Yazarlar işlevsel tahlil ile yardım için bu göz ablasyon tekniği, Taylor Birkholz mükemmelleştirmek için Michelle Deochand teşekkür etmek istiyorum, Peltier plakaları hakkında bilgi almak için, anti-arrestin antikoru Michael Levin ve Junji Morokuma. Bu çalışma WSB Batı Michigan Üniversitesi&#39;nden SFSA hibe ile desteklenmiştir.

1. Hayvan Kültür ve Taşıma NOT: Bu protokol Schmidtea mediterranea, yaygın rejenerasyon araştırma için kullanılan bir sıralı genomun 16, 17 ile diploit planarian türler kullanır. Bununla birlikte, deney gibi Girardia tigrina ve Girardia dorotocephala (ticari olarak temin edilebilir) gibi başka türler ile aynı başarılıdır. <ol><li> Ultra saf (ya da süzülmüş deiyonize edilmiş) su içinde 0.5 g / L deniz tuzu yapılan &quot;sonsuz su&quot; solucanlar koruyun. Sonsuz su tutmak için steril bir polipropilen ya da cam kaplar kullanın. Bkz <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55594/Supplementary_File_1.docx" target="_blank">Ek Dosya 1</a> solucan su hazırlama ile ilgili ayrıntılar için. Not: sabun gibi kaplar (ya da diğer malzemeleri) temizlemek için sabun kullanmayın solucan için toksiktir; yerine% 70 etanol ile silin ve kurumaya bırakın. &lt;ol&gt; <li> mikroplardan korunmak için Planarya çalışırken eldiven giyin. Not: Solucanlar sabun, ağartıcı, şampuan, saç kremi, ve el temizleme dahil olmak üzere çevresel toksinler ve kimyasallar, çok hassastır. </li></ol></li><li> Kapaklı polipropilen gıda kapları Ev koloniler, ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) hava değişimi için kısmen açık bıraktı. Petri kutuları ya saklayın deney kurtlar (100 mm tabak için 20 solucanlar) veya non-muamele edilmiş doku kültürü plakaları (12 oyuklu plakalar için oyuk başına 1 solucan). Stresi azaltmak karanlıkta hem koloniler ve deneyleri tutmak. NOT: Koloniler solucan litre suya en fazla 500-1000 den solucanlar olmalıdır. Hava akımı bu yemeklerin içine tasarlanmıştır beri deneyler için, tam yerinde kapaklarını bırakın. </li><li> Bir transfer pipeti ile ilgili püresi bırakarak kap boyunca yiyecek damla yerleştirerek püre haline getirilmiş organik et ve tavuk karaciğer haftada bir deneysel olmayan solucanlar besleyin. içinde gıda tüketmek Worms 2 saat izin verkabını temizlemeden önce koyu (adım 1.4). Uzun süreli (ay) C, mağaza kısa süreli (haftalar) boyunca -20 ° C&#39;de püre ya da -80 Kullanımdan önce; (Bakteri çiçek ve solucanlar zarar verebilir gibi) yeniden kullanım için püresi dondurursam yoktur. Not: Karaciğer bir hormon veya antibiyotik içerir ve tercihen önceden dondurulmuş edilemez. Santrifüj, dondurmadan önce püresi (ya da teknolojide beslemeye) havanın çıkartılması ve yüzer gıda önlemek için kullanılırlar. Gıda kabın dibine batar gerekir. püresi 1 mL 500-1,000 solucanlar için yeterlidir. </li><li> Kolonilerin ve deneyler hem taze solucan su ile haftada bir kez Değişim su. Koloni kaplar da ağartılmamış kağıt havlu ile silinmiştir edilmelidir (mukus lekeleri çıkarmak için tuzak atıklar) (besleme ve tekrar 2 gün sonra 2 saat sonra), besleme solucanlar için haftada iki kez solucanlar açlıktan veya bir haftada bir kez. biyofilm muhafaza etmek için, kabın% 80&#39;den fazla silme yoktur. </li><li> Kaplarla (ya da cerrahi Setu arasında solucanlar taşıp) Bir transfer pipeti kullanarak. kap yüzeylerine yapışan serbest solucan için, yüzeyin serbest bırakmak için solucan / arkasında üzerinde su fışkırtma. pipet alt inç (tiner) kısmı içinde solucan tutmaya çalışırken Ardından, pipet içine solucan emmek. <ol><li> onları emmeye önce solucan küçük bir su miktarı ile Backload pipetler. </li><li> pipet ile dokunarak yumuşak bedenli solucanlar