Name: measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging
Uploaded: 2016-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging at JoVE.com

This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).

Preparazione 1. Esempio <ol><li> Attraversare la linea GAL4 3,22 conducente di UAS-GCaMP5G 19 mosche (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Lasciare che la croce di crescere a 25 ° C. Nota: Generazione vola con più copie dei transgeni GAL4 o UAS-GCaMP può aiutare a migliorare l&#39;intensità del segnale fluorescente. Una versione precedente del transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) ha mostrato intensità di fluorescenza molto debole quando espresso sotto il controllo del pilota Gr68a-GAL4. <ol><li> Raccogliere e separati per sesso nuova eclosed mosche adulte ed aumentare a 25 ° C. Nota: il livello di base di GCaMP5G fluorescenza è ottimale in mosche di età compresa tra 14-28 giorni. Isolando le mosche per sesso preclude la possibilità di interazioni sociali che possono influenzare le risposte neurali. </li></ol></li><li> Anestetizzare una mosca sotto un flusso delicato di CO 2. </li><li> Fissare la Fmente ad un vetrino di vetro in primo luogo mettendo una piccola goccia di smalto al centro di un vetrino 0,17 millimetri. Delicatamente posizionare una mosca su un fianco sulla goccia di smalto trasparente e garantire che l&#39;intera goccia è coperto dalla mosca. </li><li> Eseguire i punti 1.5 e 1.6 sotto uno stereomicroscopio dissezione, utilizzato a 8X ingrandimento. </li><li> Utilizzare un pennello bagnato per estendere una zampa anteriore della mosca. Fissare la zampa anteriore in posizione posizionando due sottili strisce di nastro sopra primo e quinto segmenti tarso (Figura 2A). Questo esporrà segmenti tarsali T2-T4 per l&#39;imaging (Figura 2B). </li><li> Per neuroni immagine sulla proboscide, posizionare una sottile striscia di nastro adesivo sopra la tribuna della proboscide per esporre il labello (Figura 2C, D). </li><li> Disegnare una barriera idrofobica intorno al volo con una penna PAP per evitare che la soluzione di fluire sulla superficie coprioggetto. Effettuare misure entro 30 minuti di montaggio. </li></ol> 2. Preparazione di stimoloSoluzione <ol><li> Diluire ligandi lipofile (come CH503, utilizzato in questo studio) in una soluzione PBST: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 0,1% Triton X-100 (v / v ); pH 7.4. <ol><li> Fare un 1 mg / ml soluzione madre del legante con PBST. Preparare tutte le diluizioni successive della soluzione madre con PBST. Nota: A seconda della solubilità del ligando di interesse, solventi diversi possono essere necessari per sciogliere il ligando. La solubilità di CH503 in vari solventi sono descritte nella Tabella 1. A differenza di altri solventi, PBST non ha prodotto un aumento della fluorescenza. </li></ol></li></ol> 3. Stimolazione della Gustativo neuroni e Image Acquisition <ol><li> Utilizzando una pipetta 10 ml, versare 10 ml di PBST sui segmenti del tarso. Nota: Questo passaggio inumidisce la gamba ed evita i segmenti del tarso da deriva. </li><li> Utilizzare un sistema ottico che ha una fotocamera suvelocità sere sufficienti e la sensibilità per ottenere un buon segnale di fluorescenza ad alta risoluzione temporale. Nota: Per questo studio abbiamo utilizzato un microscopio confocale disco rotante e una fotocamera sCMOS (vedi Lista dei materiali). </li><li> Scegliere il segmento tarsale specifico e neuroni di essere ripreso. Acquisire tre pre-stimolazione confocale Z-stack. <ol><li> Idealmente, le impostazioni di acquisizione uso che sono abbastanza veloce per consentire la risoluzione tempo massimo, mentre ancora catturare l&#39;intero volume delle cellule. Impostazioni di acquisizione esempio sono: 200 msec esposizione, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 micron 2 sezioni ottiche, catturate ogni 2 secondi. Nota: le gambe sono stati immobilizzati ripreso con successo per un massimo di 10 minuti, a intervalli di 30 secondi, con nessun imbianchimento discernibile del segnale GCaMP. Per i tempi di registrazione più lunghi, in modo che le gambe sono tenute molto saldamente in posizione sul vetrino. </li><li> Ottimizzare la potenza del laser per la massima segnale-rumore ottenibile con il minimo photobleaching durante l&#39;intero imaging regime. Per gli esperimenti descritti qui, utilizzare