Name: surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians
Uploaded: 2017-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות למישל Deochand עבור ושכלול טכניקת אבלציה עין הזאת, טיילור Birkholz לסיוע עם assay התפקודית, מיכאל לוין עבור הנוגדן אנטי-arrestin, ו Junji Morokuma לקבלת מידע על צלחות פלטייה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק SFSA מן המערב אוניברסיטת מישיגן WSB.

1. התרבות טיפול בבעלי חיים הערה: פרוטוקול זה משתמש Schmidtea Mediterranea, זן planarian דיפלואידי עם הגנום רצף 16, 17, כי הוא נפוץ למחקר התחדשות. עם זאת, assay הוא פחות מוצלח עם מינים אחרים, כגון Girardia tigrina ו Girardia dorotocephala (אשר זמינים מסחרית). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור תולעים &quot;מי תולעת&quot; עשויים מלחי ים 0.5 g / L ב ultrapure (או יונים מסוננים) מים. השתמש מכלות פוליפרופילן או זכוכית סטרילית כדי להחזיק את מי תולעת. ראה <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">משלים קובץ 1</a> לפרטים על הכנת מי תולעת. הערה: אין להשתמש בסבון לניקוי מכולות (או אספקה ​​אחרת) כמו סבון רעילה תולעים; במקום לנגב עם 70% אתנול ו ולאפשר לאוויר יבש. &lt;ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש להשתמש בכפפות בעת עבודה עם planaria כדי להגן עליהם מפני זיהום. הערה: תולעים רגישים מאוד רעלים סביבתיים כימיקלים, כולל סבון, אקונומיקה, שמפו, מרכך, קרם ביד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מושבות בית מכולות מזון פוליפרופילן, עם המכסה נותרות פתוחות חלקית לחילופי אוויר ב ~ 20 ° C (בטמפרטורת חדר). תולעים הניסיונות חנות או בצלחות פטרי (20 תולעים לכל 100 מ&quot;מ צלחת) או שאינם מטופלי צלחות רקמות-תרבות (1 תולעת בכל טוב, צלחות 12-היטב). כדי להפחית את הלחץ, לשמור על שני המושבות וניסויים בחושך. הערה: מושבות צריכות להיות לא יותר מ 500-1,000 תולעים לליטר מי תולעת. בניסויים, לעזוב עפעפיים באופן מלא במקום, שכן זרימת האוויר נועדה לתוך הכלים האלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Feed תולעים הלא ניסיוניים אחת לשבוע עם בשר בקר מחית אורגני או כבד עוף על ידי הטלת רסק מן טפטף העברה, הצבת טיפות של מזון לאורך כל המכל. אפשר תולעים 2 h לצרוך מזוןחשוך לפני הניקוי מתוך מיכל (ראה שלב 1.4). לפני השימוש, רסק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך לטווח קצר (שבועות) או -80 מעלות צלזיוס למשך לטווח ארוך (חודשים); אל תקפיאו רסק לשימוש חוזר (כמו חיידקים עלולים לפרוח ולפגוע תולעים). הערה: הכבד יכיל שום הורמונים או אנטיביוטיקה ועדיפה לא יוקפא בעבר. פירה צנטריפוגה לפני ההקפאה (או לפני האכלה) להסיר אוויר ולמנוע מזון צף. מזון צריך לשקוע בתחתית המיכל. 1 המ&quot;ל של מחיה מספיק 500-1,000 תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מי Exchange פעם בשבוע עם מי תולעת טריים הוא מושבות וניסויים. מכולות קולוני צריך גם להימחק למטה עם מגבת נייר מולבן (כדי להסיר שאריות הריר כי פסולת מלכודת) פעם בשבוע במשך הרעבה תולעים, או פעמיים בשבוע במשך תולעים האכלה (2 שעות לאחר האכלה ושוב 2 ימים לאחר מכן). על מנת לשמר את ביופילם, לא לנגב יותר מ -80% של מיכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זז