Name: identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
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Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. La clonazione di wild-type tdTomato-tag e senza motore KIF5B Proteine <ol><li> Amplificazione del cDNA per la wild-type umana e proteine ​​KIF5B senza motore utilizzando i primers in Tabella 1, Taq DNA polimerasi (5 unità per 100 ml), dNTP mix (2 mM per ogni deossinucleotide) e il suo buffer 10X per 30 cicli. Ciascun ciclo consiste di una fase di denaturazione (95 ° C per 30 sec), una fase di ricottura (45 ° C per 30 sec) ed una fase di estensione (72 ° C per 3 min). </li><li> Estrarre il prodotto DNA amplificato a parità di volume di fenolo / cloroformio (1: 1). Nota: Il fenolo è infiammabile e può causare ustioni. Il cloroformio è pericoloso. Evitare il contatto diretto con loro e li usa sotto una cappa. In alternativa, i prodotti di PCR possono essere purificati mediante vari kit. <ol><li> Spin a 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 1 min. Trasferire la soluzione acquosa in una nuova provetta ed estrarre con un uguale volume di cloroformio. </li><li> rotazionea 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 0,5 min. Trasferire la soluzione acquosa in una nuova provetta. </li><li> Miscelare la soluzione acquosa con un decimo del volume di 3 M Na-acetato e due volumi di etanolo assoluto. </li><li> Spin a 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare la soluzione acquosa. </li><li> Lavare il pellet di DNA con due volumi di etanolo al 75%. Scartare la soluzione acquosa e asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 5 min. Risospendere il pellet di DNA in 34 ml di acqua. </li></ol></li><li> Digest prodotti amplificati in un volume finale di 40 microlitri con enzimi di restrizione SalI (10 unità) e BamHI (10 unità) e 4 ml di tampone 10X loro a 37 ° C per due ore. Separare i prodotti digeriti in un gel di agarosio (1,0% a 100 V) contenente etidio bromuro (0,2 mcg / ml). Nota: il bromuro di etidio è un agente mutageno potente e può essere assorbito attraverso la pelle. Pertanto, è importante evitare il contatto diretto o indiretto wesimo bromuro di etidio. </li><li> Tagliare le bande corretti per la purificazione da colonne. Pesare il gel contenente il frammento di DNA. Sciogliere quindi nel buffer solubilizzazione (300 microlitri per 0,1 g) a 37 ° C per circa 20 min. </li><li> Aggiungere la soluzione portato ad una colonna e centrifuga in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Lavare la colonna con tampone di solubilizzazione 0,5 ml ripetendo il passo 1.5. Lavare la colonna di nuovo con 0,75 ml tampone di lavaggio ripetendo il passo 1.5. Gira la colonna per 2 minuti per sbarazzarsi del tampone di lavaggio residuo. </li><li> Eluire il frammento di DNA con 50 microlitri di acqua ripetendo il passaggio 1.5. Valutare la concentrazione del frammento di DNA eseguendo una aliquota di contro una scala dimensioni DNA in gel di agarosio (1,0% a 100 V) contenente etidio bromuro (0,2 mg / ml). </li><li> Legare i prodotti purificati (circa 100 ng) con il vettore ptdTomato-C1 17 (circa 100 ng) precedentemente digerito con °e stessa enzimi di restrizione in 10 microlitri utilizzando T4 DNA ligasi (2.000 unità) e 1 ml 10X tampone di ligasi a temperatura ambiente per 16 ore. Nota: La wild-type e mutanti senza motore contiene aminoacidi da 2 a 963 e 584-963, rispettivamente. In