un 491 nm diodo laser (100 mW) al cambio del 30% per l&#39;imaging sia i neuroni Gr68a e ppk23 gustative sulle gambe e proboscide. Utilizzare 2 x 2 binning per consentire tempi di esposizione più brevi, pur ottenendo una risoluzione spaziale sufficiente. Nota: Le impostazioni di potenza laser sono stati ottimizzati per consentire il rilevamento di cambiamento fluorescente che vanno da un aumento 1.2- a 4,5 volte. </li></ol></li><li> Pipettare 10 ml di soluzione di stimolo sul segmenti del tarso. Per gli esperimenti di controllo, aggiungere altri 10 ml di PBST. acquisire subito 117 immagini post-stimolazione. Nota: Il numero di immagini post-stimolazione acquisiti si basa sulla quantità di tempo in cui si è raggiunto variazione massima della fluorescenza (circa 2 min). <ol><li> PUNTO CRITICO: Mentre pipettando soluzione sulla preparazione, non toccare il volo con la punta della pipetta dal momento che questo farà sì che la zampa anteriore per spostare fuori posizione. Nota: In alternativa, utilizzareun micromanipolatore per posizionare con precisione un capillare di vetro contenente stimolo vicino al segmento tarsale da acquisire. Fornire volumi controllati di stimolo utilizzando un distributore microiniezione intracellulare secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li></ol> 4. Image Processing and Analysis: quantificazione della risposta <ol><li> Aprire una serie di confocale Z-stack con Fiji ( <a href="http://fiji.sc/Fiji" target="_blank">http://fiji.sc/Fiji</a> ) 23 o ImageJ ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij/" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij/</a> software) analisi ed elaborazione di immagini 24. </li><li> Effettuare una proiezione somma intensità di tutti i sei fette Z per ciascuno dei 120 punti temporali. <ol><li> Selezionare l&#39;opzione &quot;stack&quot; sotto &quot;Immagine&quot;. Inoltre, selezionare l&#39;opzione &quot;proiezione Z&quot; e inserire &quot;1&quot; come la fetta di inizio e &quot;4&quot; come fetta di arresto. Per il tipo di proiezione, selezionare R20; fette somma &quot;dal menu a tendina e selezionare&quot; Tutte le strutture di tempo &quot;. </li></ol></li><li> Definire la regione di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione a mano libera per disegnare un confine intorno a un corpo cellulare o una proiezione neuronale. Fare clic sull&#39;etichetta &quot;Analizza&quot; e selezionare l&#39;opzione &quot;ROI manager&quot; sotto &quot;Strumenti&quot;. </li><li> Quantificare la fluorescenza della ROI selezionando l&#39;opzione &quot;Set misurazioni&quot;, sotto il menu &quot;Analizza&quot; e selezionando le caselle per la densità integrata, zona, media e massima valore di grigio e l&#39;etichetta. Quindi, selezionare l&#39;opzione &quot;Altro&quot; sotto il menu Gestione ROI e selezionare ulteriormente l&#39;opzione &quot;Multi misura&quot;. Nota: Questo genererà una scatola a finestra con valori per ciascuno dei parametri selezionati. </li><li> Controllare i valori massimi di grigio per assicurare che nessuno dei pixel hanno raggiunto la saturazione (ad esempio, 65.535 per una camera 16-bit). NOTA: Per gli esperimenti mostrato in tsuoi carta, le risposte sono state misurate sia da corpi cellulari neuronali o sporgenze, a seconda di dove è stato osservato l&#39;aumento massimo della Af / F. </li><li> Calcolare la variazione relativa massima della fluorescenza (Af / F) al punto di tempo t è il seguente: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/53392/53392eq1.jpg" /><ol><li> Sottrarre sfondo di fluorescenza da ogni valore F (cella). Per quantificare fluorescenza di fondo, misurare la densità integrata di una ROI di forma e dimensioni equivalenti da un&#39;area dell&#39;arto anteriore (o proboscide) privo di neuroni rilevabili. </li><li> Per quantificare la post-stimolazione di fluorescenza, F (cella) t, misurare la densità integrata della ROI del corpo cellulare o di processo nel tempo punto &quot;t&quot; dopo la stimolazione. </li><li> Per quantificare la fluorescenza pre-stimolazione, F (cella) t = 0, analizzare immagini pre-stimolo del corpo cellulare o il processo nello stesso modo comeil segnale post-stimolazione. Utilizzare la densità media integrato di 3 immagini per determinare F (cella) t = 0. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that there are no competing financial interests.