תולעים בין מכולות (או Setu ניתוחp) בעזרת פיפטה העברה. כדי תולעים חינם דבקו משטחים מיכל, להשפריץ מים על פני / מאחורי התולעת לשחרר אותו מפני השטח. בשלב הבא יש לשאוב את התולעת לתוך פיפטה, בעת שניסתה לשמור את התולעת בתוך אינץ התחתון (מדלל) החלק של פיפטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טפטפות Backload עם כמות קטנה של מי תולעת לפני מתחנף אליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נסו להזיז את המים סביב התולעת, ולא את התולעת עצמה, כדי למנוע קריעה תולעים רכי-גוף ידי נגיעה בהם עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור מנות ניסיוני הכלולים אלא העברת תולעים או החלפת מים. </li></ol></li></ol> 2. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק להאכיל תולעים לפחות שבוע לפני ניסויים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תולעים כי כבר לא הוזנו עבור ≥1 בשבוע לפחות 5-7 מ&quot;מ אורך. העברת התולעים בצלחת פטרי 2/3 מלאת מי תולעת, ולאשר אורך תולעת ידי זזת שליט מתחת הצלחת. מדוד worms תוך פתוח לגמרי ומרגש. הערה: בעוד שהם קטנים (5-7 מ&quot;מ) תולעים לעבוד טוב יותר בעת ביצוע immunofluorescence עתידיים הכלאה באתרו מנתח, תולעים גדולים (8-10 מ&quot;מ), קל יותר לעבוד עם - במיוחד כאשר לומדים לקטוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי תולעים הם שלמים, ללא פגע, ולא התחדשות לאחרונה. הערה: יוצר מחדש תולעים יצטרכו הרבה יותר קל (או לא) הפיגמנט בראש ו / או באזור זנב לעומת תולעים נורמלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצוע RNAi או טיפולים תרופתיים על תולעים, לעשות זאת בשלב זה. אם תולעים הואכלו כחלק הטיפול (כמו עבור RNAi), להמתין לפחות 7 ימים לאחר ההאכלה האחרונה לפני שתמשיך לשלב 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את בסיס מיקרוסקופ המרחב לנתח עבודה עם אתנול 70% ולאפשר לו להתייבש לחלוטין. מניח את הצלחת של תולעים הנבחרת לשמאל של ההיקף. בצד ימין של ההיקף, למקם זוג מלקחיים # 5, 31 G 5/16-inch מחט אינסולין עם 1מזרק מיליליטר, ו פיפטה העברה נקיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המכשירים נשמרים מפני נגיעת הספסל (אשר יכול להציג מזהמים). השתמש פריט נוקשה (כגון מנוחה צ&#39;ופסטיק) כדי לשמור על מלקחיים, מחט, ועל פיפטה נקייה. לחלופין, מכשירי מקום על גבי מגבת נייר חומה (מולבן) טריה. הערה: אלה ובעקבות הנחיות נכתבות כפי שהן נוגעות ליחידים ימניים. אנשים שמאליים צריכים להפוך את כיווני ימין / שמאל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליד מקום העבודה, להציב קופסא מגבוני רקמת מוך ללא, מקור מי תולעת טריים, וכמה טפטפות העברה נוספים (מוגנים מלמעלה הספסל). מי תולעת מקום בבקבוק לשטוף פלסטיק כדי להקל על מחלק. כמו כן מניחים צלחת 12-היטב שכותרתו (או 100 מ&quot;מ צלחת פטרי) בצד ימין של היקף לאיסוף חיות ablated. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות צלחת מחוייט פלטייה לשתק תולעים, למקם את צלחת פלטייה לתוך דיכאון tהוא הבסיס של המיקרוסקופ לנתח ולהתאים את התפוקה על מקור מתח DC עד משטח העבודה של צלחת פלטייה הוא מגניב מספיק (בדרך כלל ~ 5 V) .Alternatively, להפוך צלחת קרה ידי מילוי צלחת 100 מ&quot;מ פטרי ½ מלא במים ולהקפיא עבור h 24 לפחות. מחק את המכסה ומניחים את החלק התחתון של צלחת 100 מ&quot;מ על בסיס של הביתור, ואז למקם את המכסה של צלחת 60 מ&quot;מ פטרי במהופך ישירות על פני השטח של (איור 1 א) קרח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שהמים הקפיאה בצלחת 100 מ&quot;מ, &quot;הר געש&quot; של קרח יכול להופיע במרכז הצלחת. אם זה יקר, להשתמש בסכין גילוח כדי לגרד את דירת הקרח, כדי להסיר כל אי סדרים מפני השטח. הערה: במהלך ניתוחי הקרח תימס, מה שהופך כריתה הרבה יותר קשה. הכן מספר מנות קרח מראש, ולהחליף אלה מוקפאים להתכה אלה במהלך assay בהקדם את המכסה של צלחת 60 מ&quot;מ מתחיל צף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אתמשטח ניתוח. חותכים חתיכה 5 ס&quot;מ x 10 ס&quot;מ של הסרט פרפין פלסטיק (4 ס&quot;מ 2 אם באמצעות צלחת פטרי צלחת קר) ולמקם אותו על מרכז המכשיר וקיבוע. מקפלים רקמה נטולת סיבים לנגב לתוך הכיכר בערך 2 ס&quot;מ 2 ולמקם אותו על גבי הסרט. חותכים חתיכה של 1.5-2 נייר לבן מסנן ס&quot;מ 2 ולמקם אותו על גבי לנגב. ראה איור 1B-1E. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את מקופל לנגב במקום באצבע בכפפות, ולהשתמש במים תולעת כדי לחלח לנגב כדי להבטיח שהוא נשאר מקופל. השתמש בצד של טפטפת העברה לגלגל את לנגב שטוח. הערה: טמפרטורה קרה עוזרת לשמור תולעים לנוע. &quot;יבש&quot; עבודה גם מסייע וקיבוע. הרקמה לנגב מעשי פתיל מים דרך נייר הסינון, שמירה על התולעת לחה במהלך הניתוח מבלי לאפשר תולעים להתייבש לחלוטין (וזה קטלני). </li></ol></li></ol> 3. אבלציה כירורגית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה העברת למקם עלדואר גב תולעת בצד למעלה על נייר הסינון. הפעל את מקור האור ולכוון את goosenecks כך שהאור מתמקד התולעת. התאם את מיקוד ביתור וגדל כך בעיני הם נראים בבירור (התולעת כולו אינה צריכה להיות נוכח); הגדלת 5X היא נקודת התחלה טובה. אוריינט התולעת ידי סיבוב סרט פרפין, כך שהראש הוא הצביע לעבר החוקר (לכיוון החלק הקדמי של מיקרוסקופ), זווית 30-40 מעלות ימינה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע משימוש אור הבהיר כדי למנוע תנועת תולעת עודפת. Planarians להציג phototaxis שלילי ינסה להתחמק אור בהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם את התולעת ממוקמת בצד גחון כלפי מעלה (עם בלוע הפתיחה גלוי), להשתמש בצד הקהה של המלקחיים כדי למקם את הצד הגבה תולעת בעדינות עד (בעיניים גלויות). הימנע מתקרבים החיה עם קצה חד של מלקחיים כדי למזער את הסיכוי לקרוע דרך רקמות רכות כאשר למקם מחדש את החיה. </li><li&gt; התאם את המיקוד מיקרוסקופ כך שהעיניים הן בבירור בפוקוס. כמו כן להבטיח כי הן בעיניים ורקמות ראש שמסביב נמצאות בתצוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק מחט / מזרק טרי ביד ימין כאילו היו עט (בין האגודל והאצבע המורה). Brace האגודל עזב נגד צלחת פלטייה (או צלחת פטרי צלחת קרה), ולהשתמש האגודל השמאלי כמנוף שעליה החלק התחתון של המזרק ינוח (איור 2 א). להסתכל דרך מיקרוסקופ, ולוודא השיפוע של המחט גלוי. הערה: מחטים חדות ביותר. היה זהיר בעת טיפול בהם. לבישת כפפות לטקס או ניטריל יכול להציע הגנה מסוימת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש האגודל עזב כדי לעזור להחזיק את המחט / מזרק קבועה לאורך כל ההליך ולהימנע לוחצים ידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך בזווית של כ 40 מעלות עם האגודל השמאלי באצבע מורה שמאלית (עם אצבע המורה על משטח הניתוח) כדי להחזיק את סטאבילה משטח ניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עםשיפוע של המחט פונה כלפי מעלה (כמו כפית), למקם את המחט בזווית ישרה אל העין (איור 2B). השתמש קצה המחט לחדור השכבה הדקה של רקמה בעדינות שמעל הכוס האופטית (לבן, באזור חסר צבע) של העין, גורף מימין לשמאל. מאוד בעדינות להסיר את כל רקמת פיגמנט ממוקמת בתוך הכוס האופטית, נזהר שלא לנקב את התחתית או להרוס את הגבולות של הכוס האופטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התולעת כבר על הנייר המסנן&gt; 1-2 דקות בכל נקודה במהלך ההליך, להוסיף טיפה אחת של מי תולעת רעננותם את התולעת. הערה: ההתייבשות תגביר את הרגישות של התולעת לפציעות קריעה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.3 עד שכל הרקמות פיגמנט השחורות (תאי הפיגמנט), כמו גם את כל הרקמות הלבנות של הכוס האופטית (דנדריטים של תאי קולטי האור), יוסר. הסר רקמות ניכרות תקועות עד הסוף של המחט על ידי מנגב בזהירות עם רקמות לנגב. אם עבלה עין כפולהtion הוא רצוי, לקטוע את העין השנייה בנקודה זו. הערה: כדי למנוע פציעה, מחטים ניתן לנקות על-ידי אחיזת המחט עם טישו נקי לנגב שנערך עם האגודל לאצבע, ולאחר מכן באמצעות המצד השני למשוך את המחט דרך למחות מן האגודל לאצבע. לחלופין, את המחט יכולה להימחק על גבי המשטח של רקמות מגבון ובחנה לניקיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום, השתמש פיפטה העבירה להזיז את התולעת לצלחת שכותרתו המכילה מי תולעת טריים. אם לנתח את נתוני קבוצות, למקם עד 20 תולעים בצלחת פטרי יחיד 100 מ&quot;מ. אם מעקב התחדשות באותו אנשים לאורך זמן, מקום 1 תולעת לבאר כל צלחת 12-היטב. לאחר שכל התולעים מועברים, לשטוף תולעים על ידי הסרת כל מי התולעת מן המנות / בארות והחלפת מי תולעת טריים יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר תולעים מהמסנן, backload פיפטה עם כמות קטנה של מי תולעת ולשחרר את המים על התולעת. זה אמור להרים tהוא תולעת מהנייר המסנן, להישאב מייד אל פיפטה עבור העברה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת ניסויים ב ~ 20 ° C (בטמפרטורת חדר) מוגן מפני אור ובצע את תהליך ההתחדשות. הערה: ניתן לאחסן תולעי חממת טמפרטורה מבוקרת כדי לשמור על טמפרטורה קבועה, אבל זה לא הכרחי. רוב הטמפרטורות בחדר להשתנות רק על ידי 5 מעלות צלזיוס, אשר לא תשפיע על היכולת של התולעת כדי להתחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, לתקן תולעים אימונוהיסטוכימיה (ראה איורים 3-4) ו / או הכלאה באתרו מנתח של ביטוי גנים. שיטות קיבוע שונות קיימות אימונוהיסטוכימיה planarian 18, 19, 20 ו כלאה באתרו 21, 22, 23 פרוטוקולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הניסויים סיכם, sacrifiCE לחיות תולעים ידי הסרת מי תולעת מצלחת והחלפה עם 70% אתנול. דגירה תולעים במשך 3-5 דקות, בדיקת תולעים כדי lyse ולהפוך אפרפר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים תולעים שאינם מטופלים בזרם הפסולת הרגילה הקריב פעם. הימנע מציגה תולעים חיות לסביבה, במיוחד מינים לא מקומיים. </li></ol>

