Name: isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
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Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. cannula e Camera di preparazione <ol><li> Inserire capillari di vetro borosilicato pulito (diametro esterno 1,2 mm, diametro interno: 0,69 mm, 10 mm di lunghezza) nelle scanalature di un estrattore pipetta con un filamento di platino (diametro: 100 micron). </li><li> Utilizzo delle impostazioni appropriate, tirare la capillare per generare una cannula con una lunga e sottile punta (Figura 2) con un estrattore micropipetta. Le impostazioni utilizzate sono: Heat - 700, Pull - 100, Velocity - 50, - 10. </li><li> Inserire la cannula nel supporto della camera di myograph pressione. Allineare le cannule in modo appropriato. </li><li> rompere attentamente le punte delle cannule utilizzando una pinza sotto il microscopio da dissezione al diametro desiderato. Qui mostriamo una cannula con una punta 10 micron (Figura 2). </li><li> Riempire le due cannule con liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente 1,8 mm Ca 2+; riempire la camera con Ca2 + -free aCSF supplementato con siero bovino 1%(BSA) + 10 mM Diltiazem (tutte le soluzioni devono essere preparate di fresco prima dell&#39;inizio dell&#39;esperimento). A seconda delle dimensioni della camera, variare il volume di aCSF tra 5 e 20 ml. Conservare la camera a 4 ᵒ C fino al momento di iniziare cannulazione. NOTA: Diltiazem è un inibitore di calcio gated tensione reversibile di tipo L che causerà la dilatazione delle arteriole, che facilita la cannulazione </li></ol> 2. Isolamento di parenchimale Arteriole <ol><li> Eutanasia dell&#39;animale immediatamente prima dissezione utilizzando protocolli standard di laboratorio che sono stati approvati dal comitato di cura degli animali dell&#39;istituzione. L&#39;uso di barbiturici o anidride carbonica è preferito, come altri anestetici comunemente usati possono avere effetti vasodilatatori nella circolazione cerebrale 15. Tutte le procedure sugli animali indicati qui sono stati approvati dalla Institutional Animal Care e Usa Comitato presso la University of Nevada School of Medicine, e sono in agreement con i National Institutes of Health &quot;principi guida nella cura e uso degli animali&quot;. </li><li> Eutanasia l&#39;animale con anidride carbonica. Prima di decapitazione, assicurarsi che l&#39;animale ha smesso di respirare e non risponde quando pizzicare le zampe. </li><li> Decapitare l&#39;animale utilizzando una forbice tagliente (mouse) o ghigliottina (ratto). Togliere la pelle dalla testa dell&#39;animale e tagliare lungo la sutura cranica linea mediana utilizzando una forbice punta fine. Utilizzando una pinza smussato (mouse) o una pinza osso rimuovere con attenzione le ossa craniche e esporre il cervello. Rimuovere il cervello lentamente e con attenzione per non danneggiare le arterie superficie piale. Posizionare il cervello in un contenitore riempito con 20 ml di Ca 2+ -free aCSF integrato con 1% BSA in ghiaccio. </li><li> Riempire un piatto dissezione contenente un pad con ghiacciata Ca2 + -free aCSF integrato con 1% BSA e trasferire il cervello con la superficie ventrale rivolta verso l&#39;alto a questo piatto (Figura 2A). Porre la capsula in una dissezioneTing microscopio (Figura 3A). Pin il cervello per il pad con aghi calibro 27. Fare attenzione a evitare di mettere i perni nei pressi della cerebrale media (MCA). </li><li> Localizzare il circolo di Willis e la MCA ramificazione da esso. Utilizzando forbici primavera nitide e allineate Vännäs, tagliare un piccolo rettangolo intorno alla MCA. Assicurarsi che rettangolo è vicino a 5 mm di diametro attraverso l&#39;intera lunghezza della MCA. La parte superiore del rettangolo dovrebbe essere oltre il punto di diramazione dal Circolo di Willis (prossimale al circolo di Willis, figura 2B, freccia). </li><li> Utilizzando le forbici primavera Vännäs, eseguire un sottosquadro nella profondità del tessuto per circa 2 - 3 mm. NOTA: Questa parte è fondamentale per un buon isolamento delle arteriole parenchimali, e può richiedere un paio di prove per farlo bene. Se il taglio è nota fatta abbastanza in profondità, le arteriole isolati parenchimali sarà breve; se il taglio è troppo profondo, arteriole si rompono al loro punto di diramazione quando la sezionatotessuto viene rimosso. </li><li> Definire con precisione la fine più distale della fetta cerebrale nel piatto dissezione con la MCA rivolta verso l&#39;alto (distale dal Circolo di Willis) con perni di insetti. Effettuare una incisione superficiale per tagliare il pia vicino al perno, facendo attenzione a non tagliare troppo in profondità nella corteccia cerebrale sottostante (altrimenti i perni non tenere). </li><li> afferrare con attenzione ogni lato della pia con piccole pinze e iniziare peeling la pia dalla corteccia. Se necessario, trattenere la MCA, assicurando che la membrana piale circostante non sia danneggiato. </li><li> Mantenere peeling fino alla pia contenente la MCA è libero dalla corteccia. Si noti che la resistenza contro peeling aumenta vicino al Circolo della Willis. Prestare la massima attenzione a questo punto, perché le arteriole parenchimali più lunghi saranno in questa regione. </li><li> Una volta che la pia è libero, posizionarla con cautela sulla parte superiore del pad sul piatto dissezione con la superficie opposta a parenchimale arteriole rivolti verso il basso (Figura 2B). </li> &lt;li&gt; Utilizzando le forbici primavera Vännäs, tagliare le arteriole sezionati libero dalla MCA, assicurandosi che le estremità della nave sono tagliati senza mezzi termini. </li><li> arteriole raccolti possono essere utilizzati per myography pressione, analisi molecolare, o l&#39;isolamento del muscolo liscio nativo o cellule endoteliali. </li></ol> Myography 3. Pressione <ol><li> Preparare la sutura prima del tempo. Tagliare il filo di nylon verde scuro in pezzi da 5 mm e posizionare sul lato adesivo di un nastro biadesivo su una capsula di Petri. Al microscopio da dissezione, separare ogni pezzo suoi filamenti utilizzando una pinza sottile, e vagamente preparare un nodo semplice mezzo-intoppo facendo passare una estremità del filamento nell&#39;altra. </li><li> Utilizzando pinze, scegliere un nodo fuori dal nastro biadesivo, facendo attenzione a non afferrare con troppa pressione. Estrarre la sutura nella soluzione del bagno, scivolo nodo sulla cannula e serrare ad una distanza dalla punta della cannula. Ripetere la procedura per avere 2 punti di sutura su ogni cannula. </li><li> Coat un bicchieremicropipetta con una soluzione di BSA 10% e poi risciacquare l&#39;eccesso con Ca2 + -free aCSF integrato con 1% BSA. </li><li> Estrarre 50 ml di soluzione nel micropipetta di vetro, tirare su una arteriola parenchimale e trasferire alla camera myography pressione. Premere stantuffo in un movimento fluido per erogare la arteriole parenchimale nella camera per evitare che si attacchino alla camera interna della micropipetta