Descriviamo qui un metodo per eseguire l&#39;imaging del calcio live di Drosophila neuroni periferici in 2 diversi organi sensoriali. Il Ca 2+ -evoked risposte fluorescenti GCaMP in Gr68a-neuroni indotte dal ligando feromone CH503 erano dose-dipendente e quantitativa. E &#39;stato anche possibile distinguere diversi modelli di risposta neurale come la fasica e le risposte tonico. I neuroni che mostrano le risposte fasiche si ritiene di consentire un rapido adattamento agl...

Gli animali si basano su informazioni olfattive e gustative di mediare decisioni essenziali per la sopravvivenza e la riproduzione. Capire come spunti chemosensory vengono rilevati ed elaborati dal sistema nervoso richiede l&#39;identificazione del recettore sensoriale (s) e le corrispondenti leganti chimici. Drosophila rilevare una varietà impressionante di composti volatili e non volatili e sono un modello eccellente in cui studiare il fisiologico meccanismi sottostanti chemosensation. Mentre gli organi olfattivi percepiscono molecole volatili, gli organi gustativi sono specializzati per rilevare i composti a bassa volatilità. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare direttamente le risposte neuronali dagli organi del gusto di Drosophila melanogaster a bassa volatilità, ligandi lipofile. organi gustativi della mosca sono le zampe anteriori, proboscide, e le ali. Distribuita sulla superficie degli organi gustative sono strutture simili a capelli noti come sensilla che rispondono al sugars, amari, sali, acqua e feromoni 8. Il sensilla sono stati classificati morfologicamente in setole di gusto e sapore pioli 9. Ci sono circa 31 setole gusto sul labello che sono classificati in lungo (tipo L), breve (s-type) e morfologie (I-tipo) intermedi. Casa sensilla 4 neuroni sensoriali &#39;L&#39; e &#39;S&#39; che rispondono fisiologicamente allo zucchero (la cella S), basso contenuto di sale (la cella L1), di sale e composti amari (la cella L2) e l&#39;acqua (la cellula W) 10 , 11. La &#39;i&#39; Casa 2 neuroni sensoriali sensilli, di cui uno risponde sia a basso contenuto di sale e zucchero, mentre l&#39;altro risponde ad alto sale 12. Ci sono circa 41 gusto sensilli nei maschi e 26 femmine sensilla in distribuite su ciascuno degli arti anteriori. Per entrambi i maschi e femmine, ci sono 21 sensilla sul midleg, e circa il 22 sensilla sul hindleg 13. I neuroni gustative racchiuse dalla sensilla gusto sulle gambe sono anche classified in tipi L1, L2, W e S. Un metodo standard per misurare l&#39;attività elettrica da singoli neuroni utilizza elettrodi extracellulari o intracellulari per registrare il flusso di ioni. Misure elettrodi permettono la funzione neuronale di essere studiato in organismi non modello, come specie Drosophila, falene, api e che mancano ampi strumenti genetici per l&#39;etichettatura neurale. Tuttavia, mentre i metodi elettrofisiologici sono stati utilizzati di routine per misurare l&#39;attività di Drosophila gusto sensilli 4,13,14, l&#39;applicazione di questo approccio presenta diverse sfide tecniche. In primo luogo, il gusto setole devono essere identificati sulla base di morfologia e posizione spaziale. Dopo l&#39;identificazione, misurazioni elettrofisiologiche possono essere ostacolate dalle piccole dimensioni del sensilli, accessibilità limitata a causa della posizione, e difficoltà nell&#39;applicare volumi controllati di uno stimolo chimico per un gusto setola. Inoltre, la stimolazione di sensilli può generare segnali da più di untipo neuronale 15. In secondo luogo, l&#39;individuazione di segnali elettrici può essere confuso con il rumore di fondo derivanti da vibrazioni meccaniche e rumori provenienti da apparecchiature elettroniche. In