<ol>
	<li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+flatworm:+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration.">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li><li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration.">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li><li>Emili Sal&#243;, R. B., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Animal Models in Eye Research. , 15-26 (2008).</li><li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye.">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226 (2011).</li><li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration.">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration.">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li><li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent.">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708 (2014).</li><li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light.">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li><li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76 (2011).</li><li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians.">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li><li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration.">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li><li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves.">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li><li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle:+detection+and+functional+analysis.">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li><li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo.">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li><li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD+2.0:+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li><li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD:+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li><li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration,+homeostasis,+and+development.">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li><li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling.">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45 (2014).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians.">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2 (2015).</li><li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos:+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression.">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8 (2013).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

טכניקת עין אבלציה זה משפרת על השיטות הקיימות (כגון ניקוב חורים) על ידי לא כולל רקמות המוח הגבלה כריתה בעיקר ברקמות העין. בעזרת תרגול, טכניקה זו יכולה להתבצע על ידי רוב האנשים, מטכנאים מנוסים microsurgeries לסטודנטים לתואר ראשונים מנוסים אבל מצפון. מומלץ כי הטכניקה הזו להיות ?...

Planarians הם אורגניזם מודל עוצמה לחקר התחדשות גזע בוגרים בתיווך התא. Flatworms המתוק שאינו טפיל אלה להחזיק את היכולת להתחדש כל וכל רקמות חסרות, כוללים מערכת המוח 1 העצבים המרכזיים שלהם. למד לאחור ככל ה -1700 2, ההתקדמות הטכנולוגית בתחום planarian במהלך 10-15 השנים האחרונות (כגון הגנום רצף, הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, התערבות RNA (RNAi), ו transcriptomics) עדכנת אורגניזם מודל היסטורי זה . באופן ספציפי, planarians צבר פופולריות לאחרונה כמודל המתעורר למחקר עין 3. יש Planarians עיניים אב-טיפוס עם רק שני סוגי רקמות, הנוירונים קולטי האור ותאי הפיגמנט; זו אפשרה את האפיון של האוכלוסייה בתאי גזע העין שלו והוכיח כי רבים מן הגנים באותו ויסות דה העין החולייתניםvelopment שמורה ב planarians 4, 5. הכוסות האופטיות ממוקמות dorsally ובהשתתפות הדנדריטים הלבן, חסר הצבע של נוירונים קולטי האור ואת תאי הפיגמנט שחור למחצה ירחיים, והעיניים המעצבבות את המוח באמצעות תצלובת ראייה. בנוסף להיות מודל הבהרת תהליכי התחדשות 6, עין planarian היא גם מתאימה ללימוד האבולוציה של מנגנוני ויזואלית 7, תגובות התנהגותיות אור (planarians להציג phototaxis השלילית) 8, ואת הבסיס הנוירולוגי של התנהגות 9. התחדשות Eye ב planarians נחקרה בעיקר בשני הקשרים עיקריים: כחלק התחדשות הראש בעקבות עריפת 4, 10, ובעקבות כריתה של ממש ברקמות העין 11, 12 </sup&gt;. רוב מחקרי planarian על התחדשות עין השתמשו בשיטת עריפת הראש, כפי שהוא הוא פשוט וברור. שיטת כריתת עין planarian הנפוצה ביותר עד כה הייתה באמצעות ניקוב חורים עם צינור נימי זכוכית עדינה 13, 14, אם כי מחקרים מסוימים גם בצעו קטיעות ממש מאחורי העיניים (עריפה חלקית) 15. עם זאת, כל השיטות הללו כרוכות באובדן רב ברקמות אחרות מאשר רק את העין (כגון מוח, מעיים, ואת nephridia), פוטנציאל סיבוך פרשנות של תוצאות. פרוטוקול אבלציה העין המוצג כאן מגביל כריתה לרקמות העין (למעט במפורש המוח), וכתוצאה מכך נתונים ספציפיים יותר לעין. בנוסף, בניגוד תולעים ערופות כי לקחת 7-14 ימים כדי להתחיל האכלה, תולעי ablated עין יאכילו בתוך 24 שעות של אבלציה 12, המאפשרים ניסויי RNAi (שם RNAi מועבר באמצעות מזון) כדי להיות performed במקביל. למרות אבלציה עין היא קשה מבחינה טכנית לבצע בהצלחה מ עריפת הראש, המחקרים נוכחיים המעורבים כריתת עין לא כללו הוראות מפורטות לגבי הנהלים שלהם. מטרת מאמר זה וידאו היא לאפשר לחוקרים להסיר את הכוס האופטית planarian בעקביות מבלי להפריע רקמות המוח הבסיסיות וסרים כמו כמה רקמות אחרות ככל האפשר. שיטה זו יכולה לשמש הן אבלציה עין אחת כפולה והוא ישים למגוון רחב של חקירות. כמו רוב מבחני התחדשות, אבלציה עין מתאימה גם עבור שילוב עם שתי תרופתי וגנטי (RNAi) מסך, כמו גם מחקרים התנהגותיים. כאן אנו מתארים שיטות לטיפול תולעים, שמירה על מושבת planarian, ואת טכניקת אבלציה העין עצם.

