Name: isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles
Uploaded: 2016-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles at JoVE.com

Funded by NHLBI R01HL091905 (SE), the United Leukodystrophy Foundation CADASIL research grant (FD) and AHA 15POST247200 (PWP). The authors would like to thank Samantha P. Ahchay for providing the image on Figure 1, and Dr. Gerry Herrera, Ph.D., for providing critical comments on the manuscript.

1. 정맥 및 상공 회의소 준​​비 <ol><li> (외경 : 1.2 mm, 내부 직경 : 0.69 mm, 길이 10 mm) 깨끗한 붕규산 유리 모세관을 삽입 백금 필라멘트 (100 μm의 직경)와 피펫 풀러의 홈으로합니다. </li><li> 적절한 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 길고 얇은 팁 (그림 2)와 캐 뉼러를 생성하는 모세관을 당기십시오. 사용되는 설정은 다음과 같습니다 열 - 700, 당겨 - 100, 속도 - 50 시간 - 10. </li><li> 압력 myograph 챔버의 홀더에 캐 뉼러를 삽입합니다. 적절하게 캐 뉼러를 맞 춥니 다. </li><li> 조심 원하는 직경에 대한 해부 현미경 겸자를 사용하여 캐 뉼러의 선단을 깰. 여기서 우리는 10 μm의 팁과 정맥을 (그림 2)를 보여줍니다. </li><li> 1.8 mM의 칼슘을 포함하는 인공 뇌척수액 (ACSF)를 모두 캐 뉼러를 채우기; 1 % 소 혈청 칼슘 - 무료 ACSF와 챔버를 채우기알부민 (BSA) + 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) (모든 용액은 실험 시작 전에 새로운 제조한다). 챔버의 크기에 따라, 5 내지 20 ml의 ACSF 사이의 체적을 변화. 삽관을 시작할 준비가 될 때까지 4 ᵒ C의 챔버를 저장합니다. 참고 : 딜 티아 젬 (Diltiazem)는 삽관을 용이하게 소동맥의 팽창의 원인이됩니다 가역 L 형 전압 게이트 칼슘 억제제이다 </li></ol> 실질 소동맥 2. 분리 <ol><li> 기관의 동물 관리위원회의 승인을 실험실에서 표준 프로토콜을 사용하여 직전 해부에 동물을 안락사. 일반적으로 사용되는 마취제 대뇌 순환 15 혈관 확장 효과를 가질 수 있으므로 바르 비탈 또는 이산화탄소의 사용이 바람직하다. 여기에 표시된 모든 동물의 절차는 기관 동물 관리 및 의학의 네바다 대학의 대학에서 사용위원회의 승인을, 그리고 AG에있다&quot;동물의 관리 및 사용의 기본 원칙&quot;국립 보건원 (National Institutes of Health)와 reement. </li><li> 이산화탄소를 이용하여 동물을 안락사. 잘린하기 전에 동물이 호흡을 중지하고 그것의 발을 장착 할 때 응답하지 않았는지 확인합니다. </li><li> 예리한 가위 (마우스) 또는 길로틴 (쥐)를 사용하여 동물을 참살. 동물의 머리에서 피부를 제거하고 미세 팁 가위를 사용하여 중간 선 두개골 봉합을 따라 절단. 무딘 집게 (마우스) 또는 뼈 플라이어를 사용하여 조심스럽게 두개골 뼈를 제거하고 뇌를 노출합니다. 