Name: in vitro transcription assays and their application in drug discovery
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Cuidado: As experiências envolvem o uso do isótopo radioactivo 32 P e nenhum trabalho deve ser realizado até que tenham sido cumpridas todas as condições de segurança adequadas. Geralmente são necessárias de pessoal para participar de um curso de segurança e submetidos a prática supervisionada antes experimentos utilizando reagentes radioativos. Por favor, usar equipamento de proteção individual (dosímetro termoluminescente, óculos de segurança, luvas, sala de radiação jalecos, calças de comprimento total, fechou-toe sapatos) ao realizar a reação. 1. Preparação de Materiais de Ensaio <ol><li> Obter a proteínas necessárias para o ensaio de transcrição. <ol><li> Para o experimento descrito aqui, produzir mais e purificar E. coli RNAP em laboratório, conforme descrito 11, ou obter a partir de uma fonte comercial (Lista de Materiais). Nota: Ambos fornecem resultados semelhantes. Outros métodos para purificação de RNAP nativo ou de afinidade marcado pode também ser usado 12,13. / factores nusa Sigma pode ser obtido sob a forma described em trabalhos anteriores 14,15. </li></ol></li><li> Água Preparação de dietil pirocarbonato (DEPC) tratados Nota: Como alternativa, água RNase-livre pode ser obtida a partir de fontes comerciais (lista de materiais). <ol><li> Adicionar 1 ml de pirocarbonato de dietilo (DEPC) a 1 L de água purificada (0,1% v / v) e misturar durante a noite. </li><li> água DEPC autoclave e dicas duas vezes. </li></ol></li><li> Template Preparação DNA <ol><li> Purifica-se o plasmídeo pSG1154 16 e / ou 17 pIA226 utilizando um kit de purificação de plasmídeo (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Para amplificar o molde para ensaios de transcrição run-off (um fragmento de 360 pb que abrange a região do promotor xil a P), montar uma reacção de PCR em gelo incluindo 25 ul mistura 2x PCR (Lista de Materiais), 2 ul de cada um dos iniciadores (5? M) : 5&#39;-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 &#39;(directo) e 5&#39;-CCCATTAACATCACCATC-3&#39; (inverso), 1 ul de plasmídeo pr pSG1154eparation (250 uM) e 20 ul de água purificada). <ol><li> Ou, em alternativa, para os ensaios individuais transcrição redondas, amplificar um fragmento de 447 pb abrangendo a região R promotor λ P de pIA226 17. Defina-se uma reacção de PCR em gelo utilizando 25 ul de mistura de PCR 2x, 2 ul de cada um dos iniciadores (5 uM): 5&#39;-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 &#39;(directo) e 5&#39;-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3&#39; (inverso), 1 ul pIA226 17 preparação de plasmídeo (250 uM) e 20 ul de água purificada). Nota: Este modelo carece de citosina até que a posição nt 26, que é o dia 26 nucleótidos a partir do sítio do início da transcrição. Por isso, a transcrição utilizando este molde irá permitir a iniciação, a liberação de promotor e parando no nt 26 de modo a formar um complexo estável alongamento transcrição (CE) quando apenas ATP, UTP e GTP estão presentes na reacção. </li></ol></li><li> Defina-se uma reacção de PCR com as seguintes condições: 95 °; C durante 30 seg, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, repetindo-se durante 30 ciclos. </li><li> Purifica-se o produto utilizando um kit de PCR clean-up (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante e elui-se em 100 ul de tampão de transcrição para o ensaio de transcrição. </li><li> Determinar a concentração de DNA modelo usando um fluorospectrometer (Lista de Materiais). </li></ol></li><li> NTP Preparação Nota: os NTP pode ser obtido de diferentes fontes comerciais (lista de materiais). <ol><li> Dissolve-se os NTP (≥99% de pureza) em água tratada com DEPC para fazer um estoque H, alíquota de 1 ml da solução em tubos de 1,5 ml (50 ul em cada tubo) e armazenar a -20 ° C. </li><li> Pedido α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) antes da experiência. 32 P tem uma meia-vida curta de 14,29 dias. Nota: O uso de UTP marcados com alfa evita comparação da intensidade das bandas com comprimento diferente. </li></ol></li><li> Preparação de ARN Escada <ol><li> Monte o following de reacção à temperatura ambiente: 0,5 ug de ARN mistura Molde (Lista de Materiais), 80 mM de HEPES tampão a pH 7,5, MgCl 2 12 mM, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM / CTP / GTP, UTP 0,5 mM, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 mL T7 RNAP (Lista de Materiais), DEPC-água tratada a 20 l. </li><li> Permitir a reacção prosseguir a 37 ° C durante 1 h. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de RNA Gel Sequencial <ol><li> Preparação gel <ol><li> Limpar as placas de um aparelho de gel de sequenciação (Lista de Materiais) duas vezes com etanol a 70% e água purificada, e montar a célula com um pente e dois espaçadores. Nota: Uma placa pode ser revestida com reagente de siliconização (Lista de Materiais) para facilitar a remoção de gel no passo 4.2. </li><li> Dissolve-se 33,6 g de ureia em 22 ml de água e 16,4 ml de / borato / EDTA (TBE) de tampão (54 g de tris (hidroximetil) aminometano 5x Tris; 27,5 g de ácido bórico, 10 ml de ácido etilenodiaminotetra-acético 1 M (EDTA), pH 7,4, em 1 L de água) utilizando um agitador magnético. </li><li> Adicionar 16 ml de solução a 40% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) à solução de ureia e filtrar através de um filtro de 0,45 um. </li><li> Adicionar 514 ul de 10% (w / v) recém-preparada de persulfato de amónio em água seguido por 51,4 ​​uL de N, N, N &#39;, N&#39; tetrametiletilenodiamina (TEMED) à solução filtrada. </li><li> Inverta suavemente a solução de gel para evitar a aeração excessiva e injectar imediatamente e sem problemas para dentro da célula seqüenciamento pré-embalados colocada na horizontal a partir do furo de injecção inferior. Tome cuidado para evitar fazer bolhas durante a injeção. </li><li> Permitir 1-1,5 horas até que o gel é completamente definido antes da sua utilização num ensaio de transcrição. O gel pode ser armazenada à temperatura ambiente durante dois ou três dias, quando envolvido com tecido molhado em água na parte superior da célula de sequenciação. </li></ol></li></ol> Reação 3. Transcrição <ol><li> Transcrição Alongamento Pausa Assay <ol><li> A formação de um complexo de transcrição alongamento <ol><li> Adicionar 1 ml de enzima núcleo RNAP (1? M de ações em tampão de transcrição) para um tubo de 1,5 ml. </li><li> Adicionar 1 ml de factor de Sigma-purificada 70 (σ 70; 3 uM em