הקרנת גמא היא טיפול נפוץ לסרטן המעי הגס. ובעוד זה יעיל מבחינה טיפולית, יש לו השפעות שליליות על מערכת העיכול. הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה יעילה לחקר ההפעלה, ההתמיינות והנדידה של תאים במהלך התחדשות לאחר פגיעה בקרינה.
פרוטוקול זה מתאר מודל חזק וניתן לשחזור של פגיעות קרינה. חשוב לציין, מודל זה מאפשר לעקוב אחר גורל תאי המעי לאחר פציעה ובכך מספק הבנה טובה יותר של יכולת ההתחדשות של תת-אוכלוסיית תאים ספציפית. טכניקה זו יכולה להשתמש במודלים שונים של בעלי חיים העוקבים אחר שושלת כדי לחקור את ההתנהגות בזמן אמת ואת האינטראקציה של תת-אוכלוסיות שונות של תאים לאחר פציעה.
שינויים קלים בפרוטוקול זה אמורים לאפשר לחקור את היחסים בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות שונות של תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בעת פגיעה בקרינה. כדי להתחיל, להשעות אבקת טמוקסיפן בשמן תירס סטרילי בריכוז של 30 מיקרוגרם למיקרוליטר. סוניק במשך שלוש דקות במחזורי כיבוי של 30 שניות עם משרעת של 60%.
מערבבים בסיבוב בחושך במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו את EdU על ידי הוספת DMSO סטרילי לאבקת EdU. מוסיפים 1/5 מהנפח הכולל, ומוסיפים לאט לאט את הנפח הנותר של מים סטריליים טהורים במיוחד.
כאשר מומס לחלוטין, aliquot ולאחסן ב 20 מעלות צלזיוס. הכינו ריאגנטים לאיסוף וקיבוע רקמות, כגון אתנול 70% במים, DPBS מקורר לארבע מעלות צלזיוס, חיץ קיבוע של Bouin, ופורמלין חוצץ 10%. לאחר מכן, להכין את הציוד הדרוש, כגון ערכת דיסקציה עכברים, צלחות פטרי, מחט gavage 16 מד מחובר מזרק 10 מיליליטר קלטות היסטולוגיות.
יומיים לפני החשיפה לקרינת גמא, הכינו את חיות הניסוי להזרקת טמוקסיפן. לשקול כל חיה, ולחשב את המינון הנדרש. יש לחטא את אזור הבטן באתנול 70%.
לאחר מכן, יש לתת מנה אחת של טמוקסיפן תוך צפקי באמצעות מחט של 27 מד המחוברת למזרק של מיליליטר כדי לגרום לרקומבינציה בתיווך Cre. התבוננו בבעלי חיים במשך 48 השעות הבאות כדי למנוע רעילות פוטנציאלית של טמוקסיפן. לאחר 48 שעות, העבירו את בעלי החיים לחדר הקרנה.
יש לחטא את תא הדגימה במקרין הגמא בתמיסת אתנול 70%. הניחו את משטח הספיגה ובעלי החיים בתוך תא הדגימה. מניחים את המכסה וסוגרים את החדר.
תכנת את מקרין הגמא כך שיחשוף בעלי חיים לקרינת גוף כוללת של 12 אפורים. לאחר מכן, סובב את המקש למיקום ההתחלה ולחץ על התחל כדי להתחיל את החשיפה. השאירו את החדר לזמן חשיפה פעיל.
לאחר שחלף הזמן שנקבע מראש, המכונה תפסיק אוטומטית ותתחיל לצפצף. כבה את המכונה על-ידי הפיכת המפתח למצב עצירה. פתח את תא הדגימה והסר את המכסה.
מעבירים את בעלי החיים לכלוב, ומחטאים את תא הדגימה באתנול 70%. העבירו את בעלי החיים בחזרה לחדר הדיור הקונבנציונלי, והתבוננו במצבם לאחר הטיפול. עקוב אחר משקל בעלי החיים מדי יום.