천천히 조심스럽게 표면 pial 동맥에 손상을주지하기로 뇌를 제거합니다. 얼음에 1 % BSA와 보충 칼슘 - 무료 ACSF 20 ㎖로 채워진 용기에 두뇌를 놓습니다. </li><li> 1 % BSA와 보충 얼음처럼 차가운의 Ca2 + - 무료 ACSF와 패드를 포함하는 해부 접시를 입력하고이 접시 (그림 2A)에 위쪽으로 향하도록 복부 표면과 뇌를 전송합니다. dissec에서 접시를 놓습니다팅 현미경 (그림 3A). 27 게이지 바늘을 사용하여 패드에 머리를 핀. 중간 대뇌 동맥 (MCA) 근처에 핀을 배치 않도록주의하십시오. </li><li> 윌리스와 그것에서 분파 MCA의 원을 현지화. 날카로운 정렬 Vannas 스프링 가위를 사용하여 MCA 주위에 작은 사각형을 잘라. 그 사각형은 MCA의 전체 길이를 통해에서 5mm 가까이 있는지 확인하십시오. 사각형의 상단 부분은 (윌리스,도 2b, 화살표 원에 인접) 윌리스의 원의 분기점을지나해야합니다. </li><li> 3mm - Vannas 스프링 가위를 사용하여, 약 2 조직의 깊이에 언더컷을 수행합니다. 참고 :이 부분은 실질 세동맥의 좋은 절연을위한 핵심이며, 그것은 바로 그걸 얻기 위해 몇 가지 실험이 걸릴 수 있습니다. 절삭 깊이만큼 이루어진 경우 주 단리 실질 세동맥 짧은 것; 상처가 너무 깊은 경우 해부하면 세동맥는 분기점에서 중단 할조직이 제거됩니다. </li><li> 곤충 핀을 사용하여 위쪽으로 (윌리스의 원에서 말단을) 직면 MCA와 해부 접시에 뇌 슬라이스의 가장 선단을 핀. 얕은 절개가 기본 대뇌 피질 (그렇지 않으면 핀이 유지되지 않음)에 너무 깊이 잘라 않도록 조심하면서, 핀 근처 피아을 절감 할 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 작은 집게와 피아의 양쪽을 잡고 피질에서 피아를 풀기 시작합니다. 필요한 경우, 주변 pial 멤브레인이 손상되지 않도록 보장 MCA에 잡아. </li><li> MCA를 포함하는 PIA는 피질에서 나올 때까지 박리 유지합니다. 박리에 대한 저항이 동그라미 윌리스 가까이 증가합니다. 긴 실질 소동맥이 지역에 있기 때문에,이 시점에서 추가주의해야합니다. </li><li> PIA에는 무료되면 (그림 2B)를 아래로 향하게 세동맥을 실질하기 위해 반대면으로 해부 접시에 패드 위에 조심스럽게 놓습니다. </li> &lt;리&gt; Vannas 스프링 가위를 사용하여 용기의 끝이 퉁명스럽게 절단되어 있는지 만드는 MCA에서 무료로 해부 동맥을 잘라. </li><li> 수집 세동맥 압력 myography 분자 분석 또는 기본 평활근 또는 내피 세포의 분리를 위해 사용될 수있다. </li></ol> 3. 압력 Myography <ol><li> 미리 봉합사를 준비합니다. 5mm 조각으로 어두운 녹색 나일론 실을 잘라 페트리 접시에 양면 테이프의 접착면에 배치합니다. 해부 현미경, 미세 집게를 사용하여 필라멘트로 각 부분을 분리, 느슨하게 한쪽 끝을 다른에 필라멘트를 전달하여 간단한 하프 히치 매듭을 준비합니다. </li><li> 집게를 사용하여, 너무 많은 압력을 잡아하지 않도록하고, 양면 테이프 떨어져 매듭을 선택합니다. 캐 뉼러에 목욕 솔루션, 슬라이드 매듭에 봉합사를 당겨 캐 뉼러의 끝에서 거리를 조입니다. 각 정맥에 2 봉합을 가지고이 과정을 반복합니다. </li><li> 유리 코트10 % BSA 용액으로 마이크로 피펫 후 1 % BSA와 보충 칼슘 - 무료 ACSF와 과잉을 씻어. </li><li> 유리 마이크로 피펫으로 용액 50 μl를 당깁니다 실질 세동맥을 당겨 압력 myography 챔버로 전송할 수 있습니다. 