Uno de estos métodos es el uso del reportero Calexa 16. En este método, las secuencias de genes que codifican el factor de transcripción LexA-VP16 y una sensible al calcio NFAT proteínas se fusionan juntos. la activación de calcio de la fosfatasa calcineurina cataliza la fosforilación de de-NFAT y, a su vez, faciTES su importación en el núcleo. Dentro del núcleo, el dominio LexA se une a un motivo de unión LexAop-DNA que dirige la expresión de un reportero de la proteína fluorescente verde (GFP), permitiendo así la identificación sostenida de las neuronas funcionalmente activados. El enfoque ha sido utilizado con éxito para medir la respuesta de los glomérulos olfativo específico en el lóbulo antenal después de la exposición de las moscas en vivo a un odorante 16. Recientemente, las respuestas fisiológicas de los receptores gustativos IR52c neuronas se miden a partir de moscas vivas utilizando Calexa 7. Sin embargo, para este estudio, fue necesario moscas de edad para un máximo de 6 semanas para mejorar la transcripción de GFP. Mientras inmunotinción con un anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la señal Calexa, este método requeriría la fijación del tejido, impidiendo así la posibilidad de formación de imágenes de células vivas. El calcio GCaMP proteína indicador codificado genéticamente también se ha utilizado ampliamente para estudiar las respuestas neuronales en un número de17 especies. El GCaMP proteína fluorescente de baja intensidad antes de la estimulación neuronal. La aplicación de un estímulo desencadena un potencial de acción en la neurona, resultando en la afluencia de Ca2 +. GCaMP, unido a Ca 2 +, sufre un cambio conformacional, haciendo que se fluorescencia con una intensidad más brillante (Figura 1). Se utilizó un enfoque de imágenes de calcio de una sola neurona recientemente desarrollado para identificar la glucosa como el ligando para las neuronas gustativas Gr61a específicos pata delantera 18. En este estudio, las patas delanteras disecados de Drosophila transgénica que expresa GCaMP en las neuronas gustativas Gr61a se cubrieron con una capa de agarosa antes de la imagen. Sin embargo, el uso de tejido diseccionado puede causar eventual resumen de expresión GCaMP, limitando así el tiempo de medición y la sensibilidad de detección. Además, puede limitar la sensibilidad de agarosa debido a los altos niveles de fondo de fluorescencia y sus propiedades de dispersión de la luz. To tratar algunos de estos inconvenientes, se describe el uso de imágenes de calcio mediada por GCaMP para registrar las respuestas fisiológicas de la pata delantera y el trompa neuronas gustativas de los animales intactos. Mostramos las respuestas fisiológicas de Gr68a y neuronas que expresan ppk23 codificado genéticamente GCaMP5G 19 a una feromona de lípidos Drosophila, (3 R, 11 Z, 19 Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. Las respuestas neuronales se miden mediante la cuantificación del aumento de la fluorescencia de la señal GCaMP5G durante la estimulación de feromonas. En este protocolo, las neuronas se crean imágenes para una duración total de 120 seg, que es suficiente para diferenciar los patrones de activación neuronal en células individuales.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

A diferencia de los mamíferos, insectos, tales como Drosophila tienen múltiples órganos del gusto. Las neuronas quimiosensriales en las piernas, trompa, las alas y ovipositor de Drosophila expresan receptores gustativos 1,2 canales iónicos, 3-6, y los receptores ionotrópicos 7 que están involucrados en la detección de señales sensoriales volátiles y no volátiles. Estas neuronas en contacto directamente con estimulantes del gusto tales como alimentos, sustancias nocivas y las feromonas y por lo tanto influyen muchos comportamientos complejos tales como la alimentación, la puesta de huevos y el apareamiento. grabaciones de electrodos y de imágenes de calcio se han usado ampliamente en los insectos para cuantificar las respuestas neuronales evocadas por estos estimulantes del gusto. Sin embargo, la electrofisiología requiere un equipo especializado y las mediciones de obtener de una sola sensillum sabor puede ser técnicamente difícil dependiendo del tipo de células, tamaño y posición. Además, la resolución de la neurona individual en Drosophila puede ser difícil de lograr ya que Hou sabor sensillase más de un tipo de neurona quimiosensorial. El método de formación de imágenes en vivo de calcio descrito aquí permite respuestas de las neuronas gustativas individuales en moscas vivas que han de medirse. Este método es especialmente adecuado para obtener imágenes de las respuestas neuronales a las feromonas de lípidos y otros tipos de ligandos que tienen baja solubilidad en disolventes a base de agua.

El indicador de calcio GCaMP se expresó genéticamente utilizando conductores ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 o. Poblaciones distintas de neuronas pata delantera y células de apoyo no neuronales son etiquetados por cada conductor (Figura 3A-C). Se observaron respuestas-ligando específico a la feromona CH503 lipofílica en Gr68a-Gal4 y las células que expresan Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). El cambio relativo en la intensidad de fluorescencia de la señal GCa...

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Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

La medición de las respuestas fisiológicas de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales a los lípidos feromonas Uso de Imagen de calcio en Vivo

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K vistas.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

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Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Investigación

Biología

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neurociencias

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imágenes de calcio de las respuestas neuronales inducidas por el gusto en Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
...

Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)

Adulto

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

Source: Shankar, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53392">Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Detección de respuestas fisiológicas de neuronas sensoriales en Drosophila

1. Sample Preparation

	Cross the Gal4 driver line to UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster flies (w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Allow the cross to grow ...

La medición de las respuestas fisiológicas de

Resumen

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Capítulos en este video

Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

El calcio de la imagen del olor de respuestas evocadas en el Drosophila Lóbulo antenal

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

In vivo Imágenes de calcio de las respuestas neuronales inducidas por el gusto en Drosophila adulta

in vivo Imágenes de calcio utilizando sensores de calcio localizados sinápticamente en Drosophila melanogaster

Drosophila in vivo Imágenes de calcio: un método para obtener imágenes funcionales de la actividad neuronal

Detección de respuestas fisiológicas de neuronas sensoriales en Drosophila