terzo luogo, l&#39;uso di un elettrodo affilata può danneggiare la preparazione mosca, se usato in modo errato 14. Infine, montaggio di un impianto di perforazione elettrofisiologia richiede componenti elettronici specializzati per la consegna stimolo, la registrazione del segnale e analisi dei dati e può essere costoso. In D. melanogaster, la disponibilità di strumenti geneticamente codificati ha facilitato lo sviluppo di tecniche di imaging che consentono le risposte di piccole popolazioni di neuroni da studiare. Un tale approccio è l&#39;uso del reporter CaLexA 16. In questo metodo, sequenze di geni codificanti il ​​fattore di trascrizione LexA-VP16 e NFAT proteina sensibile calcio sono fusi insieme. Attivazione di calcio della calcineurina proteina fosfatasi catalizza la de-fosforilazione di NFAT e, a sua volta, facilitaTES sua importazione nel nucleo. All&#39;interno del nucleo, il dominio LexA lega a un motivo di legame LexAop-DNA che dirige l&#39;espressione di una verde giornalista proteina fluorescente (GFP), permettendo così l&#39;identificazione sostenuta di neuroni funzionalmente attivati. L&#39;approccio è stato utilizzato con successo per misurare la risposta della specifica glomeruli olfattivi nel lobo antenne in seguito all&#39;esposizione di mosche dal vivo ad un odorizzante 16. Recentemente, le risposte fisiologiche di IR52c neuroni recettori gustativi sono stati misurati dalle mosche dal vivo utilizzando CaLexA 7. Tuttavia, per questo studio, è stato necessario mosche di età fino a 6 settimane per migliorare la trascrizione GFP. Mentre immunocolorazione con un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato per amplificare il segnale CaLexA, questo metodo richiederebbe fissaggio del tessuto, precludendo così la possibilità per l&#39;imaging live-cell. Il GCaMP indicatore di proteine ​​calcio geneticamente codificato è anche stato ampiamente utilizzato per studiare le risposte neuronali in diversiSpecie 17. Il GCaMP proteina fluorescente con bassa intensità prima di stimolazione neuronale. L&#39;applicazione di uno stimolo innesca un potenziale d&#39;azione nel neurone, conseguente afflusso di Ca 2+. GCaMP, legato a Ca 2+, subisce un cambiamento conformazionale, provocando la fluorescenza con intensità luminosa (Figura 1). Un approccio di imaging del calcio singolo neurone sviluppato di recente è stato utilizzato per identificare il glucosio come legante per gli specifici neuroni gustative Gr61a zampa anteriore 18. In questo studio, gli arti anteriori sezionati da transgenici Drosophila che esprimono GCaMP nei neuroni gustative Gr61a erano coperti da uno strato di agarosio prima di imaging. Tuttavia, l&#39;uso di tessuto sezionato può causare eventuale carrellata di espressione GCaMP, limitando così il tempo di misura e la sensibilità di rilevazione. Inoltre, agarosio può limitare la sensibilità a causa di alti livelli di fondo di fluorescenza e le sue proprietà di diffusione della luce. To affrontare alcuni di questi inconvenienti, si descrive l&#39;utilizzo di immagini di calcio GCaMP-mediata per registrare le risposte fisiologiche di zampa anteriore e proboscide neuroni gustative di animali intatti. Noi mostriamo le risposte fisiologiche di Gr68a e neuroni che esprimono ppk23 geneticamente codificato GCaMP5G 19 per un lipide feromone Drosophila, (3 R, 11 Z, Z 19) -3-acetossi-11,19-octacosadien-1-olo (CH503) 20, 21. risposte neuronali sono misurati quantificando l&#39;aumento della fluorescenza del segnale GCaMP5G durante la stimolazione feromone. In questo protocollo, i neuroni vengono esposte per una durata totale di 120 secondi, che è sufficiente a differenziare pattern di attivazione neuronale in singole cellule.