유리 마이크로 피펫의 내부 챔버에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 챔버로 실질 세동맥을 분배하는 하나의 유체 움직임에 플런저를 밀어 넣습니다. </li><li> 이 슈퍼 미세 집게를 사용하여, 전용 용기의 끝을 터치에주의하면서 PA의 루멘을 엽니 다. </li><li> 집게를 사용하여 조심스럽게 캐 뉼러에 용기를 당겨 실질 세동맥의 가장자리를 개최합니다. 용기가 캐뉼라 (도 3a)의 가장 테이퍼 된 단부에 있지 않도록 뉼러에 충분히 당긴다. </li><li> 캐 뉼러에 2 봉합을 풀고 용기 (그림 3B)에이를 조입니다. 공간 용기에 따로 봉합 조금하고, 운전자쪽으로 당겨 tigh 동안열을. 어떤 지점이 실질 세동맥의 반대쪽 끝을 닫기 전에 떨어져 연결되어 있는지 확인합니다. </li><li> 주위에 실을 켜고 블라인드 골목으로 실질 세동맥의 반대쪽 끝을 닫습니다. 그것을 달성하기 위해, 반대 정맥의 관계를 열고 세동맥에 그것을 전달합니다. 천천히 실질 세동맥이 캐 뉼러의 측면에 연결되는 것 같은 방법으로 매듭을 닫는다. 세동맥의 길이 방향의 신축성을 피하십시오. (그림 3C). 주 :이 연구의 목적은 루멘을 통해 약을 관류하는 경우, 캐 뉼러의 측면에 실질 세동맥 매 대신 반대쪽 cannulate. 캐 뉼러 어떤 소금 결정 또는 관내 흐름을 차단하는 내부 빌드 업이없는 있는지 확인하십시오. 생리적 수준에서 전단 응력을 유지하기 위해 적절하게 유량을 조절한다. 의 Shih 등.의 연구는 쥐 8 세동맥을 관통 내부의 유량을 보여주고, 파이의 초기 가이드 역할을 할 수 있습니다많은 연구. </li><li> 조심 혈관 직경의 기록에 사용되는 현미경의 스테이지로 챔버를 옮긴다. 올바른 튜​​브 관류에 대한 온도 프로브 및 입구와 출구를 연결, 현미경 무대에 챔버를 연결합니다. (압력 변환기에 결합 연동 펌프 등. 물기둥) 실험실에서 사용할 수있는 가압 시스템을 사용하여 40 mmHg의 관내 마우스 실질 세동맥 압력 또는 쥐 세동맥 50 mmHg로에 세동맥 가압.도 4d는 (A)의 예를 도시 압력 변환기에 연결된 연동 펌프는 유관 세동맥을 가압한다. </li><li> 직경 (그림 3E)의 변화를 감지하는 데 사용되는 시스템을 켭니다. 최상의 검출을 얻기 위해, 이러한 조명 및 콘트라스트 현미경 등의 설정을 조정한다. 이상적으로 세동맥의 벽은 어둡고 루멘 반투명해야한다. 검출이 적절하면, t를 기록하기 시작할그는 실험. </li><li> superfusion 시스템을 시작합니다. 5 ml / 분 - 3 사이의 유량으로 15 분 20 1.8 밀리미터 칼슘 2 + 함유 따뜻한 (37 ᵒ C) ACSF와 유관, 가압 실질 세동맥을 씻으십시오. 이 ACSF는 딜 티아 젬 (Diltiazem) 또는 BSA를 포함 할 수 없습니다. </li><li> 준비의 가능성을 평가하기 위해 60 mM의 KCl을 ACSF와 일반 ACSF를 교체합니다. 60 mM의 KCl을 20 % 수축 -이 시점에서 PA는 10을 전시한다. 세동맥 그 정도로 수축되지 않으면 제거하고 다른 세동맥을 cannulate. </li><li> 일반 ACSF와 60 밀리미터의 KCl을 씻으십시오. 한 시간까지 걸릴 수 자발적인 근육 조직 톤의 생성 때까지 기다립니다. 세동맥 후 근육 조직에서 톤이 없으면 다른 세동맥로 대체. 