precedenza, una più grande mutante KIF5B senza motore è stato utilizzato per identificare la sua funzione 9. Una più piccola senza motore KIF5B mutante è stato utilizzato per gli attuali studi per aumentare i propri livelli di espressione. </li></ol> 2. La microscopia ad immunofluorescenza <ol><li> Per live-cell imaging di fluorescenza o indiretto con un ingrandimento pari o inferiore a 40X, semi di 0,2-0,3 milioni di cellule HeLa in 1 ml di mezzo completo [Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS)] in ciascun pozzetto di una sei pozzetti. Crescere a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Per gli studi di immunofluorescenza indiretta con ingrandimenti superiori 40X, lavare bicchieri coperchio (18 mm x 18 mm; 1,5 di spessore) in breve tempo etanolo assoluto e aria asciugarei pozzetti di una piastra ben sei, all&#39;interno di un armadio biosicurezza per evitare la contaminazione. <ol><li> Seme 0,2-0,3 milioni di cellule in 1 ml completano terreno DMEM in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. </li></ol></li><li> Preparazione di Transfection Complex <ol><li> Il giorno successivo, all&#39;interno di un armadio biosicurezza, diluire 0,6 mg (totale) del plasmide di espressione per tdTomato-tag wild-type o KIF5B senza motore in presenza o assenza di un plasmide di espressione per una proteina cargo candidato (pTagCFP-c-MYC 5 ) con 0,1 ml di mezzo di transfezione in una provetta 1,6 ml microcentrifuga. Nota: Il vettore pTagCFP-c-Myc esprime la TagCFP-tag c-myc. </li><li> Aggiungere 1,8 microlitri di reagente trasfezione a 0,1 ml di mezzo transfezione in un altro tubo di 1,6 ml microcentrifuga. In genere, preparare un master mix di reagente trasfezione diluito sufficiente per 12 campioni. </li><li> Incubare per 5 minuti, a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il diluita di 0,1 ml di reagente di trasfezione alle diluiti 0,1 ml DNA. Mix il contenuto invertendo i tubi. Spin le provette per 5 secondi in una microcentrifuga. </li><li> Incubare per 45 minuti, a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavaggio delle cellule <ol><li> Lavare le cellule seminate tre volte con tampone fosfato isotonico (PBS) durante il periodo di incubazione per la formazione del complesso trasfezione. </li><li> Sostituire il medium delle cellule seminate in ogni pozzetto con 0,8 ml di media trasfezione pre-riscaldato. Riportare le piastre per l&#39;incubatore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Trasfezione delle cellule <ol><li> Dopo incubazione di 45 min, aggiungere 0,2 ml del complesso reattivo DNA / trasfezione (preparato al punto 2.3) goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Rock the piastra 6 bene delicatamente per 5 secondi, prima di essere restituiti al incubatore a 37 ° C. </li><li> Dopo 6-8 ore, sostituire il mezzo con il mezzo DMEM completo. </li></ol></li><li> Per Live-cell imaging di fluorescenza 18 <ol><li> Dopo un ulteriore 16 ore di incubazione at 37 ° C, aggiungere la macchia intercalante del DNA Hoechst 33342 al mezzo ad una concentrazione finale di 1 mM. Nota: Hoechst 33342 è un colorante intercalante del DNA delle cellule permeabili che macchia i nuclei delle cellule. </li><li> Incubare le cellule trasfettate per 10 min in incubatore a 37 ° C prima di esaminarli per l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un obiettivo 40X. I set di filtri per DAPI, CFP, FITC e Cy3 sono (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (Ex545 nm / Em605 nm), rispettivamente. Nota: Se lo sfondo è elevato a causa di auto-fluorescenza del mezzo DMEM completo, viene utilizzato mezzo senza rosso fenolo. </li></ol></li></ol> 3. Per indiretti studi di immunofluorescenza <ol><li> Preparazione della soluzione Paraformaldeide <ol><li> Pesare in polvere paraformaldeide (4 g per 100 ml di PBS) e aggiungerlo al PBS. Nota: Paraformaldeide è un solido infiammabile e un potenziale Hazar cancrod. Si irrita gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Pertanto, è importante evitare il contatto con o inalazione di paraformaldeide. </li><li> Aggiungere NaOH alla soluzione (150 microlitri NaOH 10 N / 100 ml). </li><li> Mantenere la soluzione a 37 a 42 ° C per 2-3 ore con agitazione occasionale. </li><li> Regolare il pH a 7,0 mediante aggiunta di acido acetico glaciale alla soluzione (circa 75 microlitri / 100 ml) dopo la polvere paraformaldeide si scioglie. </li></ol></li><li> Proteine ​​bersaglio di colorazione <ol><li> Dopo ulteriore incubazione per 16 ore a 37 ° C, lavare le cellule trasfettate a temperatura ambiente una volta con PBS agitando la piastra sei pozzetti per 5 sec. </li><li> Fissare le cellule con 1 ml di appena preparata, 4% soluzione di paraformaldeide per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS tempo agitando per 5 secondi il piatto a sei bene. Scartare la soluzione. </li><li> Incubare le cellule con 1 ml di 0,1% Triton-X 100 (in PBS) a temperatura ambiente per 30 min. il detergent Triton-X 100 si permeabilize la membrana cellulare per consentire l&#39;accesso degli anticorpi ai loro bersagli intracellulari. </li><li> Lavare le cellule con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li><li> Incubare le cellule con 1 ml di anticorpi primari (c-MYC anticorpo di coniglio o dell&#39;anticorpo p53 del mouse; 0,1 mg / ml) in un FBS 10% in soluzione PBS a temperatura ambiente agitandola per 4 ore. </li><li> Lavare con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li><li> Incubare con 1 ml di anticorpi secondari colorante coniugato fluorescenti (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio o anticorpi IgG anti-topo; 0,5 mg / ml) in 10% FBS in PBS a temperatura ambiente al buio facendo oscillare per 2 ore. </li><li> Lavare con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li></ol></li><li> Colorazione nucleare e di montaggio <ol><li&gt; Incubare le cellule con 1 ml di DNA intercalante dye 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 0,5 mg / ml) in PBS a temperatura ambiente, al buio per 10 min. Passare al punto 3.4 quando non vetrini vengono utilizzati. Nota: DAPI è un colorante intercalante del DNA che macchia i nuclei delle cellule. </li><li> Applicare 10 ml di soluzione di montaggio su ogni vetrino da microscopio. Montare ciascun vetro di copertura sopra la soluzione di montaggio su un vetrino da microscopio. </li><li> Incubare a temperatura ambiente nella notte scura. </li><li> Sigillare i bordi dei vetrini con smalto. Mettere al buio all&#39;interno di una cappa aspirante durante la notte per rimuovere il chiodo fumi smalto. </li></ol></li><li> Microscopia a fluorescenza 19 <ol><li> Il giorno dopo, esaminare le cellule al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 40X. I set di filtri per DAPI, CFP, FITC e Cy3 sono (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (Ex545 nm / Em605 nm), rispettivamente. </li></ol></li></ol>