di vetro. </li><li> Utilizzando due pinze super-sottili, aprire il lume della PA, facendo attenzione a toccare solo la fine della nave. </li><li> Usando le pinze per tenere i bordi del arteriole parenchimale, tirare con cautela la nave sulla cannula. Tirare abbastanza lontano sulla cannula in modo che la nave non è alla fine molto rastremata della cannula (Figura 3A). </li><li> Allentare le 2 suture sulla cannula e serrarle sulla nave (Figura 3B). Spazio i punti di sutura a parte un po &#39;sul recipiente, e tirare verso l&#39;operatore, mentre tighdieci esso. Assicurarsi che i rami sono legati fuori prima di chiudere l&#39;estremità opposta del arteriole parenchimale. </li><li> Ruotare camera intorno e chiudere l&#39;estremità opposta arteriole parenchimale come un cieco senza uscita. A tal fine, aprire i legami sulla cannula opposto e passarlo sul arteriole. Chiudere lentamente il nodo in modo tale che il arteriole parenchimale sarà legato al lato della cannula. Evitare tratto longitudinale del arteriole. (Figura 3C). NOTA: Se l&#39;obiettivo dello studio è di perfusione farmaci attraverso il lume, incannulare l&#39;estremità opposta invece di legare arteriole parenchimale al lato della cannula. Assicurarsi che le cannule non hanno alcun cristalli di sale o build-up interni che bloccano il flusso endoluminale. Regolare la portata in modo appropriato al fine di mantenere sforzo di taglio entro livelli fisiologici. Uno studio di Shih et al. Mostra portate all&#39;interno penetrante arteriole nei ratti 8, e può servire come guida iniziale per pistudi lotto. </li><li> trasferire accuratamente la camera alla fase del microscopio da utilizzare per la registrazione diametro del vaso. Fissare la camera sul palco microscopio, che collega la sonda di temperatura e di ingresso e le prese per la perfusione ai tubi corretti. Pressurizzare arteriole a 40 mmHg pressione intraluminale per topo arteriole parenchimali o 50 mmHg per arteriole ratto, utilizzando un sistema di pressione disponibile in laboratorio (colonna d&#39;acqua, la pompa peristaltica accoppiato ad un trasduttore di pressione, ecc.). La figura 4D mostra un esempio di un pompa peristaltica accoppiato ad un trasduttore di pressione per pressurizzare il arteriole cannulata. </li><li> Accendere il sistema utilizzato per rilevare variazioni di diametro (Figura 3E). Regolare le impostazioni del microscopio, come illuminazione e contrasto, in modo da ottenere la migliore rilevazione possibile. Idealmente le pareti della arteriole dovrebbero essere scuro e il traslucido lume. Una volta che il rilevamento è opportuno, avviare la registrazione tegli esperimento. </li><li> Avviare il sistema superfusione. Lavare il cannulato, arteriole parenchimale pressurizzato con calda aCSF (37 ᵒ C) contenente 1,8 mM Ca 2+ per 15 a 20 minuti a una portata tra 3 - 5 ml / min. Questo aCSF non deve contenere Diltiazem o BSA. </li><li> Sostituire il regolare aCSF con 60 mm KCl aCSF per valutare la fattibilità della preparazione. A questo punto PAs devono mostrare 10 - 20% costrizione 60 mM KCl. Se il arteriole non si restringono fino a quel punto, rimuovere e cannulate un&#39;altra arteriole. </li><li> Lavare il 60 mm KCl con regolare aCSF. Attendere fino a quando la generazione del tono miogenico spontanea, che potrebbe richiedere fino a un&#39;ora. Se arteriole non ha il tono miogenico da allora, sostituirlo con un altro arteriole. NOTA: Miogenica tono è osservato come una graduale, e talvolta lenta, riduzione del diametro del lume del vaso senza stimolazione da agonisti contrattili o alta soluzione KCl. tono miogenico è calcolata con la seguente Formula: (1 - (diametro del lume attivo / diametro del lume passivo)) x 100 5 Una quantità appropriata di tono miogena può variare in base ai trattamenti, ceppi, specie, transgenici, ecc.. In generale, fisiologico tono miogenico varia da 15 - 30% 5. </li></ol> 4. Esempio di pressione Esperimenti Myography: agonista-indotta costrizione e Miogenica reattività <ol><li> Preparare una serie di diluizioni di un agonista di scelta in aCSF usando concentrazioni appropriate. Per l&#39;esempio attuale è stato utilizzato il trombossano A2 agonista del recettore U46619. Una soluzione stock di 1 ml di U46619 ad una concentrazione di 1 mM è stato preparato. Trasferire 100 microlitri della soluzione 1 mM in una nuova provetta contenente 900 ml di aCSF per fare una diluizione di 10 volte del farmaco, risultante in una soluzione contenente 100 mM U46619. Ripetere questo processo per 6 diluizioni, che vanno da 1 mm fino a 100 nM per preparare una curva constrictor concentrazione-risposta. </li><li> Aggiungi ilintero volume della soluzione contenente l&#39;agonista (1 ml per la prima dose, seguita da 900 ml di tutte le dosi successive) a 100 ml di superfusing aCSF. Questo porterà ad un ulteriore diluizione 100 volte del agonisti. Così, le concentrazioni finali di agonisti nell&#39;intervallo vasca da 10 PM a 10 pM. Lasciare arteriole a incubare per ~ 10 minuti in ciascuna concentrazione, fino a quando il diametro luminale raggiunge uno stato stazionario. </li><li> Lavare l&#39;agonista da superfusing PA con aCSF senza farmaci fino a quando il diametro PA è di nuovo al valore originale. Incubare la arteriole parenchimale a Ca 2+ -free aCSF (senza BSA) supplementato con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA per indurre la massima dilatazione e registrare il diametro passiva del arteriole. </li><li> Rimuovere il arteriole parenchimale dalla cannula tirando con attenzione fuori mentre si tiene nella fine dei legami. Lavare la camera recipiente con acqua deionizzata doppia per rimuovere i detriti e l&#39;eccesso di agonisti. Riempire la camera con Ca2+-free aCSF + BSA e cannulate un&#39;altra arteriole. Non è raccomandato di eseguire più di un esperimento per arteriole. </li><li> Per eseguire un esperimento reattività miogenico, permettono al arteriole parenchimale equilibrare a 40 mmHg della pressione endoluminale fino a quando viene generato il tono miogenico spontanea (sopra descritto). Ridurre la pressione endoluminale di 5 mmHg e consentire PA si stabilizzi per ~ 5 - 10 minuti, fino a quando il diametro luminale raggiunge lo stato stazionario. Aumentare la graduale pressione intraluminale utilizzando l&#39;intervallo di scelta (ad esempio da 5 a 140 mmHg in 20 mmHg incrementi). </li><li> Non esporre il arteriole di pressione endoluminale sotto 5 mmHg, in quanto ciò potrebbe causare il collasso e danneggiare l&#39;endotelio, alterando così i risultati dell&#39;esperimento. </li><li> Alla fine della curva di pressione, superfuse arteriole parenchimale con Ca 2 + -free aCSF (senza BSA) supplementato con 10 mM Diltiazem + 2 mM EGTA e ripetere le operazioni di pressione, a partire dalla lowespressione t. NOTA: Questo darà i diametri passivi della PA, che sono necessarie per calcolare% tono miogenico, definiti dalla formula:% tono = (1 - (diametro attivo / diametro passiva)) x 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