주 : 근육 조직 톤 수축 효능 제 또는 고의 KCl 수용액에 의한 자극없이 용기의 내강 직경의 점진적인, 때때로 천천히 감소로서 관찰된다. 근육 조직 톤은 다음에 의해 계산된다 Formula : (1 - (활성 루멘 직경 / 수동 내강 직경)) (100) 5 X 근육 조직 톤의 적절한 양 등 치료, 변형, 종의 형질 전환에 따라 다를 수 있습니다.. 30 % (5) - 일반적으로 생리 근육 조직 톤 15 범위. </li></ol> 4. 예 압력 Myography 실험 : 작용 물질에 의한 수축과 근육 조직 반응성 <ol><li> 적절한 농도를 사용하여 ACSF에서 선택의 작용제의 희석 시리즈를 준비합니다. 현재 예를 들어, 트롬 복산로 2 수용체 작용제 U46619 사용 하였다. 1mm의 농도 U46619 1 ㎖의 스톡 용액을 제조 하였다. 전송 100 μM의 U46619를 함유하는 용액에서 얻어진 약물의 10 배 희석액을 만들어 ACSF 900 μl를 함유 한 새로운 튜브에 1 mM의 용액 100 ㎕. 농도 - 반응 곡선 뱀을 조제 1 mM 내지 100 nm의 범위, 6 희석액이 과정을 반복한다. </li><li> 추가ACSF을 superfusing 100 ㎖까지 (이후의 모든 투여 량 900 μL이어서 투여 제 1 ㎖,) 작용제를 함유하는 용액의 전량. 이 작용제의 여분의 100 배 희석으로 이어질 것입니다. 따라서, 10 시부 터 10 μM에 목욕 범위에서 작용제의 최종 농도. 내강 직경이 정상 상태에 도달 할 때까지, 세동맥 ~은 각 농도의 10 분 배양 허용. </li><li> 펜실바니아 직경이 다시 원래 값으로 될 때까지 어떤 약물없이 ACSF와 보호 지역을 superfusing하여 효능을 씻으십시오. 최대 팽창을 유도하고 세동맥의 수동 직경을 기록하는 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) + 2 밀리미터 EGTA 보충 (BSA)없이 칼슘 2 + - 무료 ACSF의 실질 세동맥을 품어. </li><li> 조심스럽게 관계의 끝으로 잡고 그것을 잡아 당겨 캐 뉼러의 실질 세동맥을 제거합니다. 파편과 효능의 과잉을 제거하기 위해 두 번 탈 이온수로 선박 챔버를 씻으십시오. 칼슘과 챔버를 채우2 + - 무료 ACSF + BSA와는 다른 세동맥을 cannulate. 세동맥 당 하나 이상의 실험을 수행하지 않는 것이 좋습니다. </li><li> 근원 성 반응성 실험을 수행하기 위해, 자연 근원 성 톤 (전술)가 생성 될 때까지 실질 세동맥 40 mmHg의 관내 압력 평형을 허용한다. 내강 직경이 정상 상태에 도달 할 때까지 10 분 - 5 mmHg로로 관내 압력을 줄이고 PA가 ~ 5 평형을 허용한다. (20 mmHg로 단위로 5 ~ 140 mmHg로에서 예를 들어) 선택의 간격을 이용하여 관내 압력을 단계적으로 증가한다. </li><li> 그 때문에 실험의 결과를 변경, 내피를 붕괴의 원인과 손상시킬 수 있으므로, 5 mmHg로 아래 관내 압력에 세동맥을 노출시키지 마십시오. </li><li> 압력 곡선의 끝에서, lowes부터 10 μM 딜 티아 젬 (Diltiazem) + 2 mM의 EGTA 보충 칼슘 (BSA)없이 2 + -free ACSF와 실질 세동맥을 superfuse와 가압 단계를 반복t 압력. 주 :이 식으로 정의 % 근육 조직 계조를 계산하는 데 필요한 PA의 수동 직경을 줄 것이다 % 톤 = (1 - (직경 활성 / 비활성 직경)) × 100. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