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pubblicazione accesso libero e la produzione di questo articolo è pagato da Roche.

Il metodo descritto utilizza le proprietà del mutante KIF5B senza motore, che non ha la capacità di muoversi lungo i microtubuli, ma mantiene la capacità di formare dimeri con wild-type KIF5B e, quindi, consentire la proteina tetramerica per interagire con le stesse proteine ​​cargo come wild-type KIF5B. KIF5B senza motore, di conseguenza, agisce come un mutante dominante negativo e forme mislocalized aggrega con i suoi carichi. Questo metodo è dimostrato di identificare il Kinesin-1 cargo c-MYC (Figura 1) 5. In questo articolo, lo stesso mutante KIF5B senza motore è stato utilizzato per identificare p53 come un altro potenziale carico di Kinesin-1 (Figura 2). Questo dimostra che la metodologia sia praticabile individuare altri carichi di Kinesin-1. Inoltre, la specificità del mutante è fornito dalla mancanza di effetto del mutante della proteina controllo negativo c-Fos (Figura 3). In questo protocollo, il tdTomato-tag wild-tyPE o proteina KIF5B senza motore è coespressi con un&#39;altra proteina carico candidato proteina-tag fluorescente. In questo caso, live-cell microscopia a fluorescenza e di imaging vengono eseguite. La formazione degli aggregati può essere fatta dal time-lapse imaging. In alternativa, la proteina tdTomato-tag si esprime da solo e il candidato del carico di proteine ​​ai suoi livelli fisiologici viene visualizzato al microscopio immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici. Il tdTomato proteina fluorescente viene scelto per la sua luminosità e fotostabilità 17. Se lo sfondo è elevato a causa di auto-fluorescenza del mezzo DMEM completo, viene utilizzato mezzo senza rosso fenolo. Il KIF5B mutante senza motore forma dimeri con wild-type KIF5B stechiometricamente. Pertanto, è fondamentale per esprimere quantità sufficiente di senza motore mutante KIF5B per formare dimeri con wild-type controparte di inibire la sua funzione e per formare aggregati. Per risolvere questo problema, l&#39;ottimizzazione di esprESSIONE del mutante senza motore è essenziale. Si è ottenuto utilizzando un piccolo mutante senza motore contenente il dominio di dimerizzazione. Inoltre, l&#39;ottimizzazione del reagente di trasfezione appropriato e protocollo è anche necessario. La durata dell&#39;incubazione delle cellule HeLa con il reagente DNA / trasfezione è stata ottimizzata in cellule HeLa per l&#39;espressione di proteine ​​esogene e vitalità cellulare. La durata di incubazione può essere ottimizzato per altre linee cellulari. Per ingrandimenti tra 4X a 40X, non sono necessari gli occhiali di copertura. Le celle possono essere esaminate direttamente nei pozzetti. Pertanto, in questo caso, il protocollo è economico e conveniente. Per ingrandimenti superiori 40X, le cellule sono coltivate su vetrini nei pozzi e, dopo la colorazione, sono montati su vetrini da microscopio per l&#39;esame al obiettivi ad immersione in olio. Osservazione aggregati della proteina KIF5B senza motore è limitata dalla dimensione del citoplasma. È facile rilevare laaggregati in molte cellule di mammifero. Tuttavia, è relativamente difficile osservare aggregati nelle cellule neuronali quando il volume del citoplasma è piccola attorno ai nuclei e neuriti. Il protocollo viene utilizzato per mostrare l&#39;associazione tra KIF5B ei suoi carichi oltre al in vivo lievito doppio ibrido e saggi di pull-down biochimici 13-16. Tutti questi test determinare l&#39;associazione in diverse condizioni fisiche e loro risultati possono completarsi a vicenda. Inoltre, il vantaggio di questo test fluorescenza nel altri test è che può mostrare la regolazione della localizzazione subcellulare dei carichi da KIF5B (Figure 1 e 2). Il protocollo non è limitato a KIF5B e può essere utilizzato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici, come alcuni altri motori kinesin 3 e alcuni dei motori miosina 23,24 utilizzati nel trasporto intracellulare di carichi 3. Queste proteine ​​motore contengono anche i domini a motore per il movimento lungo i microtubuli per motori kinesin e microfilamenti per motori miosina, e segmenti a doppia spiralizzazione per oligomerizzazione. La maggior parte di essi sotto forma omodimeri 3,23. Pertanto, una strategia simile può essere applicata a loro creando loro senza motore mutanti dominanti negativi per identificare i loro carichi.