arteriole parenchima cerebrale sono arteriole ad alta resistenza con poche anastomosi e rami che profumato popolazioni neuronali distinti. Questi vasi sanguigni specializzati sono giocatori centrali di autoregolazione cerebrovascolare e accoppiamento neurovascolare attraverso la vasodilatazione mediata astrociti-1. L&#39;importanza di questi vasi sanguigni specializzati nella malattia vascolare cerebrale è noto da circa 50 anni, quando il lavoro pionieristico del Dr. Miller Fisher descritto alterazioni strut...

La circolazione cerebrale è organizzata unicamente per supportare le richieste metaboliche dei neuroni centrali, le cellule che hanno limitato riserve di energia e di conseguenza sono molto sensibili alle variazioni di pressione di ossigeno e di sostanze nutritive necessarie. Come particolari sottopopolazioni neuronali diventa attivo quando vengono eseguite attività specifiche, la vascolarizzazione promuove un aumento altamente localizzato in perfusione per prevenire ipossia locale, e l&#39;esaurimento delle sostanze nutritive 1. Questa è una forma di iperemia funzionale noto come accoppiamento neurovascolare, e dipende dal corretto funzionamento dell&#39;unità neurovascolare, composto di neuroni attivi, astrociti, e le arterie cerebrali 2. Intracerebrale arteriole parenchimali, un gruppo di vasi sanguigni che comprende parenchimale, penetranti e arteriole pre-capillari, sono di importanza fondamentale per questa risposta, ed è quindi fondamentale per studiarli singolarmente al fine di indagare l&#39;accoppiamento neurovascolare 3. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; arteriole parenchimali sono piccole (20 - 70 micron di diametro interno) vasi sanguigni ad alta resistenza che profumato popolazioni neuronali distinti all&#39;interno del cervello. Branching out dalle arterie piali sulla superficie, arteriole parenchimali penetrano nel parenchima cerebrale con un angolo di circa 90 ᵒ per alimentare la microcircolazione sottosuolo (Figura 1). Questi arteriole giocano un ruolo fondamentale nel mantenere adeguata pressione di perfusione in quanto sono i lisci vasi più distali muscolari contenenti proteggono i capillari. In contrasto con la circolazione superficie piale, arteriole parenchimali mancano rami collaterali e anastomosi, e di conseguenza sono &quot;colli di bottiglia&quot; della circolazione cerebrale 4. Come risultato, la disfunzione delle arteriole parenchimali contribuisce allo sviluppo di malattie cerebrovascolari, come le disabilità cognitive vascolari e piccole ictus ischemici (noto anche come ictus silenziosi o cassettoni). studi indicate che la disfunzione del parenchima arteriole può essere indotta da ipertensione essenziale 5, lo stress cronico 6, ed è un evento precoce nella malattia dei piccoli vasi modello di topo genetica 7. Occlusione Inoltre, sperimentalmente indotta singoli arteriole che penetrano nei ratti è sufficiente a causare piccoli colpi ischemici che sono di forma cilindrica, simile a quelli osservati negli esseri umani vecchi 8. In aggiunta a queste distinzioni anatomiche, meccanismi che regolano la funzione contrattile differiscono tra arterie e arteriole piale parenchimali. Vasocostrizione Miogenica è maggiore nelle arteriole parenchimali 9, probabilmente a causa della mancanza di innervazione estrinseca 10, diverse modalità di mechanotransduction 11, e le differenze in intracellulare Ca 2 + Segnalazione 12,13 nelle cellule muscolari lisce vascolari. L&#39;evidenza suggerisce che i meccanismi vasodilatatori endotelio-dipendente differiscono anche tra questi vascusegmenti lar, con arterie parenchimali espositrici maggiore affidamento sui meccanismi che coinvolgono Ca 2+ -activated K + canali e comunicazione elettrotonica all&#39;interno della parete vascolare rispetto ai fattori diffusibili come l&#39;ossido nitrico e prostacicline 14. Pertanto, i dati raccolti in esperimenti usando arterie piali non necessariamente applicarsi a parenchimale arteriole, lasciando una lacuna nella nostra conoscenza di controllo locale della perfusione cerebrale. Nonostante la loro importanza, arteriole parenchimali sono di gran lunga sotto-studiato, principalmente a causa delle sfide tecniche con isolamento e di montaggio per lo studio ex vivo. In questo manoscritto descriviamo un metodo per isolare e cannulare arteriole cerebrali parenchimali, che può essere utilizzato per myography pressione, o per isolare il tessuto per immunomarcatura, elettrofisiologia, biologia molecolare e analisi biochimiche.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