<table><tbody><tr><td>Gr68a-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from H. Amrein (Texas A&amp;amp;M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA)</td></tr><tr><td>ppk23-Gal4</td><td></td><td></td><td>Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA)</td></tr><tr><td>UAS-GCaMP5&amp;nbsp;</td><td></td><td>42037</td><td>Bloomington Drosophila&amp;nbsp; Stock Center</td></tr><tr><td>0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip)</td><td>Electron Microscopy Services</td><td>63790-10</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish, &quot;Hard as Nails Clear&quot;&amp;nbsp;</td><td>Sally Hansen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Paint brush</td><td></td><td></td><td>fine-tipped brush</td></tr><tr><td>Tape&amp;nbsp;</td><td>Scotch brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>13021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, lab grade</td><td>Merck</td><td>10094</td><td></td></tr><tr><td>Hexane, HPLC grade</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H303SK-4</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>Recipe described in the protocol section</td></tr><tr><td>CH&lt;sub&gt;5&lt;/sub&gt;0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>Synthesis described in Mori &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2010</td></tr><tr><td>sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)</td><td>Hamamatsu&amp;nbsp;</td><td>C11578-22U</td><td></td></tr><tr><td>Microscope (Ti-Eclipse)</td><td>Nikon</td><td>Ni-E</td><td></td></tr><tr><td>Spinning Disk Scan head&amp;nbsp;</td><td>Yokogawa</td><td>CSU-X1-A1</td><td></td></tr><tr><td>Aquistion Software (MetaMorph Premier)</td><td>Molecular Devices</td><td>40002</td><td></td></tr><tr><td>Fiji software</td><td>open source</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/Fiji&quot;&gt;http://fiji.sc/Fiji&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

measuring physiological responses of drosophila sensory neurons to lipid pheromones using live calcium imaging

A differenza dei mammiferi, insetti come Drosophila hanno più organi del gusto. I neuroni chemosensoriali sulle gambe, proboscide, ali e ovipositor di Drosophila esprimono recettori gustativi 1,2, canali ionici 3-6, e recettori ionotropici 7 che sono coinvolti nella rilevazione di segnali sensoriali volatili e non volatili. Questi neuroni contattare direttamente tastants come il cibo, sostanze e feromoni influenzano nocivi e quindi molti comportamenti complessi come l&#39;alimentazione, la deposizione delle uova e l&#39;accoppiamento. registrazioni elettrodi e l&#39;imaging di calcio sono stati ampiamente utilizzati negli insetti per quantificare le risposte neuronali evocati da queste sostanze sapide. Tuttavia, elettrofisiologia richiede attrezzature specializzate e le misurazioni ottenere da un singolo sensillum gusto può essere tecnicamente impegnativo a seconda della cellula-tipo, le dimensioni e la posizione. Inoltre, la risoluzione neurone singolo in Drosophila può essere difficile da realizzare, poiché il gusto sensilla House più di un tipo di chemosensory neurone. Il metodo di imaging di calcio in diretta qui descritta permette risposte dei singoli neuroni gustative in mosche in tensione da misurare. Questo metodo è particolarmente adatto per l&#39;imaging risposte neuronali a feromoni lipidici e altri tipi di ligandi che hanno una bassa solubilità in solventi a base acquosa.