Kinesin-1 è una proteina motore che media il trasporto anterogrado dei suoi carichi 1,2. Si tratta di un heterotetramer delle due subunità della catena Kinesin Luce 1 (KLC1) e due subunità di catene pesanti (Kinesin KHCs). KIF5B 1, un KHC, contiene un dominio motore al suo N-terminale, che idrolizza ATP e converte l&#39;energia chimica in energia meccanica per il movimento lungo i microtubuli. La regione C-terminale contiene il dominio di dimerizzazione che interagisce con KLC1, che associa con carichi. Kinesin-1 trasporta carichi, come vescicole, organelli e mRNA 3,4. Recentemente, KIF5B stato dimostrato per il trasporto del fattore di trascrizione nucleare c-MYC degradazione proteosomal nel citoplasma 5. Tre metodologie (inibitore chimico, siRNA / shRNA e dominante mutante negativo) sono stati usati per inibire Kinesin-1 funzione. Tutti indotto aggregazione di c-MYC nel citoplasma. Per l&#39;ultima metodologia, c-Myc è stato influenzato solo dal negat dominanteive mutante di KIF5B, ma non da quella di un altro relativo motore di proteine ​​KIF5A, suggerendo che il mutante non esercitare effetti generali sui componenti intracellulari (come microtubuli interruzione) o sull&#39;aggregazione proteica. Il mutante dominante negativo di KIF5B, inoltre, non ha influenzato un altro fattore di trascrizione, suggerendo che non esercita effetti generali sui fattori di trascrizione. Piuttosto, suggerisce che il mutante dominante negativo esercita effetti specifici sui suoi carichi. L&#39;uso di mutanti dominanti negativi è comune nel campo delle proteine ​​motrici. Simili mutanti prive di motore di kinesins e myosins sono stati utilizzati in precedenza. Essi sono stati utilizzati principalmente per dimostrare gli effetti dei mutanti sulle localizzazioni subcellulari dei loro carichi o sulle funzioni cellulari 6-12. Meno enfasi è stata posta sul rapporto spaziale tra i mutanti e i carichi da esse interessati. Tuttavia, in alcuni incidenze, sono stati osservati i mutanti di co-localizza con la cargos 6,10. L&#39;interazione tra KIF5B e le sue proteine ​​associate è stato già confermato dal lievito in vivo test doppio ibrido e saggi di pull-down biochimici come co-immunoprecipitazione e in saggi di pull-down in vitro 13-16. In questo articolo, un ulteriore metodo che utilizza la microscopia a fluorescenza visivo è descritto per identificare le proteine ​​cargo KIF5B. Il metodo fa uso di un mutante KIF5B senza motore che agisce come un mutante dominante negativo. Si aggrega nel citoplasma e induce l&#39;aggregazione dei suoi carichi. Il tagging delle wild-type e mutante senza motore KIF5B con la proteina fluorescente tdTomato 17 consente la loro visualizzazione al microscopio a fluorescenza. Le proteine ​​KIF5B marcati possono essere co-espresso con una proteina candidato fusa ad una proteina fluorescente differente con proprietà spettrali opportunamente separate dal tag KIF5B. Le proteine ​​taggati sono osservati direttamente in cellule viveal microscopio a fluorescenza. Induzione di aggregazione della proteina candidato da parte del mutante KIF5B senza motore confermerà che la proteina candidato è un carico in vivo di KIF5B. Inoltre, le proteine ​​KIF5B tdTomato-tag possono essere espressi solo nelle cellule per studiare gli effetti sulle proteine ​​endogene cargo. Successivamente, immunofluorescenza è condotto in cui le cellule transfettate vengono fissate e colorate con un anticorpo specifico contro la proteina endogena candidato, seguito da un anticorpo secondario coniugato adeguato con un colorante fluorescente. In questo caso, la proteina endogena candidato al livello fisiologico è studiato. Simili mutanti prive di motore delle altre proteine ​​motrici possono essere preparati per identificare i loro carichi.