yırtılma önlemeye yardımcı olmak için, daha doğrusu solucan kendisinden daha, solucan etrafında su taşımak için deneyin. </li><li> solucanlar transfer veya su yerine sürece örtülü deneysel yemekler tutun. </li></ol></li></ol> 2. Hazırlık <ol><li> Deneylerden önce solucanlar az bir hafta beslenmesi durdurun. <ol><li> ≥1 hafta boyunca beslenirler ve uzunluk olarak en az 5-7 mm edilmemiş olan solucanlar seçin. solucan su dolu bir Petri kabı 2/3 solucan aktarın ve çanak altına bir cetvel kaydırarak solucan uzunluğunu onaylayın. w ölçünnormlar ise tamamen uzatılmış ve hareketli. NOT: Sonraki .bağışık ve in situ hibridizasyon analiz içinde, daha büyük solucanlar (8-10 mm) performans ile çalışmak daha kolay olduğunda daha küçük (5-7 mm) solucanlar daha iyi çalışırken - özellikle aşındırılması için öğrenme. </li><li> solucanlar, bütün hasarsız ve yakın zamanda yenileyici değildir emin olun. NOT: Normal solucanlar kıyasla rejenerasyon solucanlar, baş ve / veya arka bölgede daha hafif (veya hiç) pigment olacaktır. </li><li> solucanlar üzerinde RNAi&#39;yi veya farmakolojik tedaviler gerçekleştirmek, bu noktada bunu. kurtlar tedavisi (RNAi için gibi) bir parçası olarak beslenen olsaydı, 2.2 adıma devam etmeden önce en az 7 gün son beslenmeden sonra bekleyin. </li></ol></li><li> % 70 etanol ile çalışma alanı ve diseksiyon mikroskobu baz temizleyin ve tamamen kurumasına izin verin. Kapsamı solundaki seçilen solucanların koyunuz. Kapsamı sağında, 5/16 inç insülin iğne 1 ile 5. forseps bir çift, bir 31 G yerml şırınga ve temiz bir aktarım pipet. <ol><li> alet tezgah (kontaminasyona neden olabilir) dokunmasını tutulmasını sağlamak. temiz forseps, iğne ve pipet tutmak için (örneğin bir çubuk geri kalanı gibi) sert bir öğesini kullanın. Alternatif olarak, yeni bir kahverengi (ağartılmamış) ve kağıt havlu üstüne yer araçlar. NOT: Sağ elini bireyler ilgilendirmeyen Bu ve sonraki talimatlar yazılır. Solak bireyler sağ / sol yön ters olmalıdır. </li></ol></li><li> Sonraki bir çalışma alanı için ve lif içermeyen doku mendillerin bir kutu, taze sonsuz bir su kaynağı, ve (tezgah üstü korunmuş olarak) ilave bazı aktarım pipetler yerleştirin. yayma kolaylığı için bir plastik yıkama şişesinde yer solucanı su. Ayrıca ablasyona Hayvan toplam kapsamına sağındaki işaretlenmiş bir 12-kaynaklı plaka (veya 100 mm Petri kabı) yerleştirin. </li><li> Ismarlama bir Peltier plakası kullanılarak solucanlar hareketsiz hale getirmek için ise, t depresyon içine Peltier plakası pozisyonO mikroskop taban ve Peltier plakasının çalışma yüzeyi yeterince soğuk kadar DC güç kaynağı çıkış ayarlayabilirsiniz (tipik olarak ~ 5 V) .Alternatively, yarım su ile dolu bir 100 mm Petri kabı doldurarak soğuk plaka yapmak ve en az 24 saat süre ile dondurma. Kapağı atın ve kesici bir alan tabanındaki 100 mm tabak için alt tarafının, daha sonra buz (Şekil 1A) yüzeyine doğrudan baş aşağı bir 60 mm Petri kabı kapağını yerleştirin. <ol><li> Su, 100 mm tabak içinde dondurulur sonra, bir buz &quot;volkan&quot; plakasının merkezinde bir görünebilir. Bu durumda, yüzeyden herhangi bir düzensizlik kaldırmak için, buz düz kazımak için bir tıraş bıçağı kullanma. NOT: ameliyatları sırasında buz, erimeye çok daha zor ablasyon yapma olacaktır. önceden birkaç buz yemekleri hazırlayın, ve en kısa sürede 60 mm yemeğin kapak yüzen başlar başlamaz tahlil sırasında olanları eritmek için donmuş olanları değiştirin. </li></ol></li><li> hazırlamakcerrahi yüzeyi. Plastik parafin film bir 5 cm x 10 cm parça kesin (4 cm2 olursa petri soğuk plaka kullanılarak) ve hareketsiz hale getirme cihazının merkezi üzerine yerleştirin. Bir lifsiz bir doku Katlama bir