<table><tbody><tr><td>Instant Ocean sea salts</td><td>Spectrum Brands&amp;nbsp;</td><td>SS15-10</td><td>&quot;10 Gallon&quot; box&amp;nbsp; (net weight 3 lbs)</td></tr><tr><td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>4.5 x 8.5 in&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Whatman #2 filter paper</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>WHA1002125</td><td>Circles, 125 mm diameter, white</td></tr><tr><td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td><td>Pet Health Market</td><td>17175-04</td><td>&amp;nbsp;U-100 1 cc syringe, 31 G 5/16 in needle</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Dumont #5&amp;nbsp; forceps&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Inox, straight tip , 11 cm</td></tr><tr><td>Transfer pipettes&amp;nbsp;</td><td>Samco Scientific&amp;nbsp;</td><td>225</td><td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td></tr><tr><td>Parafilm M paraffin film</td><td>Brand&amp;nbsp;</td><td>701606</td><td>&amp;nbsp;4 in x 125 ft roll</td></tr><tr><td>12-well untreated tissue culture plate</td><td>VWR</td><td>15705-059</td><td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td></tr><tr><td>Plastic food containers (for colony)&amp;nbsp;</td><td>Ziploc</td><td>Large rectangle</td><td>2.25 qt (2.12 L), 10&quot; x 6 -3/4 &quot; x 3 -3/16&quot;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Girardia tigrina&lt;/em&gt;)</td><td>Carolina Biological</td><td>132954</td><td>Sold as &quot;Brown&quot; Planaria; most often they are &lt;em&gt;G. tigrina&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia tigrina&lt;/em&gt;), but sometimes are &lt;em&gt;G. dorotocephala&lt;/em&gt; (aka &lt;em&gt;Dugesia dorotocephala&lt;/em&gt;); either will work.</td></tr><tr><td>Planaria (&lt;em&gt;Schmidtea mediterranea&lt;/em&gt;)</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>&lt;em&gt;S. mediterranea&lt;/em&gt; are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td></tr><tr><td>Brown paper towels&amp;nbsp;</td><td>Grainger</td><td>2U229</td><td>9-3/16 x 9-3/8&quot; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td></tr><tr><td>Wash bottle (for worm water), optional</td><td>VWR</td><td>16650-275</td><td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td></tr><tr><td>Anti-synapsin antibody, optional</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>3C11</td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>Anti-arrestin antibody, optional</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td></tr><tr><td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td><td>Nalge Nunc International Corporation</td><td>2324-0015</td><td>15 L,&amp;nbsp; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Custom Peltier plate, optional</td><td>Williams Machine, Foxboro, MA&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&amp;nbsp; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;).&amp;nbsp; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&amp;nbsp; &quot;anchored&quot; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &quot;foot&quot; that fits into the opening of your microscope&#039;s base plate.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DC power source (for Peltier plate), optional</td><td>B &amp;amp; K Precision</td><td>1665</td><td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 V (DC), 1-10 amps.</td></tr><tr><td>Other common supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blade&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chopstick rests, optional</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