<table><tbody><tr><td>absolute ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I (transfection medium)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>formaldehyde, para</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polymerase</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel Extraction kit</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&amp;nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC rabbit antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 mouse antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>fluorescent microscope&amp;nbsp;</td><td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>computer software for imaging</td><td>&amp;nbsp;cellSens&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Esogenamente espresso wild-type KIF5B apparso omogeneamente nel citoplasma, mentre c-MYC apparso prevalentemente nel nucleo (Figura 1A). Tuttavia, il KIF5B mutante privo di motore formata aggregati nel citoplasma (Figura 1A). Aggregazione del KIF5B senza motore ha indotto l&#39;aggregazione di c-myc. La percentuale di cellule che esprimono aggregato TagCFP-tag c-myc nelle cellule che esprimono wild-type KIF5B è stata bassa. Tuttavia, è stato significativamente più alto quando il KIF5B senza motore è stato co-espressa (Figura 1A). Il osservato co-localizzazione KIF5B mutante c-MYC (Figura 1) suggerisce che KIF5B regola la localizzazione subcellulare di c-myc e c-MYC è un carico di Kinesin-1. I controlli negativi in cui i costrutti sono stati espressi solo sono inclusi nel riquadro inferiore della figura 1A. I risultati mostrano che non vi era alcuna significativa sanguinare-through della fluorescenza emission. Il KIF5B senza motore anche indotto aggregazione della endogena c-MYC (Figura 1B) e il fattore di trascrizione p53 (Figura 2), indicando che c-Myc e p53 sono entrambi i carichi di Kinesin-1 e KIF5B regola la localizzazione subcellulare di entrambe le proteine ​​endogene. Insieme con i risultati che la Kinesin-1 inibitore rosa bengala lattone (RBL) formazione 20 induce di specie ad alto peso molecolare sia per c-myc e p53 5, p53 è probabile un carico di Kinesin-1. È interessante notare che il fattore di trascrizione nucleare p53, come c-MYC, viene esportato anche dal nucleo al citoplasma per proteasoma degradazione 21,22. Il movimento dei fattori di trascrizione da KIF5B sembra essere specifico perché l&#39;espressione del mutante KIF5B senza motore non ha influenzato la localizzazione subcellulare c-Fos o farla aggregare (Figura 3). I dati sopra riportati dimostrano che il metod impiegato in questa pubblicazione consente l&#39;identificazione ad alta specificità della Kinesin-1 carichi. Una strategia simile può essere applicata ad altre proteine ​​motrici pure. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figura 1: Espressione del mutante KIF5B senza motore induce c-Myc aggregazione nel citoplasma (A) cellule HeLa sono state trasfettate con tdTomato-tag wild-type (WT) KIF5B (rosso) e TagCFP-tag c-Myc (blu).. tdTomato-tag WT KIF5B apparso principalmente nel citoplasma, mentre TagCFP-etichettato c-MYC apparso prevalentemente nel nucleo. Tuttavia, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) formata aggregati filamentosi o puntiformi nel citoplasma. Espressione dei KIF5B senza motore indotta l&#39;aggregazione di c-MYC. Il KIF5B mutante e c-Myc co-localizzate insieme (rosa). Sono mostrati Percentuali di cellule (%) indicanti aggregati di CFP-c-MYC (%). I risultati sono mostrati comemedia ± SD (n = 3). I controlli negativi con l&#39;espressione di proteine ​​KIF5B tdTomato-tag o TagCFP-tag c-Myc con vettori vuoti (V) sono mostrati nel pannello inferiore. (B) Risultati simili sono stati ottenuti con il endogena c-MYC (verde) quando sono stati espressi tdTomato-tag WT o proteine ​​KIF5B senza motore (rossa). Il KIF5B mutante senza motore tdTomato-tag formata aggregati nel citoplasma e l&#39;aggregazione del endogena c-Myc indotta. Entrambi i tipi di aggregati co-localizzate insieme nel citoplasma (arancione). I nuclei sono stati colorati con il colorante Hoechst 33342 o DAPI. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figura 2: Espressione del mutante KIF5B senza motore produce aggregazione p53 endogena in tha citoplasma. Nelle cellule HeLa, esogeno tdTomato-tag wild-type (WT) KIF5B (rosso) apparso principalmente nel citoplasma, mentre il p53 endogena (verde) apparso principalmente nel nucleo. Al contrario, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) aggregati nel citoplasma formata. Espressione dei KIF5B senza motore indotta l&#39;aggregazione di p53, causando la co-localizzazione KIF5B e p53 nel citoplasma (giallo). L&#39;esperimento è stato eseguito per tre volte. I nuclei sono stati colorati con il DAPI colorante. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figura 3:. L&#39;espressione del mutante KIF5B senza motore non induce l&#39;aggregazione di c-Fos nel citoplasma tdTomato-tagged wild-type (WT) KIF5B (rosso) è apparsoprincipalmente nel citoplasma delle cellule HeLa, mentre EGFP-c-Fos (verde) apparso principalmente nel nucleo. Al contrario, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) aggregati nel citoplasma formata. L&#39;espressione della KIF5B senza motore non ha indotto l&#39;aggregazione di c-Fos. L&#39;esperimento è stato eseguito quattro volte. I nuclei delle cellule sono state colorate con DAPI colorante. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> primer reverse comune </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> wild-type KIF5B primer forward </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> KIF5B senza motore primer forward </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabella 1: sequenze primer per la clonazione del wild-type e le proteine ​​KIF5B senza motore.