kare yaklaşık 2 cm2 olarak mendil ve filmin üzerine yerleştirin. Beyaz filtre kağıdı 1.5-2 cm2 &#39;lik bir parça kesin ve mendilin üzerine yerleştirin. Şekil 1B-1E bakın. <ol><li> katlanmış tutun eldivenli parmak ile yerinde silin ve hafifçe katlanmış devam etmesini sağlamanın silin kırmak için solucan su kullanmayın. düz mendil rulo bir transfer pipeti kenarıyla. NOT: Soğuk sıcaklık hareket solucanlar tutmaya yardımcı olur. Çalışma &quot;kuru&quot; da hareketsiz hale yardımcı olur. Doku kurtlar (öldürücü olan) tamamen kurumasına izin vermeden, ameliyat sırasında nemli solucan tutarak, filtre kağıdı içinden su fitilleme eylemleri silin. </li></ol></li></ol> 3. Cerrahi Ablasyon <ol><li> Yerleştirmek üzere bir transfer pipet kullanınfiltre kağıdı üzerine, e solucan sırt tarafı yukarı. Işık kaynağını açın ve hafif solucan odaklanmış şekilde Goosenecks yönlendirmek. Gözleri (tüm solucan görünümünde olması gerekmez) açıkça görünecek şekilde diseksiyon kapsamı odağı ve büyütme ayarlayın; 5X büyütmede iyi bir başlangıç ​​noktasıdır. Kafa (mikroskop ön tarafına doğru) araştırmacı doğru işaret şekilde sağa doğru, açılı 30-40 derece parafin filmi döndürerek solucan döndürün. <ol><li> Aşırı solucan hareket etmesini önlemek için parlak ışık kullanımından kaçının. Planaryalar olumsuz phototaxis görüntülemek ve parlak ışık kaçmasına dener. </li><li> Solucan (boğaz görünür açılış) yukarı bakacak şekilde ventral yana konumlandırılmış, yavaşça (gözleri görünür olan) sonsuz dorsal tarafına kadar yeniden konumlandırmak için forseps donuk tarafında kullanır. hayvan yeniden konumlandırma zaman yumuşak doku yoluyla yırtılma riskini en aza indirmek için forseps sivri ucu ile hayvanın yaklaşan kaçının. </li><li&gt; Gözler odakta açıkça böylece mikroskop odağı ayarlayın. Ayrıca gözleri ve çevresindeki kafa dokuları hem görünümde olmasını sağlamak. </li></ol></li><li> O (başparmak ve işaret parmağı arasında) kalem sanki sağ elinde taze bir iğne / şırınga tutun. Peltier plakasına (veya Petri kabı soğuk plaka) karşı sola başparmak Brace ve şırınganın alt kısmı dinlenme olan bir dayanak noktası (Şekil 2A) ve sol baş kullanımı. Mikroskopla Bak ve iğne konik görünür olmasını sağlamak. NOT: İğneler çok keskindir. Onları tutarken dikkatli olun. lateks veya nitril eldiven giyerek biraz koruma sunabilir. <ol><li> prosedürü boyunca sürekli iğne / şırınga tutun yardımcı ve tokalaşarak önlemek için sol baş parmağını kullanın. </li><li> Ameliyat yüzey stabil tutmak yardımcı olmak için sol başparmak ve (cerrahi yüzeyinde parmağı ile) sol işaret parmağı ile yaklaşık 40 ° &#39;lik bir açı olun. </li></ol></li><li> İle(Kaşık gibi) yukarı doğru bakacak şekilde iğne konik, göz (Şekil 2B) dik açılarda iğne yerleştirin. yavaşça sağdan sola scooping gözün optik fincan (beyaz, pigmentsiz bölge) üzerinde uzanan doku ince tabaka nüfuz iğne ucu kullanın. Çok nazikçe dibe delinme veya optik fincan sınırlarını yok etmek değil dikkat ederek optik fincan içinde yer alan herhangi bir pigmentli dokuyu. <ol><li> Sonsuz işlemi sırasında herhangi bir noktada&gt; 1-2 dakika için bir filtre kağıdı üzerinde kalmışsa, solucan rehidrate sonsuz bir su damla ekleyin. NOT: Dehidrasyon müthiş yaralanmalara solucanın duyarlılığını artıracaktır. </li></ol></li><li> Tekrar siyah pigmentli dokularda (pigment hücreleri) her kadar adım 3.3, hem de optik fincan (fotoreseptör hücrelerinin dendritler) beyaz dokuların her olarak çıkarılır. dikkatli bir doku temizleme ile silerek iğnenin ucuna yapışmış kesilmiş dokuları çıkarın. çift ​​göz abla isesiyon, istenen bu noktada ikinci gözü baskılamak edilir. Not: zarar görmesini önlemek için, iğneler