대뇌 실질 소동맥은 별개의 신경 세포 인구를 관류 몇 문합, 분기와 고 저항 세동맥입니다. 이러한 전문 혈관 성상 세포 매개 성 혈관 확장 (1)을 통해 뇌 혈관 자동 조절 및 신경 혈관 커플 링의 중심 선수입니다. 뇌 혈관 질환에서 이러한 전문 혈관의 중요성은 박사 밀러 피셔의 선구적인 작품은 고혈압 환자 사후 16의 뇌에서 열공 경색의 영토 내에서 실질 동맥의 구조 변경...

대뇌 순환 고유 중추 신경 에너지 저장소를 한정 산소 압력과 필요한 영양분 공급의 변화에​​ 따라서 매우 민감 한 세포의 대사 요구 사항을 지원하도록 구성된다. 특정 작업을 수행 할 때 특히 신경 개체군이 활성화 될 때, 혈관 지역 저산소증과 영양분 1의 고갈을 방지하기 위해 관류에 매우 지역화 증가를 촉진한다. 이것은 활성 뉴런, 아스트로 사이트, 및 뇌동맥이 이루어지는, 신경 혈관 결합이라고도 충혈 기능의 한 형태이며, 신경 혈관 장치의 적절한 작동에 의존한다. 뇌내 실질 세동맥은 혈관 실질 포괄 관통 전 모세관 세동맥의 그룹은,이 응답에 대한 중앙 중요하며, 이는 신경 혈관 커플 링 (3)을 조사하기 위해 개별적으로 학습하는 다음 중요하다. &lt;뇌 내에서 뚜렷한 신경 인구를 관류 - (70 μm의 내경 20) 고 저항 혈관 P 클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 실질 소동맥은 작다. 표면에 pial 동맥으로부터 분기, 실질 세동맥은 지하 미세 (그림 1)을 공급하기 위해 거의 90 ᵒ 각도로 뇌 실질에 침투. 이 동맥은 모세관 보호 가장 후방 평활근 함유 혈관과 마찬가지로 적절한 관류 압력을 유지하는 데 중요한 역할을한다. 표면 pial 순환 달리 실질 세동맥 담보 지점과 문합이 부족하고, 그 결과 뇌 순환 (4)의 &quot;병목 현상&quot;이다. 이 결과, 실질 세동맥의 혈관 장애는인지 손상 및 작은 허혈성 뇌졸중 (또한 자동 또는 열공 스트로크로 알려진)와 같은 뇌 혈관 질환의 발전에 기여한다. 연구 indicat전자가 실질 동맥 부전은 본 태성 고혈압 (5), 만성 스트레스 (6)에 의해 유도, 작은 혈관 질환 유전 마우스 모델 7의 초기 이벤트입니다 수 있습니다. 쥐 단일 관통 세동맥의 추가의 실험적 유도 폐색 이전 인간 8에서 관찰되는 원통형, 유사한 작은 허혈성 뇌졸중을 야기하기에 충분하다. 이러한 해부학 적 차이에 더하여, 수축 기능을 조절하는 메커니즘 pial 동맥 및 실질 세동맥 사이에서 다르다. 근육 조직 수축이 가능하기 때문에, 혈관 평활근 세포에서 세포 내 신호 전달 12,13 CA의 외인성 신경 분포 10 mechanotransduction (11)의 고유 모드와 다름이 부족 2+, 실질 세동맥 9 크다. 증거는 내피 세포 의존성 혈관 확장 메커니즘은 이러한 vascu 사이에 차이가 있음을 시사한다칼슘을 포함하는 메커니즘에 더 의존을 나타내는 실질 동맥과 LAR 세그먼트는, 이러한 산화 질소와 prostacyclins (14) 확산 요인에 비해 혈관 벽에서 K + 채널과 electrotonic 통신을 부활. 따라서, 데이터는 뇌 관류의 로컬 제어에 대한 지식의 격차를 떠나, 반드시 세동맥을 실질에게 적용되지 않을 수도 있습니다 pial 동맥을 사용하여 실험에 모였다. 그 중요성에도 불구하고, 실질 동맥은 주로 인해 분리 및 생체 연구 실장과 기술적 인 도전에, 아래에 연구 된 광대입니다. 이 논문에서는 분리 압력 myography 사용될 수 있거나 immunolabeling, 전기 생리학, 분자 생물학 및 생화학 적 분석을위한 조직을 분리하는 뇌 실질 세동맥을 cannulate하는 방법을 설명한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Artificial Cerebrospinal Fluid&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S-640</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>MgCl Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-8266</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2870</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Isolation/Cannulation&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Super Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Wiretrol 50 &amp;mu;l</td><td>VWR Scientific</td><td>5-000-1050</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;mu;m Sterile Syringe Filter</td><td>VWR Scientific</td><td>28145-477</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm</td><td>Sutter Instruments</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Dark Green Nylon Thread</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Linear Alignment Single Vessel Chamber</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>CH-1-LIN</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>PS-200</td><td></td></tr><tr><td>Video Dimension Analyzer</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>VDA-10</td><td></td></tr><tr><td>Four Channel Recorder with LabScribe 3 Recording and Analysis Software</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DAQ-IWORX-404</td><td></td></tr><tr><td>Heating Unit</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>Automatic Temperature Controller</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324B</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cannulation of cerebral parenchymal arterioles