L&#39;indicatore di calcio GCaMP è stata geneticamente espressa utilizzando i driver ppk23-GAL4 Gr68a-GAL4 o. Distinte popolazioni di neuroni e cellule zampa anteriore di supporto non-neurali sono etichettati da ogni driver (Figura 3A-C). Risposte specifiche-ligando al CH503 feromone lipofila sono stati osservati in Gr68a-GAL4 e le cellule ppk23-GAL4 espressione GCaMP (Figura 3D). La variazione relativa di intensità di fluorescenza del segnale GCaMP...

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Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

measuring-physiological-responses-drosophila-sensory-neurons-to-lipid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

8.5K Views.  Temasek Life Sciences Laboratory. The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone. 

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Loading Drosophila Nerve Terminals with Calcium Indicators

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as the messenger essential for the synaptic plasticity that supports learning and memory. To further elucidate the molecular underpinnings of Ca2+-dependent synaptic mechanisms, a model system is required that is both genetically malleable and physiologically accessible. Drosophila melanogaster provides such a model. In this system, genetically-encoded fluorescent indicators are available to detect Ca2+ changes in nerve terminals. However, these indicators have limited sensitivity to Ca2+ and often show a non-linear response. Synthetic fluorescent indicators are better suited for measuring the rapid Ca2+ changes associated with nerve activity. Here we demonstrate a technique for loading dextran-conjugated synthetic Ca2+ indicators into live nerve terminals in Drosophila larvae. Particular emphasis is placed on those aspects of the protocol most critical to the technique's success, such as how to avoid static electricity discharges along the isolated nerves, maintaining the health of the preparation during extended loading periods, and ensuring axon survival by providing Ca2+ to promote sealing of severed axon endings. Low affinity dextran-conjugated Ca2+-indicators, such as fluo-4 and rhod, are available which show a high signal-to-noise ratio while minimally disrupting presynaptic Ca2+ dynamics. Dextran-conjugation helps prevent Ca2+ indicators being sequestered into organelles such as mitochondria. The loading technique can be applied equally to larvae, embryos and adults.

Calcium is a ubiquitous messenger in the nervous system, essential for triggering neurotransmitter release and changes in synaptic strength. Here we demonstrate a technique for loading Ca2+-indicators into Drosophila nerve terminals. We also demonstrate fabrication of the required apparatus and emphasize points critical for the technique's success.

Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Calcium plays many roles in the nervous system but none more impressive than as the trigger for neurotransmitter release, and none more profound than as ...

Ricerca

Biologia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Neuroscienze

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Calcio Imaging per visualizzare le risposte del cervello alla segnalazione endocrina in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. Learning-induced changes in synaptic transmission are often distributed across many neurons and levels of processing in the brain. Therefore, methods to visualize learning-dependent synaptic plasticity across neurons are needed. The fruit fly Drosophila melanogaster represents a particularly favorable model organism to study neuronal circuits underlying learning. The protocol presented here demonstrates a way in which the processes underlying the formation of associative olfactory memories, i.e., synaptic activity and their changes, can be monitored in vivo. Using the broad array of genetic tools available in Drosophila, it is possible to specifically express genetically encoded calcium indicators in determined cell populations and even single cells. By fixing a fly in place, and opening the head capsule, it is possible to visualize calcium dynamics in these cells whilst delivering olfactory stimuli. Additionally, we demonstrate a set-up in which the fly can be subjected, simultaneously, to electric shocks to the body. This provides a system in which flies can undergo classical olfactory conditioning - whereby a previously na&#239;ve odor is learned to be associated with electric shock punishment - at the same time as the representation of this odor (and other untrained odors) is observed in the brain via two-photon microscopy. Our lab has previously reported the generation of synaptically localized calcium sensors, which enables one to confine the fluorescent calcium signals to pre- or postsynaptic compartments. Two-photon microscopy provides a way to spatially resolve fine structures. We exemplify this by focusing on neurons integrating information from the mushroom body, a higher-order center of the insect brain. Overall, this protocol provides a method to examine the synaptic connections between neurons whose activity is modulated as a result of olfactory learning.