daha sonra silme uzak başparmak ve işaret parmağı arasından yoluyla iğne çekmek için diğer elini kullanarak, başparmak ve işaret parmağı ile yapılan mendil temiz bir doku ile iğne kavranarak temizlenebilir. Seçenek olarak ise, iğne ıslak bir doku temizleme yüzeyi üzerine sürülmüştür ve temizlik için incelenebilir. </li><li> Tamamlandığında taze solucan su içeren bir etiketlenmiş çanak solucan taşımak için bir transfer pipet kullanın. Grup verileri analiz için, bir tek 100 mm Petri tabağına 20 solucanlar yerleştirebilir. Zamanla aynı bireylerde rejenerasyonu izleme Eğer bir 12 plaka her kuyuya 1 solucan yerleştirin. Tüm solucanlar transfer edildikten sonra, tabaklar / kuyu tüm solucan suyun çıkarılması ve daha fazla taze solucan su ile değiştirerek solucanlar yıkayın. <ol><li> filtreden solucanlar kaldırmak için, sonsuz küçük bir su miktarı ile pipet backload ve solucan üzerine su bırakın. Bu t kaldırması gerektiğinifiltre kağıdı kapalı o solucan, derhal transfer için pipet içine emilmesine. </li></ol></li><li> ışıktan korunmalıdır ~ 20 ° C (oda sıcaklığı) deneyleri inkübe edin ve rejeneratif süreci takip. NOT: Solucanlar sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek sıcaklık kontrollü inkübatör içinde saklanabilir, ancak bu kesinlikle gerekli değildir. Çoğu oda sıcaklıkları yeniden oluşturmak için solucan yeteneğini etkilemez 5 ° C, sadece değişir. </li><li> Arzu edildiği takdirde, imünohistokimya için solucan (Şekil 3-4) ve / ya da in situ hibridizasyon gen ekspresyonunun analiz düzeltmek. Farklı tespit yöntemleri planarian immünohistokimya 18, 19, 20 ve in situ melezleme 21, 22, 23 protokolleri bulunmaktadır. </li><li> Deneyler sonuçlandığı, sacrifice çanak sonsuz suyun çıkarılması ve% 70 etanol ile değiştirerek solucanlar canlı. parçalanması ve grimsi açmak için solucanlar için kontrol 3-5 dakika solucanlar inkübe edin. </li><li> bir kez kurban Normal atık olmayan tedavi solucanlar yerleştirin. çevre, özellikle yerli olmayan türlerin içine canlı solucanlar tanıtan kaçının. </li></ol>

<ol>
	<li>Gentile, L., Cebria, F., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+planarian+flatworm:+an+in+vivo+model+for+stem+cell+biology+and+nervous+system+regeneration.">The planarian flatworm: an in vivo model for stem cell biology and nervous system regeneration.</a> Dis Model Mech. 4 (1), 12-19 (2011).</li><li>Elliott, S. A., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+and+enduring+contributions+of+planarians+to+the+study+of+animal+regeneration.">The history and enduring contributions of planarians to the study of animal regeneration.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (3), 301-326 (2013).</li><li>Emili Sal&#243;, R. B., Tsonis, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Animal Models in Eye Research. , 15-26 (2008).</li><li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dlx+and+sp6-9+Control+optic+cup+regeneration+in+a+prototypic+eye.">dlx and sp6-9 Control optic cup regeneration in a prototypic eye.</a> PLoS Genet. 7 (8), e1002226 (2011).</li><li>Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+planarian+eye+identifies+ovo+as+a+specific+regulator+of+eye+regeneration.">Transcriptome analysis of the planarian eye identifies ovo as a specific regulator of eye regeneration.</a> Cell Rep. 2 (2), 294-307 (2012).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+recovery+of+the+planarian+photosensing+system+during+head+regeneration.">Morphological and functional recovery of the planarian photosensing system during head regeneration.</a> Zoolog Sci. 21 (3), 275-283 (2004).