במחקר של תאי גזע בוגרים ומנגנונים רגנרטיבית, תולעים שטוחות planarian הן מצרך במערכת מודל vivo. הדבר נובע במידה רבה האוכלוסייה ויכולת תאי גזע פלוריפוטנטיים בשפע שלהם כדי להתחדש כל סוגי תאים ורקמות לאחר פציעות כי יהיה קטסטרופלי עבור רוב החיות. לאחרונה, planarians זכה לפופולריות כמודל התחדשות עין. היכולת שלהם להתחדש העין כולה (המורכב משני סוגי רקמות: תאי פיגמנט קולטני האור) מאפשר דיסקציה של מנגנוני ויסות התחדשות מערכת הראייה. יש עיניים אבלציה מספר יתרונות על פני שיטות אחרות (כמו עריפת ראש או ניקוב חורים) לבחינת מסלולים ספציפיים העין ומנגנונים, שהחשוב בהם הוא התחדשות התאים היא מוגבלת בעיקר ברקמות העין לבד. מטרת מאמר זה וידאו היא להדגים כיצד להסיר את הכוס האופטית planarian מהימנה מבלי להפריע למוח או רקמות סובבות.טיפול תולעים והתחזוקה של מושבה הוקמה מתואר גם. טכניקה זו משתמשת 31 G, 5/16-inch מחט אינסולין כדי בניתוח לגרוף את הכוס האופטית של planarians משותקת על צלחת קרה. שיטה זו כוללת הן אבלציה עין אחת כפולה, בעיניים התחדשות בתוך 1-2 שבועות, המאפשר מגוון רחב של יישומים. בפרט, בטכניקה זו אבלציה ניתן לשלב בקלות עם מסך (התערבות RNA) תרופתי וגנטי עבור הבנה טובה יותר של מנגנון שיקום וההתפתחות שלהם, תאי גזע עין והתחזוקה שלהם, ותגובות התנהגותיות phototaxic ואת הבסיס הנוירולוגי שלהם.

עבור ניתוח 1-2 שעות לאחר הראשונה, חיות עשויות להפגין ירידה בתנועה לעומת תולעים שלמים (אולם הם עדיין יעברו). אם תרצה, תולעים יאכלו בתוך 24 שעות של ניתוח (למשל, עבור האכלת RNAi). כאשר בעקבות התחדשות עין באותו אנשים לאורך זמן, הקפד לצלם כל תולעת הן לפני הניתוח (...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלית, ואת הבסיס העצבי של התנהגות האור המושרה.

אבלציה כירורגית Assay עבור לימוד Regeneration Eye ב Planarians

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Views.  Western Michigan University.  פרוטוקול זה מראה כיצד שיחתוך עיני planarian בעקביות (כוסות אופטיות) מבלי להפריע רקמות סובבות. באמצעות מחט אינסולין במזרק, או אחת או בשתי העיניים יכול להיות מלוטשים על מנת להקל על חקירת מנגנוני ויסות התחדשות העין, את האבולוציה של התחדשות ויזואלי...