In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster

Here we present a protocol with which pre- and/or postsynaptic calcium can be visualized in the context of Drosophila learning and memory. In vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors is combined with a classical olfactory conditioning paradigm such that the synaptic plasticity underlying this type of associative learning may be determined.

In Vivo Optical Calcium Imaging della plasticità sinaptica indotta dall'apprendimento in Drosophila melanogaster

Decades of research in many model organisms have led to the current concept of synaptic plasticity underlying learning and memory formation. ...

In Vivo Calcium Imaging of Taste-Induced Neural Responses in Adult Drosophila

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model organism, Drosophila melanogaster. A key strength of this methodology is its ability to record taste-induced neural responses in awake animals without the need for anesthesia. This approach employs binary expression systems (e.g., Gal4-UAS) to express the calcium indicator GCaMP in specific neurons of interest. This protocol describes a procedure in which flies expressing GCaMP are mounted with the labellum securely positioned, enabling fluorescence in the brain to be recorded at millisecond resolution under a confocal microscope while a solution is applied to the labellum, stimulating all labellar taste sensilla. The examples provided focus on calcium responses in primary gustatory receptor neurons of D. melanogaster. However, this approach can be adapted to record from other neurons of interest within the brain of Drosophilids or other insect species. This imaging method enables researchers to simultaneously record collective calcium responses from groups of gustatory neurons across the labellum, complementing electrophysiological tip recordings that quantify action potentials from individual neurons. The in vivo calcium imaging technique outlined here has been instrumental in uncovering molecular and cellular mechanisms of chemosensation, identifying unique temporal response patterns in primary taste neurons, investigating mechanisms of gustatory modulation, and exploring taste processing in downstream circuits.

A calcium imaging approach enables the recording of taste-induced responses in the brains of awake flies while a solution is applied to the labellum. Primary gustatory responses in Drosophila melanogaster are used as an example, but this protocol can be adapted to study downstream neurons or other species.

In vivo Imaging del calcio delle risposte neurali indotte dal gusto nella Drosophila adulta

For nearly two decades, in vivo calcium imaging has been an effective method for measuring cellular responses to taste stimuli in the fruit fly model ...

In Vivo Calcium Imaging Using Synaptically Localized Calcium Sensors in Drosophila melanogaster

Source: Hancock, C. E. et al., <a href="https://app.jove.com/v/60288">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates a method for in vivo calcium imaging using synaptically localized calcium sensors in flies. It outlines the steps for preparing the flies for microscopy, conducting olfactory conditioning, and visualizing odor-induced calcium influx.

in vivo Imaging del calcio utilizzando sensori di calcio localizzati sinapticamente in Drosophila melanogaster

1. Transgenic fruit flies,&#160;Drosophila melanogaster

	Cross female virgin and male flies (raised at 25 &#176;C in 60% relative humidity on a 12 h ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

Drosophila In Vivo Imaging del calcio: un metodo per l'imaging funzionale dell'attività neuronale

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
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Drosophila melanogaster (fruit fly)

Adult

Detecting Physiological Responses from Sensory Neurons in Drosophila

Source: Shankar, S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53392">Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a method for detecting sensory neuron responses in Drosophila using ligand binding and fluorescence imaging. Ligands bind to neuron receptors, causing calcium influx. The calcium binds to indicator complexes, leading to fluorescence emission, which confirms the neuronal response to the ligand.

Rilevamento delle risposte fisiologiche dai neuroni sensoriali in Drosophila

1. Sample Preparation

	Cross the Gal4 driver line to UAS-GCaMP5G Drosophila melanogaster flies (w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40). Allow the cross to grow ...

Misurare risposte fisiologiche di

Riepilogo

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