שלוש שעות לפני המתת החסד המתוכננת, יש לחטא את אזור הבטן ולהזריק לעכברים תוך צפקית 100 מיקרוליטר של תמיסת מלאי EdU באמצעות מזרק אינסולין בעל 28 מד. לאחר המתת החיה, לאסוף את המעיים פרוקסימלי בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה. לנתח את החלק הפרוקסימלי של המעי הדק, ולהסיר רקמות מחוברות.
שטפו את הרקמה ב-DPBS קר באמצעות מחט הזנה ישרה בעלת 16 מד המחוברת למזרק של 10 מיליליטר, וקיבעו את הרקמה באמצעות חיץ הקיבוע של Bouin. חתכו את המעיים לאורך, וגלגלו את המעיים הפרוקסימליים בטכניקת סוויס-רול. הניחו את הרקמות בקלטת היסטולוגית במיכל עם 10% פורמלין חוצץ, ודגרו עליו במשך 24 עד 48 שעות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, להעביר את הקלטות היסטולוגיות ל 70% אתנול, ולהטמיע את הרקמה בפרפין. לאחר ההטבעה, הניחו את הקלטות ההיסטולוגיות על קרח למשך שעה לפחות. לאחר מכן, חתכו חלקים אופקיים בעובי חמישה מיקרון באמצעות מיקרוטום.
מעבירים את חלקי הרקמה לאמבט מים המחומם עד 45 מעלות צלזיוס, ומניחים את המקטעים על מגלשות טעונות. השאירו את המגלשות על מדף למשך הלילה בטמפרטורת החדר לייבוש. תמונות המטוקסילין ואוזין של דגימות מעי דק הראו אפיתל מעי הומיאוסטטי בשעת אפס, ואחריו אובדן תאים בתוך תאי קריפטה במהלך השלב האפופטוטי.
לאחר מכן הגיע השלב הרגנרטיבי שבו תאים מתרבים מאוד אכלסו את הקריפטות, מה שהוביל לשלב הנורמליזציה ביום השביעי. מעקב אחר שושלת על ידי EYFP הראה כי במהלך הומאוסטזיס, התאים שמקורם בתאי גזע עתודות חיוביות Bmi1 הוגבלו לפלוס ארבעה עד פלוס שישה מיקומים בתוך קריפטות. צביעת EdU ו- Ki-67 הראתה הומאוסטזיס מעיים תקין בעכברים מוקרנים דמה, המשתרעת מתאי גזע פעילים דרך אזור הגברת המעבר.
במהלך השלב האפופטוטי, מספר התאים החיוביים ל-EYFP ירד, מלווה באובדן תאים מתרבים שנגרם כתוצאה מנזקי קרינה. בשלב הרגנרטיבי נצפתה הפעלה של תאי גזע רזרבה והתפשטות מהירה של תאים חיוביים ל- Bmi1. התפשטות נוספת והגירה החזירו את שלמות אפיתל המעי.
צביעת טונל הראתה כי תאים אפופטוטיים נעדרים במהלך הומאוסטזיס. עלייה בצביעת טונל נצפתה בשלב מאוחר בשלב האפופטוטי. במהלך השלב הרגנרטיבי, צביעת טונל פחתה בהתמדה בתוך הקריפטים המתחדשים וכמעט נעדרה כאשר הקריפטים נרמלו.
ניתן לשלב טכניקה זו עם ריצוף RNA, ריצוף RNA חד-תאי, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות או אנליזה פרוטאומית כדי ללקט ידע מעמיק יותר על תפקידן של שושלות תאים ספציפיות במהלך התחדשות המעי לאחר פציעה. החוקרים יכולים לחקור את יחסי הגומלין בין מיקרוביוטה לבין אוכלוסיות תאי אפיתל, סטרומה ומערכת החיסון בהתחדשות המעי כדי להרחיב את ההבנה של יכולת ההתחדשות של אפיתל המעי.