tampão da transcrição) para o RNAP e incubar em gelo durante 10 min para formar RNAP holoenzima. </li><li> Adiciona-se 3 ul de 500 nM ADN molde purificado (λ promotor P R a partir do produto de PCR pIA226) em tampão de transcrição para a holoenzima RNAP e incubar a 37 ° C durante 5 minutos para formar o complexo aberto. </li><li> Prepara-se uma mistura de componentes de reacção na outra tubo de 1,5 ml utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais: 400 mM de Tris-HCl, 1,6 M de KCl, MgCl2 100, 10 mM de DTT, 50% de glicerol, pH 7,9 em tratada com DEPC água), 2 ul de 250 uM cada de GTP e UTP, 1 ul de ATP 1 mM e 1 uL de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 41 mL. NãoTE: inibidor de RNase (Lista de Materiais) pode ser utilizada para minimizar a contaminação com RNase. </li><li> Transferir a solução de mistura para o tubo contendo o complexo aberto e incubar a 37 ° C durante 15 minutos para formar o complexo de transcrição alongamento parou em 26 nt. </li><li> Mover a reacção até à temperatura ambiente (~ 21 ° C) e adicionar 1 ul de 2,5 mg / ml de rifampicina a uma concentração final de 50 ug / ml. </li><li> Adicionar 1 ml de 0.1 mM purificados NusA à mistura reaccional e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 ul de 250 uM de CTP na mistura de reacção para fazer um volume final de 50 ul e medir o tempo de reacção, utilizando um temporizador. </li><li> Transferência de 5 ul da solução de reacção em 2 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) a 30, 60, 120, 240, 480, 1200 e seg para extinguir a reacção. </li><li> Descarte as pontas 32 ​​P UTP e tubos em um cont resíduos radioactivosainer. </li></ol></li></ol></li><li> Transcrição Iniciação Assay <ol><li> Formação do complexo aberto <ol><li> Diluir purificada σ 70-0,5 uM. </li><li> Repita os passos 3.1.1.1 a 3.1.1.3 utilizando 0,5 mM (em vez de 3 M) purificada σ 70, e do modelo de DNA (região promotora xil o P de produto pSG1154 PCR). </li></ol></li><li> Ensaio de inibição da iniciação da transcrição <ol><li> Adicionar o inibidor concebido para evitar a formação de RNAP holoenzima a enzima RNAP núcleo antes da adição de σ 70 (depois do passo 3.1.1.1), seguido por passos de 3.1.1.2 e 3.1.1.3 examinar se o inibidor é capaz de interromper a formação holoenzima. </li><li> Alternativamente, após a etapa 3.1.1.2, adicione o inibidor para examinar se é capaz de inibir competitivamente σ 70 ligação a RNAP. </li><li> Usar a mesma quantidade de DMSO, o solvente do inibidor, em vez de o inibidor staque nas reacções de controlo. </li></ol></li><li> A conclusão da reacção <ol><li> Dissolve-se heparina em água até uma concentração de estoque de 1 mg / ml e estoque a -20 ° C. Nota: A heparina é um concorrente do DNA que podem sequestrar RNAP que não formou um complexo aberto. Uma vez que o complexo aberto é formado, a heparina não pode entrar no local da ligação do DNA de RNAP e inibir a transcrição a partir do complexo aberto pré-formado. Portanto, a heparina só é necessária para os ensaios rodada único; ele não é necessário para os ensaios multi-redondas. </li><li> Preparar a mistura de reacção utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais), 1 ul de uma solução de heparina mg / ml, 1 ul de 10 mM de cada de ATP, GTP, CTP e UTP 2,5 mM, e 1 ul de 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 45 mL. </li><li> Misturar a mistura de reacção com o complexo de transcrição aberta, rotação do pulso e incubar a 37 ° C durante 20 min. </li><li> Transferir 10 uL da reacção assimlução em 5 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) para extinguir a reacção. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. duração e Desenvolvimento RNA Gel <ol><li> Executando o gel de poliacrilamida de desnaturação <ol><li> Submeter o gel a 50 ° C e 50 W, em tampão 1 x TBE durante aproximadamente 1,5 horas até que a temperatura do gel e o tampão é estável a 50 ° C. </li><li> Amostras de calor a 90 ºC durante 30 segundos e movê-los em gelo carregamento antecipado no gel. </li><li> amostras de carga nas cavidades sobre o topo do gel ao lado de uma faixa contendo 2 ul escada de ARN (diluição 1: 100). </li><li> Submeter o gel a 50 W e 50 ºC em tampão 1x TBE até que o corante azul de bromofenol atinge ~ 2/3 para baixo do gel. </li></ol></li><li> Tratamento gel <ol><li> Abrir lentamente e cuidadosamente separar a placa superior da célula de sequenciação. Tome muito cuidado para evitar a quebra do gel. </li><li> chromatograp CutHY papel (Lista de Materiais) para coincidir com o tamanho do gel a partir do topo para o corante azul de bromofenol. Utilizar um contador Geiger para confirmar a posição aproximada dos transcritos de RNA marcados radioactivamente. </li><li> cobrir cuidadosamente o gel com o papel de filtro, e pressione com firmeza até que o gel adere ao papel de filtro. Cortar e descartar o fundo do gel de resíduos radioactivos como os PNT não incorporados correr para o fundo do gel, que pode ser muito quente. </li><li> Coloque um pedaço de tamanho semelhante de papel de filtro sobre a cama de secagem de uma máquina de vácuo de secagem, e colocar cuidadosamente o papel revestido de gel para ele com o lado gel para cima. </li><li> Cobrir o gel com uma película de plástico e seco a 60 ° C durante 1,5 h. </li><li> Envolver o outro lado do papel de filtro de gel revestido com película de plástico, e colocar em uma placa de fósforo fotoestimuláveis ​​no caso de imagem, com o tempo de exposição apropriado, que pode variar de 1 hora a durante a noite, dependendo da eficiência da reacção. </li><li> Imagem da placa de fósforo usandoum scanner gerador de imagens de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a intensidade da banda relativa usando software ImageJ de acordo com o manual do software. </li><li> Use um contador Geiger para verificar a contaminação radioactiva na área de trabalho, limpe os itens suspeitos e área com tecido e um agente de limpeza e descarte o lenço no recipiente de descarte. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Em todos os organismos, a transcrição é um processo fortemente regulado. Os ensaios in vitro de transcrição têm sido desenvolvidos para proporcionar uma plataforma para testar os efeitos de factores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores da transcrição. Neste trabalho método, foi descrito um ensaio para a transcrição bacteriana geral. ensaios de transcrição combinados com eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos são muito importantes para estudos sobre os mecanismo...

A transcrição é o processo em que o ARN é sintetizado a partir de um molde de ADN específica. Em células eucariotas, existem três RNAPs distintas: eu RNAP transcreve precursores de rRNA, RNAP II é responsável pela síntese de ARNm e de certos RNAs nucleares pequenos, e a síntese de rRNA 5S e tRNA é realizada por RNAP III. Em bactérias, existe apenas uma RNAP responsável pela transcrição de todas as classes de ARN. Existem três fases de transcrição: iniciação, alongamento e terminação. A transcrição é um dos processos mais altamente reguladas na célula. Cada etapa do ciclo de transcrição representa um ponto de verificação para a regulação da expressão do gene 1. Para a iniciação, RNAP tem de se associar com um factor sigma para formar holoenzima, o que é necessário para dirigir a enzima para locais específicos chamados promotores de 2 para formar um complexo promotor aberta. Posteriormente, um grande conjunto de fatores de transcrição são responsáveis ​​pela regulação oatividades f RNAP durante as fases de alongamento e terminação. O fator de transcrição aqui examinado é a proteína altamente conservada e essencial, Nusa. Ele está envolvido na regulação da transcrição e a pausa de terminação, bem como anti-terminação durante a síntese de rRNA 3-5. Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos como poderosas ferramentas para estudar os passos de regulação complexos durante a transcrição 6. Em geral, um fragmento linear de ADN incluindo uma região promotora é necessária como molde para a transcrição. O molde de ADN é normalmente gerado por PCR ou por linearização um plasmídeo. proteínas e os NTP (incluindo uma NTP marcado radioactivamente para fins de detecção) purificados são então adicionados e produto analisado a seguir ao período de incubação necessário. Usando modelos apropriados e condições de reacção, todas as etapas de transcrição foram examinadas utilizando esta abordagem, o que permitiu a caracterização molecular detalhada da transcription ao longo do último meio século 7. Em combinação com a informação sobre a estrutura 3-dimensional da RNAP Também foi possível investigar o mecanismo molecular da inibição da transcrição pelos antibióticos e conduz a antibióticos, e utilizar essa informação para o desenvolvimento de novas e melhores drogas 8-10. Neste trabalho fornecem exemplos de como ensaios de transcrição pode ser usada para determinar o mecanismo de regulação da transcrição por alongamento / factor de terminação NusA, e a forma como o mecanismo de acção de um inibidor da ligação de iniciação da transcrição podem ser determinados novos.

<table><tbody><tr><td>Obtain the proteins required for transcription assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; RNAP</td><td>Epicentre</td><td>S90250</td><td></td></tr><tr><td>Preparation of DEPC-treated water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>diethyl pyrocarbonate (DEPC)&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free water&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion Nuclease-Free Water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>DNA template preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&amp;nbsp;Plus&amp;nbsp;SV Minipreps DNA Purification System</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td></td></tr><tr><td>ACCUZYME Mix</td><td>Bioline</td><td>BIO-25028</td><td></td></tr><tr><td>PCR primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300 fluorospectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-3300</td><td></td></tr><tr><td>NTP Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U1006</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G3776</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C9274</td><td></td></tr><tr><td>High Purity rNTPs</td><td>GE Healthcare</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P UTP&amp;nbsp;</td><td>PerkinElmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BLU007C001MC</td><td>Radioactive compound</td></tr><tr><td>RNA ladder preparation&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1&amp;ndash;1 kb</td><td>Millipore</td><td>69003</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAP</td><td>Promega</td><td>P2075</td><td></td></tr><tr><td>Gel preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>165-3804</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>urea&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>U6504</td><td></td></tr><tr><td>tris(hydroxymethyl)aminomethane&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>boric acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>ethylenediaminetetraacetic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamide/bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich </td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Transcription Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>formamide&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>xylene cyanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>heparin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>84020</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitor</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td></td></tr><tr><td>Transcription buffer&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman&amp;nbsp;3MM Chr Chromatography Paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive decontaminant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>decon</td><td>decon90</td><td></td></tr><tr><td>Gel Treatment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Trio+ imager</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>63-0055-89</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro transcription assays and their application in drug discovery

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos e amplamente utilizados durante muitos anos para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na transcrição. Este processo requer múltiplas subunidades de polimerase de ADN dependente de ARN (RNAP) e uma série de factores de transcrição que actuam para modular a actividade de RNAP durante a expressão do gene. eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos radiomarcados é usado para fornecer informações mecanicista detalhadas sobre como rendimentos de transcrição e quais parâmetros podem afetá-lo. Neste artigo descrevemos o protocolo para estudar como o factor de alongamento essencial NusA regula a pausa de transcrição, bem como um método para identificar um agente antibacteriano alvo de iniciação de transcrição através da inibição da formação holoenzyme RNAP. Estes métodos podem ser usados ​​como uma plataforma para o desenvolvimento de abordagens adicionais para explorar o mecanismo de acção dos factores de transcrição que ainda permanecem incertos, bem como novos agen antibacterianats alvo de transcrição que é um alvo da droga subutilizados em pesquisa e desenvolvimento de antibióticos.

eficiência da transcrição pode ser determinada pela medição do nível de radiação nas bandas a diferentes pontos de tempo. O ensaio parando para testar a função do fator NusA visualização da pausa, terminação habilitada, e produtos (Figura 1A) run-off. Na presença do domínio N-terminal de NusA (NTD NusA; resíduos de aminoácidos 1-137), a aparência dos produtos de ARN foi significativamente retardado em comparação com a experiência de controlo sem Nus...

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In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

15.1K visualizações.  University of Newcastle. In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Bioquímica

Identification of Transcription Factor Regulators using Medium-Throughput Screening of Arrayed Libraries and a Dual-Luciferase-Based Reporter

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for anti-cancer therapies. However, directly targeting transcription factors is often difficult and can cause adverse side effects if the transcription factor is necessary in one or more adult tissues. Identifying upstream regulators that aberrantly activate transcription factors in cancer cells offers a more feasible alternative, particularly if these proteins are easy to drug. Here, we describe a protocol that can be used to combine arrayed medium-scale lentiviral libraries and a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay to identify novel regulators of transcription factors in cancer cells. Our approach offers a quick, easy, and inexpensive way to test hundreds of genes in a single experiment. To demonstrate the use of this approach, we performed a screen of an arrayed lentiviral RNAi library containing several regulators of Yes-associated protein (YAP) and transcriptional co-activator with PDZ-binding motif (TAZ), two transcriptional co-activators that are the downstream effectors of the Hippo pathway. However, this approach could be modified to screen for regulators of virtually any transcription factor or co-factor and could also be used to screen CRISPR/CAS9, cDNA, or ORF libraries.

To identify novel regulators of transcription factors, we developed an approach to screen arrayed lentiviral or retroviral RNAi libraries using a dual-luciferase-based transcriptional reporter assay. This approach offers a quick and relatively inexpensive way to screen hundreds of candidates in a single experiment.

Identificação de reguladores de fatores de transcrição usando triagem de média-duração de bibliotecas arrayed e um repórter baseado em dupla-luciferase

Transcription factors can alter the expression of numerous target genes that influence a variety of downstream processes making them good targets for ...

Pesquisa do câncer

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicina

Rapid Screening of HIV Reverse Transcriptase and Integrase Inhibitors

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify new compounds that can inhibit infection by the common drug resistant HIV-1 strains with minimal toxicity. Here we describe an efficient assay that can be used to rapidly determine the cellular cytotoxicity and efficacy of a compound against WT and mutant viral strains.
The desired target cell line is seeded in a 96-well plate and, after a 24 hr incubation, serially dilutions of the compounds to be tested are added. No further manipulations are necessary for cellular cytotoxicity assays; for anti HIV assays a predetermined amount of either a WT or drug resistant HIV-1 vector that expresses luciferase is added to the cells. Cytotoxicity is measured by using an ATP dependent luminescence assay and the impact of the compounds on infectivity is measured by determining the amount of luciferase in the presence or the absence of the putative inhibitors.
This screening assay takes 4 days to complete and multiple compounds can be screened in parallel. Compounds are screened in triplicate and the data are normalized to the infectivity/ATP levels in absence of target compounds. This technique provides a quick and accurate measurement of the efficacy and toxicity of potential anti HIV compounds.

Here we describe cellular cytotoxicity and single round infectivity assays that allow for the rapid and accurate screening of compounds to determine their cellular cytotoxicity (CC50) and IC50 values against WT and drug resistant HIV-1.

Triagem rápida de HIV transcriptase reversa e integrase Inibidores

Although a number of anti HIV drugs have been approved, there are still problems with toxicity and drug resistance. This demonstrates a need to identify ...

Imunologia e Infecção

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementação de<em&gt; In Vitro</em&gt; Droga de Resistência Ensaios: maximizar o potencial para Descobrindo clinicamente relevantes mecanismos de resistência

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA polymerase, e.g. T7. Due to the high cost of IVT reagents,&#160; IVT is a critical step in the mRNA drug substance production process and has been the focus of intense optimization in the field. To decrease the cost of mRNA production, reagents must be utilized optimally. Effective optimization necessitates a comprehensive understanding of the impact of individual reagents on reaction kinetics, i.e., the consumption of nucleoside triphosphates (NTPs) and the production of mRNA. Traditionally, low-throughput, end-point analytical techniques have been used for the analysis of mRNA. Though such methods give valuable information on mRNA content, at-line, near real-time analytics is needed to fully understand IVT reaction. We demonstrate how a liquid chromatography analytical method that separates NTPs, as well as pDNA and mRNA, can be used in near real-time to study IVT reaction kinetics. With the knowledge of the influence of different IVT components on kinetics and yield, rapid chromatographic analysis can be used to convert batch IVT reaction into a fed-batch mode that further increases productivity and reduces the overall cost of the reaction.

Optimizing in vitro transcription (IVT) is critical for cost-effective mRNA production. This protocol details an analytical chromatographic method for at-line analysis of IVT reaction, monitoring NTP depletion and mRNA production in batch or fed-batch modes, applicable to various RNA modalities, enhancing productivity and reducing costs.

Otimização da reação de transcrição in vitro para produção de mRNA usando monitoramento cromatográfico em linha

In vitro transcription reaction (IVT) is a complex, multi-component enzymatic synthesis of mRNA from a linear DNA template, catalyzed by an RNA ...

In Vitro Transcribed RNA-based Luciferase Reporter Assay to Study Translation Regulation in Poxvirus-infected Cells

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To dissect the role of 5&#39;-poly(A) leader in mRNA translation during poxvirus infection we developed an in vitro transcribed RNA-based luciferase reporter assay. This reporter assay comprises of four core steps: (1) PCR to amplify the DNA template for in vitro transcription; (2) in vitro transcription to generate mRNA using T7 RNA polymerase; (3) Transfection to introduce in vitro transcribed mRNA into cells; (4) Detection of luciferase activity as the indicator of translation. The RNA-based luciferase reporter assay described here circumvents issues of plasmid replication in poxvirus-infected cells and cryptic transcription from the plasmid. This protocol can be used to determine translation regulation by cis-elements in an mRNA including 5&#39;-UTR and 3&#39;-UTR in systems other than poxvirus-infected cells. Moreover, different modes of translation initiation like cap-dependent, cap-independent, re-initiation, and internal initiation can be investigated using this method.

We present a protocol to study mRNA translation regulation in poxvirus-infected cells using in vitro Transcribed RNA-based luciferase reporter assay. The assay can be used for studying translation regulation by cis-elements of an mRNA, including 5&#8217;-untranslated region (UTR) and 3&#8217;-UTR. Different translation initiation modes can also be examined using this method.

Ensaio de repórter luciferase à base de RNA transcrito in vitro para estudar a regulação da tradução em células infectadas pelo poxvirus

Every poxvirus mRNA transcribed after viral DNA replication has an evolutionarily conserved, non-templated 5&#39;-poly(A) leader in the 5&#39;-UTR. To ...

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Seleção de Repressores Transcricionais Projetados para Silenciamento Epigenético Direcionado

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Bioengenharia

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

Biologia

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...