פרוטוקול זה מסייע להבין את הגיוס המרחבי והזמן של חלבוני תיקון נזקי DNA, תוך התחשבות בשלב מחזור התא. עבור אפליה במחזור התא, אנו משתמשים PCNA מתויג חלבון פלואורסצנטי כסמן של שלב S, אשר עוקף חפצים שהוצגו על ידי שיטות סינכרון מחזור תאים אחרות. זה בשילוב עם מיקרו-הקרנה מבוססת לייזר נותן רזולוציה ספאתיוטמפוראלית שאין שני לה לתיקון נזקי DNA קינטיקה של חלבונים.
הצלחה בניצול שגרתי של הפרוטוקול שלנו בונה על ידע בסיסי של הדמיה קונפוצלית. 24 שעות לפני המיקרו-הקרנה, צלחת סך של שמונה על 10 לתאים הרביעיים ב 500 microliters למיליליטר אחד של מדיה על זכוכית כיסוי ארבעה בארות. שעה לפני המיקרו-הקרנה, החליפו את מדיום הצמיחה הרגיל במדיום הדמיה המכיל או אולפריב או בקרת רכב כגון DMSO.
לפחות ארבע שעות לפני ההדמיה, הפעל את התא הסביבתי ואת רכיבי המיקרוסקופ. להפעיל את החימום, אספקת דו תחמוצת הפחמן, ואת וסת הלחות. אתחל מקורות אור יחד עם קווי הלייזר לפחות שעה אחת לפני העברת התאים למיקרוסקופ.
משמנים את מטרת המיקרוסקופ ומניחים זכוכית כיסוי מקוברת מתחת למיקרוסקופ. כדי לבחור תאי פאזה S באוכלוסייה אסינכרונית, חפש דרך העין את תבנית הלוקליזציה הייחודית של ה- PCNA המתויג של mPlum בשלב S ובחר שדה תצוגה הכולל מספיק תאי פאזה S להקרנה זעירה. הגדר את אזור העניין עבור הקרנה מיקרו באמצעות התוכנה המשויכת כדי להוסיף קווים בינאריים.
כדי להגדיר את מספר השורות והמרווח הרצויים, לחץ על בינארי ולאחר מכן בחר הוסף קו, עיגול ואליפסה לציור מספר השורות הרצוי ולאחר מכן המר קווים בינאריים אלה ל- ROIs לגירוי על-ידי לחיצה על ROI, העבר בינארי ל- ROI ולאחר מכן לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על כל אחד מההנפקים ובחר השתמש כ- ROI S1 מגירוי. מקם קווים אלה בשדה הראייה כך שהם יעברו דרך גרעין התאים. לפני הקרנה זעירה, כדי לזהות מוקדי PCNA לניתוח מאוחר יותר, קח תמונה ברזולוציה גבוהה יותר של שדה הראייה על-ידי הגדרת הפרמטרים הדרושים ב- GUI הקומפקטי A1 LFOV ובחלונות אזור הסריקה A1 LFOV ולאחר מכן לחיצה על לחצן הלכידה. כדי להגדיר את המיקרו-הקרנה, פתח את הכרטיסייה גירוי ND ולאחר מכן לגשת לחלון לוח הזמנים כדי לרכוש סדרה של תמונות טרום גירוי ולאחר מכן סדרה של תמונות לאחר גירוי באמצעות סורקי Galvano.
הגדר שלושה שלבים בחלון לוח הזמנים. בעמודת הרכישה והגירוי, בחר רכישה, גירוי ורכישה עבור שלושת השלבים בהתאמה. עבור שלב הגירוי, להגדיר S1 כמו ROI.
בחלון Galvano XY, להגדיר תפוקת כוח לייזר 100% עבור קו לייזר 405 ננומטר ולהגדיר את זמן ההתעכבות עבור הקרנה מיקרו. כדי להגדיר הדמיית timelapse עבור חלון הזמן והמרווחים הרצויים, השתמש בלוח הזמנים A1 LFOV compact GUI ובחלונות אזור הסריקה A1 LFOV. מטב את אחוזי צריכת הלייזר, ההטבה וההיסט של הגדרות כדי להפחית את ההלבנה של תמונות במהלך הדמיה בחלון ה- GUI הקומפקטי A1 LFOV.
בהתאם לקינטיקה של החלבון, להאריך או לקצר את המרווח בין תמונות או את משך הזמן הכולל על ידי הגדרת המרווח הרצוי ומשך עבור שורת הרכישה של השלב השלישי בחלון לוח הזמנים. לחץ לרוץ עכשיו כדי לבצע את המיקרו-הקרנה ואת הדמיית timelapse הבאים. בסוף הדמיית timelapse, שמור את ROIs גירוי כתמונות נפרדות, אשר יהיה שימושי לזיהוי הקואורדינטות של מיקרו הקרנה בכל תוכנה במורד הזרם המשמש לניתוח.
ל- PCNA יש הפצה הומוגנית לחלוטין בגרעין בשלבי G1 ו- G2. בשלב S, PCNA לוקליזציה לאתרים של שכפול DNA, אשר ניתן לדמיין כתמים בהירים בגרעין. בתאי שלב S המוקדמים, הכתמים קטנים יחסית ומחולקים באופן שווה לאורך גרעין התא.
תוך כדי התקדמות לשלב אמצע S, הכתמים הופכים מטושטשים ומקוסגרים יותר לכיוון היקף הגרעין והגרעין. בשלב S מאוחר, הכתמים להפחית במספרים, אבל להיות גדול יותר ויותר כמו PCNA מתרכז באתרי שכפול מאוחרים. מינונים נמוכים של אנרגיה, כגון 1,000 מיקרו שניות של זמן מגורים, אינם גורמים לגיוס של EGFP-FBXL10, מגיב הפסקה נטוש כפול, אבל מספיקים כדי לגרום לגיוס של NTHL1-mCherry, חלבון מסלול כריתה בסיסית המגויס לאתרים של נזק DNA חמצוני.
ב 3, 000 מיקרו שניות להתעכב זמן, הן EGFP-FBXL10 ו NTHL1-mCherry מגויסים, מדגים תפוקת לייזר המייצרת הן נגעים חמצוניים הפסקות כפולות גדילים. EXO1b מגיע לרמה מקסימלית של אתרי הצטברות ומיקרו-הקרנה סביב דקה אחת, ולאחר מכן לאט לאט מתחיל להתנתק נגעי ה- DNA. בנוכחות olaparib, הצטברות של EXO1b בפס הלייזר בדקה אחת היא פחות באופן משמעותי בהשוואה לשליטה ברכב.
חשוב מאוד שלמיקרוסקופ יינתן מספיק זמן להתחמם ושהתרבות והתנאים אופטימליים עבור כל ניסוי כדי להבטיח תוצאות עקביות. בנוסף, חשוב לייעל את הגדרות הלייזר שלך עם כתבים נזק DNA שונים כדי לבדוק נגעים DNA ספציפיים. לאחר מיקרו-הקרנה, שקול לאמת תוצאות עם שיטות ביוכימיות קלאסיות, כגון שבר, immunoprecipitation, או ChIP.
גישות אלה דוגמיות אוכלוסיית תאים גדולה יותר, ובכך מספקות חוזק סטטיסטי.