arteriole parenchimali intracerebrali (AP), che comprendono arteriole parenchimali, arteriole penetranti e arteriole pre-capillari, sono i vasi sanguigni ad alta resistenza si ramificano fuori dalle arterie piale e arteriole e le immersioni nel parenchima cerebrale. Individuale PA defluire in un territorio cilindrica discreta del parenchima e neuroni contenuti all&#39;interno. Questi sono arteriole un ruolo centrale nella regolazione del flusso ematico cerebrale sia a livello globale (autoregolazione cerebrovascolare) e locale (iperemia funzionale). PAs sono parte dell&#39;unità neurovascolare, una struttura che corrisponde flusso sanguigno regionale per attività metabolica nel cervello e comprende anche neuroni, interneuroni e astrociti. Perfusione attraverso PA è direttamente collegato con l&#39;attività dei neuroni in quel particolare territorio e gli aumenti di portare il metabolismo neuronale ad un aumento della perfusione locale causata dalla dilatazione del feed PA. Regolamento dei PA differisce da quello di meglio caratterizzatoarterie piali. vasocostrizione pressione indotta è maggiore in PA e meccanismi vasodilatatori variano. Inoltre, PA non ricevono innervazione estrinseca dai nervi perivascolari - innervazione è intrinseca ed indiretta in natura attraverso il contatto con endfeet astrociti. Così, i dati riguardanti il ​​regolamento contrattile accumulati da studi che utilizzano arterie piali non direttamente traducono per comprendere la funzione PA. Inoltre, rimane indeterminata come stati patologici, quali ipertensione e diabete, influiscono struttura PA e reattività. Questo gap di conoscenza è in parte una conseguenza delle difficoltà tecniche relative all&#39;isolamento PA e cannulazione. In questo manoscritto vi presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento e l&#39;incannulamento della PA roditori. Inoltre, mostriamo esempi di esperimenti che possono essere eseguite con queste arteriole, tra costrizione agonisti indotta e reattività miogenico. Anche se il focus di questo manoscritto è in PA incannulazione e myography pressione, isolato PAs può essere utilizzato anche per studi biochimici, biofisici, molecolari, e di imaging.