</li><li>Pineda, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+network+of+prototypic+planarian+eye+regeneration+is+Pax6+independent.">The genetic network of prototypic planarian eye regeneration is Pax6 independent.</a> Development. 129 (6), 1423-1434 (2002).</li><li>Paskin, T. R., Jellies, J., Bacher, J., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planarian+Phototactic+Assay+Reveals+Differential+Behavioral+Responses+Based+on+Wavelength.">Planarian Phototactic Assay Reveals Differential Behavioral Responses Based on Wavelength.</a> PLoS One. 9 (12), e114708 (2014).</li><li>Raffa, R. B., Martley, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphetamine-induced+increase+in+planarian+locomotor+activity+and+block+by+UV+light.">Amphetamine-induced increase in planarian locomotor activity and block by UV light.</a> Brain Res. 1031 (1), 138-140 (2005).</li><li>Sandmann, T., Vogg, M. C., Owlarn, S., Boutros, M., Bartscherer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+head-regeneration+transcriptome+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">The head-regeneration transcriptome of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Genome Biol. 12 (8), R76 (2011).</li><li>Vasquez-Doorman, C., Petersen, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NuRD+complex+component+p66+suppresses+photoreceptor+neuron+regeneration+in+planarians.">The NuRD complex component p66 suppresses photoreceptor neuron regeneration in planarians.</a> Regeneration (Oxf). 3 (3), 168-178 (2016).</li><li>Deochand, M. E., Birkholz, T. R., Beane, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+regulation+of+planarian+eye+regeneration.">Temporal regulation of planarian eye regeneration.</a> Regeneration. 3 (4), 209-221 (2016).</li><li>Sakai, F., Agata, K., Orii, H., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+regeneration+ability+of+spontaneous+supernumerary+eyes+in+planarians+-eye+regeneration+field+and+pathway+selection+by+optic+nerves.">Organization and regeneration ability of spontaneous supernumerary eyes in planarians -eye regeneration field and pathway selection by optic nerves.</a> Zoolog Sci. 17 (3), 375-381 (2000).</li><li>Asano, Y., Nakamura, S., Ishida, S., Azuma, K., Shinozawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin-like+proteins+in+planarian+eye+and+auricle:+detection+and+functional+analysis.">Rhodopsin-like proteins in planarian eye and auricle: detection and functional analysis.</a> J Exp Biol. 201 (Pt 9), 1263-1271 (1998).</li><li>Cross, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Maintenance+and+Regeneration+of+Planarian+Eyes+by+ovo.">Control of Maintenance and Regeneration of Planarian Eyes by ovo.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7604-7610 (2015).</li><li>Robb, S. M., Gotting, K., Ross, E., Sanchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD+2.0:+The+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD 2.0: The Schmidtea mediterranea genome database.</a> Genesis. 53 (8), 535-546 (2015).</li><li>Robb, S. M., Ross, E., Sanchez Alvarado, ., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SmedGD:+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database.">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, D599-D606 (2008).</li><li>Beane, W. S., Tseng, A. S., Morokuma, J., Lemire, J. M., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+planar+cell+polarity+extends+neural+growth+during+regeneration,+homeostasis,+and+development.">Inhibition of planar cell polarity extends neural growth during regeneration, homeostasis, and development.</a> Stem Cells Dev. 21 (12), 2085-2094 (2012).