실질 소동맥, 관통 소동맥 및 사전 모세관 세동맥을 포함 뇌내 실질 세동맥 (PA는), 뇌 실질에 pial 동맥과 소동맥과 다이빙에서 밖으로 분기 높은 저항 혈관이다. 개별 PA는 실질의 개별 원통형 영역 및 포함 된 뉴런 관류. 이 동맥은 국소 뇌 혈류량 모두 전역 (뇌 자동 조절) 및 (기능 충혈)의 조절에서 중요한 플레이어이다. 전력 증폭기는 신경 혈관 부 뇌 내의 대사 활동 지역 혈류 일치하는 구조의 일부이며 또한 신경의 interneurons 및 성상 세포를 포함한다. 학부모 협의회를 통해 관류 직접 공급 PA의 팽창에 의한 지역 관​​류의 증가에 특정 지역에서 신경 세포 및 신경 세포의 신진 대사를 리드 증가의 활동에 연결되어 있습니다. 보호 지역의 규제는 더 나은 특징의 차이가pial 동맥. 압력에 의한 혈관 수축은 보호 지역에 크고 혈관 확장 메커니즘은 다양합니다. 또한, PA는 혈관 주위 신경에서 외부 신경 분포를받지 않습니다 - 신경 분포가 성상 세포 endfeet와의 접촉을 통해 고유의 자연에 간접적이다. 따라서, pial 동맥을 사용하여 연구에 의해 축적 된 수축 규제에 관한 데이터를 직접 PA 기능을 이해하는 번역하지 않습니다. 고혈압과 당뇨병과 같은 병적 인 상태는, PA 구조와 반응성에 미치는 영향 또한, 확인되지 않은 남아있다. 이 지식 격차는 부분적으로 PA 분리 및 삽관에 관한 기술적 인 문제의 결과이다. 이 논문에서 우리는 고립과 설치류 보호 지역의 삽관을위한 프로토콜을 제시한다. 또한, 우리는 작용제에 의한 수축과 근육 조직 반응성을 포함하여 이러한 세동맥, 수행 할 수있는 실험의 예를 보여줍니다. 이 논문의 초점은 PA 삽관 및 압력 myography에 있지만, PA 고립S는 또한, 생물 리 학적, 생화학, 분자, 및 이미징의 연구에 사용될 수있다.