Video: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

A Planarian Motility Assay to Gauge the Biomodulating Properties of Natural Products

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and withdrawal properties of natural products is described. Experimental assays benefitting from unique aspects of planarian physiology have been applied to studies on wound healing, regeneration, and tumorigenesis. In addition, because planarians exhibit sensitivity to a variety of environmental stimuli and are capable of learning and developing conditioned responses, they can be used in behavioral studies examining learning and memory. Planarians possess a basic bilateral symmetry and a central nervous system that uses neurotransmitter systems amenable to studies examining the effects of neuromuscular biomodulators. Consequently, experimental systems monitoring planarian movement and motility have been developed to examine substance addiction and withdrawal. Because planarian motility offers the potential for a sensitive, easily standardized motility assay system to monitor the effect of stimuli, the planarian locomotor velocity (pLmV) test was adapted to monitor both stimulation and withdrawal behaviors by planarians through the determination of the number of grid lines crossed by the animals with time. Here, the technique and its application are demonstrated and explained.

Planarian motility is used to gauge the stimulant and withdrawal properties of natural products when compared to the movement of the animals in spring water alone.

תסה תנוענות פלנרית כדי לאמוד את המאפיינים של מודולים ביולוגיים של מוצרים טבעיים

A straightforward, controllable means of using the non-parasitic planarian, Dugesia tigrina, a free-living aquatic flatworm, to study the stimulant and ...

Biochemistry

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

הסרת עיניים בזחלי דגי זברה חיים לבחינת גדילה והתפתחות תלויי עצבנות של מערכת הראייה

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

אבלציה בלייזר של דג הזברה כלית ראשית לחקר התחדשות אפיתל הכליה

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Biology

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

מבחני גנטית תרופתי ו פונקציונלית לתפעל התחדשות של Planarian Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

עכשיו, דונלד מילר הפעלת תא לייזר המושרה ניוון הרשתית, התחדשות מודל בדג זברה

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Neuroscience

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Immobilization Planarian, הקרנה חלקית, השתלת רקמות

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform (RpEGEN) for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent retinal and vascular tissues. At present, the limited reparative capacity of mammalian RPE, which is restricted to small injuries, has hindered progress to understanding in vivo RPE regenerative processes. Here, a detailed methodology is provided to facilitate the study of in vivo RPE repair utilizing the zebrafish, a&#160;vertebrate model capable of robust tissue regeneration. This protocol describes a transgenic nitroreductase/metronidazole (NTR/MTZ)-mediated injury paradigm (rpe65a:nfsB-eGFP), which results in ablation of the central two-thirds of the RPE after 24 h treatment with MTZ, with subsequent tissue recovery. Focus is placed on RPE ablations in larval zebrafish and methods for testing the effects of pharmacological compounds on RPE regeneration are also outlined. Generation and validation of RpEGEN, a MATLAB script created to automate quantification of RPE regeneration based on pigmentation, is also discussed. Beyond active RPE repair mechanisms, this protocol can be expanded to studies of RPE degeneration and injury responses as well as the effects of RPE damage on adjacent retinal and vascular tissues, among other cellular and molecular processes. This zebrafish system holds significant promise in identifying genes, networks, and processes that drive RPE regeneration and RPE disease-related mechanisms, with the long-term goal of applying this knowledge to mammalian systems and, ultimately, toward therapeutic development.

Nitroreductase/Metronidazole-Mediated Ablation and a MATLAB Platform RpEGEN for Studying Regeneration of the Zebrafish Retinal Pigment Epithelium

This protocol describes the methodology to genetically ablate the retinal pigment epithelium (RPE) using a transgenic zebrafish model. Adapting the protocol to incorporate signaling pathway modulation using pharmacological compounds is extensively detailed. A MATLAB platform for quantifying RPE regeneration based on pigmentation was developed and is presented and discussed.

ניטרורדוקטאז/אבלציה בתיווך מטרונידזול ופלטפורמת MATLAB (RpEGEN) לחקר התחדשות של אפיתל פיגמנט הרשתית של דג הזברה

The retinal pigment epithelium (RPE) resides at the back of the eye and performs functions essential for maintaining the health and integrity of adjacent ...