</li><li>Forsthoefel, D. J., Waters, F. A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+cell+type-specific+monoclonal+antibodies+for+the+planarian+and+optimization+of+sample+processing+for+immunolabeling.">Generation of cell type-specific monoclonal antibodies for the planarian and optimization of sample processing for immunolabeling.</a> BMC Dev Biol. 14, 45 (2014).</li><li>Ross, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+monoclonal+antibodies+to+study+tissue+regeneration+in+planarians.">Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians.</a> BMC Dev Biol. 15, 2 (2015).</li><li>Cardona, A., Fernandez, J., Solana, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+situ+hybridization+protocol+for+planarian+embryos:+monitoring+myosin+heavy+chain+gene+expression.">An in situ hybridization protocol for planarian embryos: monitoring myosin heavy chain gene expression.</a> Dev Genes Evol. 215 (9), 482-488 (2005).</li><li>King, R. S., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+protocol+for+enhanced+detection+of+gene+expression+in+the+planarian+Schmidtea+mediterranea.">In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea.</a> BMC Dev Biol. 13, 8 (2013).</li><li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians.">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev Dyn. 238 (2), 443-450 (2009).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu göz ablasyon tekniği beyin dokusu hariç ve göz dokuları için esas eksizyon kısıtlayarak (örneğin, delikli zımba gibi) mevcut yöntemlerle daha da iyileştirir. teknisyenler deneyimsiz ama vicdani lisans öğrencilerine microsurgeries yaşanan den uygulama ile, bu teknik, çoğu kişiler tarafından yapılabilir. Tekniğin önceki immünohistokimya ile ya da göz işaretçi (ler) 4, 5, 13 için in situ mel...

Planaryalar yetişkin kök hücre aracılı yenilenmeyi incelerken için güçlü bir model organizma bulunmaktadır. Bu parazitik olmayan tatlı su yassı kurtların, merkezi sinir sistemi ve beyin 1 de dahil olmak üzere her türlü kayıp dokuları, yeniden yeteneği gösterirler. (In situ hibridizasyon, immünohistokimya, RNA interferans (RNAi), ve transkriptomik içinde, örneğin, bir sıralı genom olarak) kadar geri son 10-15 yılda planarian alanında 1700 2, teknolojik gelişmeler olarak ele bu tarihi organizma olduğu güncellenmiş . Özellikle, planarya geçenlerde göz araştırma 3 yükselen bir model olarak popülerlik kazanmıştır. Planaryalar iki doku tipleri, fotoreseptör nöronlar ve pigment hücreleri ile prototipik gözleri; Bu onun göz kök hücre popülasyonunun karakterizasyonu etkin ve aynı genlerin birçoğu omurgalı gözü DE düzenleyen olduğunu göstermiştirvelopment Planaryalar 4, 5 muhafaza edilir. Optik bardak dorsal olarak bulunur ve fotoreseptör nöronların beyaz, pigmentsiz dendrit ve yarım ay siyah pigment yapan hücrelerden, ve bunun üzerine kiyazmanın ile beyin innerve edilir. Yeniden yaratıcı süreçler, 6 açıklık için bir model olmasının yanı sıra, planarian göz görme mekanizmaları 7 evrim eğitimi için uygundur, davranışsal tepkileri ışığa 8 ve davranış 9 nörolojik temeli (planarya negatif phototaxis ekran). Planaryalar Göz rejenerasyon büyük ölçüde iki ana bağlamlarda incelenmiştir: Baş yenilenme parçası başının kesilmesini 4, 10 takip ve sadece göz dokularının 11 eksizyonu aşağıdaki gibi 12 </&gt; Sup. Basit ve anlaşılır olarak göz yenilenmesine En planarian çalışmalar decapitation yöntemini kullanmışlardır. Bazı çalışmalar, sadece göz (kısmi dekapitasyon) 15 arkasında amputasyon gerçekleştirilir rağmen bugüne kadar en yaygın planarian göz eksizyon yöntem olup, ince bir cam kılcal boru 13, 14 ile delik açma ile olmuştur. Bununla