도 5a는 준비의 무결성을 평가하기 위해 60 mM의 KCl을 ACSF에 마우스 학부모 협의회의 대표 수축을 보여줍니다. 60 밀리미터의 KCl의 존재 하에서 30 % - 전력 증폭기 (15) 사이에 수축한다. 협착이 15 % 미만이면, PA 버리고는 세동맥이 단리 삽관 과정에서 손상되었음을 알 수 있듯이, 다른 하나 cannulate. 도 5b는</strong...

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Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

분리 및 대뇌 실질 세동맥의 캐 뉼러

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

isolation-and-cannulation-of-cerebral-parenchymal-arterioles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.6K 조회수.  University of Nevada School of Medicine. This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

비디오: Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow (ischemia) 1. Middle cerebral artery (MCA) delivers a great majority of blood to the lateral surface of the cortex 2, is the most common site of human stroke 3, and ischemia within its territory can result in extensive dysfunction or death 1,4,5. Survivors of ischemic stroke often suffer loss or disruption of motor capabilities, sensory deficits, and infarct. In an effort to capture these key characteristics of stroke, and thereby develop effective treatment, a great deal of emphasis is placed upon animal models of ischemia in MCA.
Here we present a method of permanently occluding a cortical surface blood vessel. We will present this method using an example of a relevant vessel occlusion that models the most common type, location, and outcome of human stroke, permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). In this model, we surgically expose MCA in the adult rat and subsequently occlude via double ligature and transection of the vessel. This pMCAO blocks the proximal cortical branch of MCA, causing ischemia in all of MCA cortical territory, a large portion of the cortex. This method of occlusion can also be used to occlude more distal portions of cortical vessels in order to achieve more focal ischemia targeting a smaller region of cortex. The primary disadvantages of pMCAO are that the surgical procedure is somewhat invasive as a small craniotomy is required to access MCA, though this results in minimal tissue damage. The primary advantages of this model, however, are: the site of occlusion is well defined, the degree of blood flow reduction is consistent, functional and neurological impairment occurs rapidly, infarct size is consistent, and the high rate of survival allows for long-term chronic assessment.

Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection

We describe a highly reproducible method for the permanent occlusion of a rodent major cerebral blood vessel. This technique can be accomplished with very little peripheral damage, minimal blood loss, a high rate of long-term survival, and consistent infarct volume commensurate with the human clinical population.

영구적 인 뇌 혈관 폐색<em&gt;를 통해</em&gt; 더블 합자 및 절개

Stroke is a leading cause of death, disability, and socioeconomic loss worldwide. The majority of all strokes result from an interruption in blood flow ...

연구

의학

Comprehensive Endovascular and Open Surgical Management of Cerebral Arteriovenous Malformations

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs must be tailored specifically to the lesion, with surgical resection being the gold standard for small, accessible lesions. Pre-operative embolization of AVMs can reduce nidal blood flow and remove high-risk AVM features such as intranidal or venous aneurysms, thereby simplifying a challenging neurosurgical procedure. Herein, we describe our approach for the staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and highlight the advantages of having a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team. This includes planning the craniotomy and resection to immediately follow the final embolization stage, thereby using a single session of anesthesia for aggressive embolization, and rapid resection. Finally, we provide a representative case of a 22-year-old female with an unruptured right frontal AVM diagnosed during a seizure workup, who was successfully treated via staged embolizations followed by open surgical resection.

Surgery is the gold standard for accessible arteriovenious malformations (AVMs), and pre-operative embolization can simplify this procedure. We describe our approach for staged endovascular embolization and open resection of AVMs, and provide a representative clinical example highlighting the advantages of a comprehensively trained neurovascular surgeon leading a multi-disciplinary clinical team.

포괄적인 혈관 내 수술 및 대뇌 Arteriovenous 기형의 오픈 외과 관리

Arteriovenious malformations (AVMs) are associated with significant morbidity and mortality, and have a rupture risk of ~3% per year. Treatment of AVMs ...

신경과학

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other vessels), and describes techniques for evaluating tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry (LDF) and microvessel density utilizing fluorescently labeled Griffonia simplicifolia (GS1) lectin. Current methods for studying isolated resistance arteries at transmural pressures encountered in vivo and in the absence of parenchymal cell influences provide a critical link between in vivo studies and information gained from molecular reductionist approaches that provide limited insight into integrative responses at the whole animal level. LDF and techniques to selectively identify arterioles and capillaries with fluorescently-labeled GS1 lectin provide practical solutions to enable investigators to extend the knowledge gained from studies of isolated resistance arteries. This paper describes the application of these techniques to gain fundamental knowledge of vascular physiology and pathology in the rat as a general experimental model, and in a variety of specialized genetically engineered &#34;designer&#34; rat strains that can provide important insight into the influence of specific genes on important vascular phenotypes. Utilizing these valuable experimental approaches in rat strains developed by selective breeding strategies and new technologies for producing gene knockout models in the rat, will expand the rigor of scientific premises developed in knockout mouse models and extend that knowledge to a more relevant animal model, with a well understood physiological background and suitability for physiological studies because of its larger size.

This manuscript describes in vitro video microscopy protocols for evaluating vascular function in rat cerebral resistance arteries. The manuscript also describes techniques for evaluating microvessel density with fluorescently labeled lectin and tissue perfusion using Laser Doppler Flowmetry.