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Qui, un protocollo è presentato per identificare Kinesin-1 carichi. Un mutante senza motore della Kinesin-1 catena pesante (KIF5B) aggrega nel citoplasma e induce l&#39;aggregazione dei suoi carichi. Entrambi gli aggregati vengono rilevate al microscopio a fluorescenza. Una strategia simile può essere impiegato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

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Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Qui, un protocollo è presentato per identificare Kinesin-1 carichi. Un mutante senza motore della Kinesin-1 catena pesante (KIF5B) aggrega nel citoplasma e induce l'aggregazione dei suoi carichi. Entrambi gli aggregati vengono rilevate al microscopio a fluorescenza. Una strategia simile può essere impiegato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici. 

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. Kinesins display differences across the superfamily both in ATP turnover and in microtubule interaction. These differences tailor specific kinesins to various functions such as cargo transport, microtubule sliding, microtubule depolymerization and microtubule stabilization. To understand the mechanism of action of a kinesin it is important to understand how the chemical cycle of ATP turnover is coupled to the mechanical cycle of microtubule interaction. To dissect the ATP turnover cycle, one approach is to utilize fluorescently labeled nucleotides to visualize individual steps in the cycle. Determining the kinetics of each nucleotide transition in the ATP turnover cycle allows the rate-limiting step or steps for the complete cycle to be identified. For a kinesin, it is important to know the rate-limiting step, in the absence of microtubules, as this step is generally accelerated several thousand fold when the kinesin interacts with microtubules. The cycle in the absence of microtubules is then compared to that in the presence of microtubules to fully understand a kinesin&#8217;s ATP turnover cycle. The kinetics of individual nucleotide transitions are generally too fast to observe by manually mixing reactants, particularly in the presence of microtubules. A rapid mixing device, such as a stopped-flow fluorimeter, which allows kinetics to be observed on timescales of as little as a few milliseconds, can be used to monitor such transitions. Here, we describe protocols in which rapid mixing of reagents by stopped-flow is used in conjunction with fluorescently labeled nucleotides to dissect the ATP turnover cycle of a kinesin.

Kinesins are characterized by nucleotide-dependent interaction with microtubules: a cycle of ATP turnover coupled to a cycle of microtubule interaction. Here, we describe protocols to analyze the kinetics of individual nucleotide transitions in the ATP turnover cycle of a kinesin using fluorescently labeled nucleotides and stopped-flow fluorescence.