La figura 5A mostra una costrizione rappresentante PAs topo a 60 mM KCl aCSF per valutare l&#39;integrità del preparato. PAs dovrebbe costringere tra il 15 - 30% in presenza di 60 mM KCl. Se la costrizione è inferiore al 15%, scartare il PA e cannulate altro, in quanto suggerisce che l&#39;arteriole stato danneggiato durante il processo di isolamento e cannulazione. La figura 5B illustra PA ...

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Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Isolamento e Incannulazione di cerebrale parenchimale Arteriole

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K Views.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

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Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

Ricerca

Medicina

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

Endovascular completa e aprire Gestione chirurgica delle malformazioni arterovenose cerebrali

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

Neuroscienze

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

Una valutazione In Vivo di rottura della barriera emato - encefalica in un modello del ratto del colpo ischemico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo Pressurizzato Ippocampo Capillary-Parenchymal Arteriole Preparazione per lo Studio Funzionale

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Isolamento delle arteriole retiniche per studi di fisiologia delle cellule Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Biologia

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Misurazioni simultanee di calcio intracellulare e potenziale di membrana nell'endotelio cerebrale Mouse appena isolato ed intatto

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

Ottimizzazione del metodo di occlusione dell'arteria cerebrale media Longa per la riperfusione completa

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolamento e analisi funzionale dell'endotelio arteriolare del parenchima cerebrale del topo

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparazione dei tubi endoteliali cerebrali dalle arteriole parenchimali di topo

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

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