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

Ex Vivo Pressurized Hippocampal Capillary-Parenchymal Arteriole Preparation for Functional Study

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and cardiac arrest are remarkably sexually dimorphic diseases, and both induce cerebral ischemia. However, progress in understanding the vascular cognitive impairment, and then developing sex-specific treatments, has been partly limited by challenges in investigating the brain microcirculation from mouse models in functional studies. Here, we present an approach to examine the capillary-to-arteriole signaling in an ex vivo hippocampal capillary-parenchymal arteriole (HiCaPA) preparation from mouse brain. We describe how to isolate, cannulate, and pressurize the microcirculation to measure arteriolar diameter in response to capillary stimulation. We show which appropriate functional controls can be used to validate the HiCaPA preparation integrity and display typical results, including testing potassium as a neurovascular coupling agent and the effect of the recently characterized inhibitor of the Kir2 inward rectifying potassium channel family, ML133. Further, we compare the responses in preparations obtained from male and female mice. While these data reflect functional investigations, our approach can also be used in molecular biology, immunochemistry, and electrophysiology studies.

The present manuscript details how to isolate hippocampal arterioles and capillaries from the mouse brain and how to pressurize them for pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

From subtle behavioral alterations to late-stage dementia, vascular cognitive impairment typically develops following cerebral ischemia. Stroke and ...

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the choroidal vessels supply the photoreceptors. Alterations in retinal perfusion contribute to numerous sight-threatening disorders, including diabetic retinopathy, glaucoma and retinal branch vein occlusions. Understanding the molecular mechanisms involved in the control of blood flow through the retina and how these are altered during ocular disease could lead to the identification of new targets for the treatment of these conditions. Retinal arterioles are the main resistance vessels of the retina, and consequently, play a key role in regulating retinal hemodynamics through changes in luminal diameter. In recent years, we have developed methods for isolating arterioles from the rat retina which are suitable for a wide range of applications including cell physiology studies. This preparation has already begun to yield new insights into how blood flow is controlled in the retina and has allowed us to identify some of the key changes that occur during ocular disease. In this article, we describe methods for the isolation of rat retinal arterioles and include protocols for their use in patch-clamp electrophysiology, calcium imaging and pressure myography studies. These vessels are also amenable for use in PCR-, western blotting- and immunohistochemistry-based studies.

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

This manuscript describes a straightforward protocol for the isolation of arterioles from the rat retina that can be used in electrophysiological, calcium imaging and pressure myography studies.

Ex Vivo 세포 생리학 연구에 대 한 망막 Arterioles의 절연

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

생물학

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

세포내 칼슘과 갓 고립과 그대로 마우스 대뇌 피에 막 잠재력의 동시 측정

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Optimization of the Longa Middle Cerebral Artery Occlusion Method for Complete Reperfusion

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three decades, its standardization remains inadequate. Predominantly conducted on rats and mice, the procedure poses challenges due to mice's smaller and more fragile nature. Unlike the Koizumi common carotid artery method, the Longa external carotid artery is the sole intraluminal filament stroke model ensuring complete reperfusion post-ischemia. This aspect holds critical significance for studies investigating reperfusion phenomena. The surgical modifications demonstrated in this article ensure continuous blood flow from the common carotid artery throughout the ischemic phase and after the reperfusion onset. The goal of these modifications is to selectively occlude the middle cerebral artery by keeping the perfusion uninterrupted in branches proximal to the middle cerebral artery during the ischemia period. Furthermore, the onset of reperfusion is sudden and can be precisely controlled, thereby modeling endovascular thrombectomy in human medicine more accurately. Our aim in presenting this comprehensive video article is to ease the training of new surgeons and promote the standardization of surgical procedures within the scientific community.

This protocol presents a step-by-step guide for researchers to perform the middle cerebral artery occlusion procedure on mice using the modified Longa external carotid artery method. Modifications presented in this article aim to increase the accuracy of middle cerebral artery occlusion and ensure complete reperfusion.

완전한 재관류를 위한 Longa Middle Cerebral Artery Occlusion 방법의 최적화

The middle cerebral artery occlusion model serves as the primary animal model for studying ischemic stroke. Despite being used in research for over three ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

마우스 뇌 실질의 동맥 내피의 분리 및 기능 분석

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Source: Hakim, M. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/63463">Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles(쥐 실질 세동맥에서 대뇌 내피관 준비)

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1.&#160;Solutions and drugs

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