L&#39;uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

Ricerca

Chimica

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein are molecular motors that regulate anterograde and retrograde transport, respectively. These motors use microtubule networks as rails. Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful model organism to study axonal transport and IFT in vivo. Here, I describe a protocol to observe axonal transport and IFT in living C. elegans. Transported cargo can be visualized by tagging cargo proteins using fluorescent proteins such as green fluorescent protein (GFP). C. elegans is transparent and GFP-tagged cargo proteins can be expressed in specific cells under cell-specific promoters. Living worms can be fixed by microbeads on 10% agarose gel without killing or anesthetizing the worms. Under these conditions, cargo movement can be directly observed in the axons and cilia of living C. elegans without dissection. This method can be applied to the observation of any cargo molecule in any cells by modifying the target proteins and/or the cells they are expressed in. Most basic proteins such as molecular motors and adaptor proteins that are involved in axonal transport and IFT are conserved in C. elegans. Compared to other model organisms, mutants can be obtained and maintained more easily in C. elegans. Combining this method with various C. elegans mutants can clarify the molecular mechanisms of axonal transport and IFT.

Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a good model to study axonal and intracellular transport. Here, I describe a protocol for in vivo recording and analysis of axonal and intraflagellar transport in C. elegans.

Immobilizzazione del Caenorhabditis elegans per analizzare il trasporto intracellulare nei neuroni

Axonal transport and intraflagellar transport (IFT) are essential for axon and cilia morphogenesis and function. Kinesin superfamily proteins and dynein ...

Biologia dello sviluppo

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Ingegneria

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Biochimica

Characterizing the Composition of Molecular Motors on Moving Axonal Cargo Using "Cargo Mapping" Analysis

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative analysis of motor/cargo associations at the single vesicle level. The goal of this protocol is to use quantitative fluorescence microscopy to correlate (&#8220;map&#8221;) the position and directionality of movement of live cargo to the composition and relative amounts of motors associated with the same cargo. &#8220;Cargo mapping&#8221; consists of live imaging of fluorescently labeled cargoes moving in axons cultured on microfluidic devices, followed by chemical fixation during recording of live movement, and subsequent immunofluorescence (IF) staining of the exact same axonal regions with antibodies against motors. Colocalization between cargoes and their associated motors is assessed by assigning sub-pixel position coordinates to motor and cargo channels, by fitting Gaussian functions to the diffraction-limited point spread functions representing individual fluorescent point sources. Fixed cargo and motor images are subsequently superimposed to plots of cargo movement, to &#8220;map&#8221; them to their tracked trajectories. The strength of this protocol is the combination of live and IF data to record both the transport of vesicular cargoes in live cells and to determine the motors associated to these exact same vesicles. This technique overcomes previous challenges that use biochemical methods to determine the average motor composition of purified heterogeneous bulk vesicle populations, as these methods do not reveal compositions on single moving cargoes. Furthermore, this protocol can be adapted for the analysis of other transport and/or trafficking pathways in other cell types to correlate the movement of individual intracellular structures with their protein composition. Limitations of this protocol are the relatively low throughput due to low transfection efficiencies of cultured primary neurons and a limited field of view available for high-resolution imaging. Future applications could include methods to increase the number of neurons expressing fluorescently labeled cargoes.

Intracellular transport of cargoes, such as vesicles or organelles, is carried out by molecular motor proteins that track on polarized microtubules. This protocol describes the correlation of the directionality of transport of individual cargo particles moving inside neurons, to the relative amount and type of associated motor proteins.

Che caratterizza la composizione molecolare di motori su Moving assonale Cargo Utilizzo dell&#39;analisi &quot;Cargo Mapping&quot;

Understanding the mechanisms by which molecular motors coordinate their activities to transport vesicular cargoes within neurons requires the quantitative ...

Neuroscienze

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biologia

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

Isolamento e purificazione di chinesina dal Drosophila Embrioni

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

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L'uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine