עבודה זו כבר ממומן על ידי NSF מענק IOB # 0615996.

חלק 1: הכנת צמיחה נמטודות מדיה (NGM) צלחות פטרי נמטודות ניסויית כגון C. elegans ו פ פקיפיקוס הם בדרך כלל בתרבית במעבדה על 6 צלחות פטרי ס&quot;מ המכיל צמיחה נמטודות בינוני (NGM) 1. תולעים נשמרים 20 ° C, אבל יכול להיות מודגרות בטווח של טמפרטורות (בין 4 ° C - 25 ° C), בהתאם למין נמטודות ותכנון ניסויים. כדי להכין צלחות עם NGM, טכניקות סטרילי תקן צריך לשמש כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי. להלן פרוטוקול להכין צלחות NGM: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 15 אגר גרם, 2.4 גרם NaCl, 2 גרם Tryptone, ו 2.72 גרם KH 2 PO 4 בבקבוק 2 ליטר חרוטי, לעשות נפח של עד 1 ליטר עם החיטוי מים, ומצננים עד 60 ° צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.8 מ&quot;ל כל אחד 1 M CaCl 2, כולסטרול (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל אתנול), ו 1 מ 4 MgSO. כדי למנוע זיהום פטרייתי חיידקי, סטרפטומיצין 1 מ&quot;ל (100 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ו nystatin 1ml (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ניתן להוסיף ליטר כל אחד בינוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מכונת Unispense ושמירה בתנאים סטריליים, לשפוך את התקשורת לתוך צלחות הרצוי. צלחות צריך להיות מלא עד בערך 2 / 3 rd מלא. צלחת בקוטר 60 מ&quot;מ סטנדרטי דורש כ 10 מ&quot;ל של התקשורת. אין להזיז את הצלחות עד אגר הוא gelified לחלוטין, אחרת לא יהיה משטח אחיד של אגר, ולכן קשה להתמקד תולעים על stereomicroscope. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מיובשים, צלחות ניתן seeded מיד או מאוחסנים 4 ° C עד זריעת עם חיידקים. </li></ol> חלק 2: הכנת OP50 חיידקים זריעת NGM צלחות פטרי פ פקיפיקוס בתרבית במעבדה על ידי האכלה על המתח E.coli OP50. OP50 יש צמיחה מוגבלת על צלחות NGM, ובכך יוצרים הדשא דק המאפשר ראיה של תולעים 1. כדי לגדול תרבות של OP50, להשתמש LB-מרק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 גרם bactotryptone, 2.5 לחלץ גרם שמרים 2.5 גרם NaCl על בקבוק 500 מ&quot;ל כובע בורג, לפצות את נפח 500 מ&quot;ל מים מזוקקים החיטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את המרק עם מושבת יחיד של OP50 מהצלחת התרבות בתנאים סטריליים ולתת לו לגדול בין לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LB-OP50 הוא מוכן להיות בשימוש, ניתן לאחסן 4 ° C למשך מספר חודשים אם עקרות נשמר. בכל פעם צלחות צריך להיות מנוקה מגרעינים, לשפוך כמות קטנה של מרק לתוך מבחנה סטרילית קטן זה יעזור למנוע זיהום של התרבות המניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צלחות זרע, לוותר 100-120 μl של OP50 על גבי צלחת בקוטר 60 מ&quot;מ פטרי NGM ו מערבולת להפיץ אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אלה צלחות seeded לילה בטמפרטורת החדר למשך הדשא לצמוח. הצלחות אלו זורעים כעת ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 3 שבועות. אחסון אותם בעמדה הפוכה עוזר למנוע ייבוש מהיר. </li></ol> חלק 3: ביצוע לבחור בחלק זה אנו מתארים כיצד להכין לבחור עבור תולעים. לבחור משמש להעברת תולעים ממיקום אחד למשנהו. להרים עשוי 30% 90 מד חוט פלטינה אירידיום 10%, אם כי חוקרים אחדים עשויים להעדיף יצירות מתכת שונה במקצת: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כ 3-4 ס&quot;מ של חוט, מקום של 0.5 ס&quot;מ זה בתוך קצה פיפטה פסטר (אשר קצה נשברה לאורך קטן יותר) ולאחר מכן לאטום אותו לתוך הכוס מעל מבער בונזן. אורכו של חוט בולטות מן הכוס הוא כ 3-3.5 ס&quot;מ, אך יכול להשתנות על פי העדפותיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטחו את קצה של חוט, כי הוא בולט באמצעות פטיש או צבת. ואז לכופף כלפי מעלה חלק שטוח כדי ליצור סקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Smoothen את הקצוות החדים של לקחת את הנייר עם חול כדי למנוע פגיעה תולעת או אגר. </li></ol> חלק 4: תולעים קטיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאסוף תולעים, לעקר את חוט פלטינה על להבה וגרור את קצה שטוח של להרים יחד הדשא חיידקים מעיל קצה עם חיידקים דביק עבה, נזהרת שלא לנקב או לפגוע משטח אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope, מאוד קל לצחצח את קצה דביק נגד תולעים תולעת / להיות נטל עד התולעת מקלות על החיידקים על לבחור את. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התולעת הוא על קצה לבחור את, להעביר אותו מיד צלחת החדש על ידי נגיעה או הזזה קצה לבחור את הדשא נגד חיידקי של צלחת החדש, התולעת צריך לזחול משם. יש להקפיד לא לפגוע משטח של אגר בצלחת אחר התולעים לזחול לתוך החורים ולכן קשה לשלוף אותם. אם התולעת נשאר לבחור את זמן רב מדי, זה עלול ליבש. </li></ol> חלק 5: EMS mutagenesis Sulfonate אתיל מתאן (EMS) מעוררת קשת רחבה של מוטציות ב הגנום 2. מוטאנטים ניתן לזהות פגמים כמו הנחת ביצה, פגם שרירים, קביעת מין, היווצרות dauer, התנהגות, היווצרות אשך. פרוטוקול עבור EMS mutagenesis דומה לזה שתואר על C. elegans 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל (או יותר) של 1N NaOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 4-5, 6 ס&quot;מ קוטר צלחות פטרי מלא תולעים, המכיל כמה מאות תולעים בבית השלישי הזחל נעורים (J3) במה לשטוף את התולעים את שימוש 2-3 מ&quot;ל של M9 סטרילי לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל התולעים סטרילית, חד פעמי שפופרת 15 מ&quot;ל צנטריפוגות. צנטריפוגה XG ב 1500 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את הנוזל והשימוש 2 מ&quot;ל של M9 מחדש להשעות את התולעים. הוסף 20 μl EMS אל צינור המכיל 2ml של M9 ולנער לפזרו. לאחר מכן להוסיף את הפתרון הזה EMS כדי 2ml ההשעיה תולעת מערבולת בעדינות. הריכוז הסופי של EMS יהיה 47 מ&quot;מ. זהירות: EMS היא mutagen מאוד חזק יש לטפל במנדף קטר. כל החומרים (כפפות, טפטפות, טיפים) כי בא במגע עם mutagen זה יש להתייחס 1N NaOH ל פעיל EMS. לבשו כפפות כפול במהלך ההליך כולו EMS mutagenesis. השליכו פסולת מסוכנת על פי הנחיות המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור צנטריפוגות ולכסות את הכובע עם parafilm; למקם אותו אופקית למכסה המנוע קטר ולתת את התולעים דגירה עבור 3.5 שעות. הצינור ניתן גם דגש על כיסא נדנדה במהירות נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את הצינור לכסות את המכסה עם parafilm; מקום במצב אנכי דגירה ועד כיור התולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant וזורקים אותו לתוך כוס / בקבוק המכיל 1N NaOH. זה יהיה להשבית EMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל M9 של תולעים, להפוך את הצינור 25-30 פעמים כדי לשטוף את התולעים, צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5-7 דקות או עד התולעים צורה כדורית. לשאוב supernatant וזורקים לתוך כוס NaOH 1N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב כביסה לפחות 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לשטוף הסופי, מחדש להשעות את התולעת גלולה בסכום מינימלי (~ 500 μl) של M9 ו פיפטה אותם לצלחות NGM המכיל הדשא של OP50 חיידקים. בשלב הזה אתה כבר לא צריך לעבוד במנדף כימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו לנוזל להתייבש במשך כמה דקות ולאחר מכן לבחור ולהעביר בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי בהתאם להנחיות מסוכנים המוסד שלך פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן את עצמי תולעים mutagenized להפרות. שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציות רצסיביות של עניין. </li></ol> חלק 6: Psoralen mutagenesis בחלק זה אנו מתארים את הליך mutagenesis באמצעות TMP בשיתוף עם אולטרה סגול באורך גל ארוך (UV). Tmp / UV שיטת mutagenesis נעשה שימוש נרחב כדי לגרום מוטציות מחיקה בתוך הגנום 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תולעים 4-5, 6 ס&quot;מ קוטר צלחות פטרי לתוך שפופרת 15 מ&quot;ל צנטריפוגות כמתואר בהליך הקודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל M9, להפוך 20 פעמים כדי לשטוף את תולעים צנטריפוגות XG ב 1500 במשך 5 דקות. בטל supernatant וחזור הכביסה עבור סכום כולל של 3 פעמים. לשאוב את הנוזל מחדש להשעות את התולעים בערך 10 פעמים את היקפן של M9 המכילות 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של TMP. פיפטה 20 μl של TMP (3 מ&quot;ג / מ&quot;ל) לתוך 2 מ&quot;ל של M9. כמו EMS, TMP הוא קרצינוגן חזק ויש לטפל נקיטת אמצעי בטיחות נאותה. כדי למנוע סיכון פוטנציאלי של העין UV באור הנכון לובש אמור לשמש. Disposables חייב להיות מושלך בשקיות Biohazard הנכון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צינור בחושך במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על כיסא נדנדה במהירות נמוכה (40 UPM). הגדר את צינור אנכי מכוסה במשך 10 דקות כדי לתת את כל כיור תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התולעים מהחלק התחתון של הצינור עם פיפטה פסטר ולהעביר אותם לצלחת NGM unseeded. בטל supernatant עמידה בהנחיות מסוכנים המוסד שלך כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצלחת בחושך עד TMP עודף נספג לתוך הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מד עוצמת קרינת UV, להגדיר את המרחק בין מקור UV גל ארוך ואת צלחת כזו שעוצמת על הצלחת הוא 500 μW / 2 4 ס&quot;מ. הסר את מכסה האלומיניום המכסה לכסות ולחשוף את צלחת המכילה את התולעים TMP שטופלו על קרינת UV גל ארוך של 50 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים ומניחים את התולעים בחושך במשך 5 שעות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף והעברת בריא מחפש J4 הזחלים כדי טריים צלחות seeded. מחק את הצלחת המקורי מסוכנים בעקבות הנחיות המוסד שלך כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש stereomicroscope, המסך פנוטיפים בדור F2 עבור מוטציה של עניין. </li></ol> חלק 7: תוצאות נציג חלק פ &#39; פקיפיקוס פנוטיפים מוטנטים הנובע mutagenesis (או על ידי EMS או TMP / UV) מוצגות באיור 1. מוטציה לכל אחד יש פנוטיפ אופייני בקלות להבדיל בינו ובין החיה סוג בר. מ התולעיםשטופלו עם mutagen, 30 J3/J4 הזחלים מן הדור של ההורים (P0) הונחו צלחות נפרדות מותר להטיל ביצים, שהם דור F1. מתוך צלחות שהראו צאצאים F1 בריא, סך של 1000 F1s הועברו על צלחות הפרט צאצאים F2 הוקרן עבור פנוטיפים. בעלי חיים עם 5,6 הרעוע, 6 תיאום שנאי 7 פנוטיפים נמצאו. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Pristionchus סוג פקיפיקוס בר וחיות מוטציה. א ב wt wt אנדרוגינוס זכר ג dpy מוטציה ד UNC מוטציה E. tra מוטציה. למעלה שני פאנלים מראה סוג הרמפרודיט בר (משמאל) זכר (מימין) חיות להשוות עם מוטנטים שונים לוחות הנותרים.

<ol>
	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Mutagenesis היא טכניקה מועסקים נרחב עבור מחקרים גנטיים שונים של אורגניזמים מודל ניסיוני. ניסויים mutagenesis משמשים לעתים קרובות כדי לזהות את הפונקציה של הגן 2. הנהלים mutagenesis המתואר כאן ניתן להשתמש לא רק על פ פקיפיקוס, אלא גם עבור ג אלגנס ושאר מיני נמטודות בנושא. ?...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

פרוטוקול זה מתאר את ההליכים כדי לשמור על נמטודות במעבדה וכיצד mutagenize אותם באמצעות שתי שיטות חלופיות: sulfonate מתאן אתיל (EMS) ו - 4, 5 &#39;, 8-trimethylpsoralen בשילוב עם אור אולטרה סגול (TMP / UV). נמטודות הן מערכות ביולוגיות עוצמה עבור מחקרים בגנטיקה בגלל תוכנית פשוטה הגוף שלהם ואת מערכת הרבייה, המורכבת עצמית זבול הרמפרודיטים וזכרים כי ניתן להפיק מאות צאצאים לכל בעלי החיים. נמטודות נשמרות צלחות אגר המכיל דשא של חיידקים ניתן להעביר בקלות מהצלחת אחד למשנהו באמצעות להרים. EMS הוא סוכן אלקילציה נפוץ לגרום מוטציות נקודתיות ומחיקות קטן, בעוד tmp / UV גורמת בעיקר מחיקות. בהתאם מינים של נמטודות בשימוש, ריכוזים של EMS ו TMP יהיה חייב להיות מותאם. כדי לבודד מוטציות רצסיביות של פקיפיקוס נמטודות Pristionchus, בעלי חיים של דור F2 הוקרנו חזותית עבור פנוטיפים. כדי להמחיש את השיטות הללו, אנו mutagenized תולעים וחיפשתי מתואמים (UNC), גוצה (Dpy) ו שנאי (טרה) מוטנטים.

Watch this Scientific Journal Video about An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis at JoVE.com

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים (למשל,<em&gt; Pristionchus פקיפיקוס</em&gt;) במעבדה ולהראות שתי שיטות mutagenesis שונים, EMS ו-tmp / UV.

מבוא מעבדה תולעת: מ תולעים culturing כדי mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

an-introduction-to-worm-lab-from-culturing-worms-to-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Biology

34.1K Views.  University of Texas at Arlington. הקרנת עבור מוטנטים עם מומים פנוטיפי היא שיטה פשוטה לזיהוי גנים פונקציה בתהליך ביולוגי נתון. במאמר זה אנו מתארים כיצד לשחרר את התרבות תולעים חיים (למשל, Pristionchus פקיפיקוס) במעבדה ולהראות שתי שיטות mutagenesis שונים, EMS ו-tmp / UV.

Video: An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

ביצית אחת bisulfite mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

מבוא לממברנה מוצקה נתמכות המבוססת Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

בתכנות מחדש vivo של תאים סומטיים למבוגרים לpluripotency ידי ביטוי יתר של גורמי יאמאנאקה

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Culturing<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em &gt; בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

שימוש בתאים סרטניים עכבר החלב ללמד מושגי ביולוגיה Core: מודול מעבדה פשוט

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...