birlikte, bu yöntemlerin tüm potansiyel olarak, sonuçların yorumunu komplike (örneğin, beyin, bağırsak, ve nephridia gibi) sadece göz dışındaki birçok doku kaybını içermektedir. Burada sunulan göz ablasyon protokolü göze daha özeldir verilerin ortaya çıkmasına neden (özellikle beyinde hariç) göz dokularına, eksizyonu kısıtlar. Ayrıca, beslenme başlamak için 7-14 gün sürebilir kafası kesilmiş solucanlar aksine, göz kesilip solucanlar performe edilmesi (RNAi gıda ile teslim edilir) RNAi deneyleri izin ablasyon 12 24 saat içinde besleyecekeş zamanlı d. Göz ablasyon başarılı dekapitasyon daha gerçekleştirmek için teknik olarak zor olsa da, göz eksizyonu içeren güncel çalışmalar onların prosedürlerine ilişkin ayrıntılı talimatlar yer verilmemiştir. Bu video makalede amacı sürekli altta yatan beyin dokuları rahatsız ve mümkün olduğunca az diğer dokulara çıkarmadan planarian optik fincan kaldırmak için araştırmacılar sağlamaktır. Bu yöntem hem tek ve çift göz yakmakta ve araştırmaların geniş bir yelpazede uygulanabilir edilebilir. En yenilenmesi deneylerinde olduğu gibi, göz ablasyon farmakolojik ve genetik (RNAi) ekranlar, hem de davranışsal çalışmalar her iki kombinasyon için uygundur. Burada, solucan işlenmesi için yöntemler tarif bir planarian koloni bakımı ve göz ablasyon tekniği kendisi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Instant Ocean sea salts</td>
			<td>Spectrum Brands&#160;</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td>&#34;10 Gallon&#34; box&#160; (net weight 3 lbs)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe</td>
			<td>Kimberly-Clark</td>
			<td>34155</td>
			<td>4.5 x 8.5 in&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman #2 filter paper</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1002125</td>
			<td>Circles, 125 mm diameter, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy Touch Insulin syringe (with needle)</td>
			<td>Pet Health Market</td>
			<td>17175-04</td>
			<td>&#160;U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5&#160; forceps&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Inox, straight tip , 11 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Samco Scientific&#160;</td>
			<td>225</td>
			<td>Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M paraffin film</td>
			<td>Brand&#160;</td>
			<td>701606</td>
			<td>&#160;4 in x 125 ft roll</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated tissue culture plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>15705-059</td>
			<td>Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic food containers (for colony)&#160;</td>
			<td>Ziploc</td>
			<td>Large rectangle</td>
			<td>2.25 qt (2.12 L), 10&#34; x 6 -3/4 &#34; x 3 -3/16&#34;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Girardia tigrina)</td>
			<td>Carolina Biological</td>
			<td>132954</td>
			<td>Sold as &#34;Brown&#34; Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planaria (Schmidtea mediterranea)</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brown paper towels&#160;</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>2U229</td>
			<td>9-3/16 x 9-3/8&#34; 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash bottle (for worm water), optional</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16650-275</td>
			<td>Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-synapsin antibody, optional</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>3C11</td>
			<td>Supernatant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-arrestin antibody, optional</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional</td>
			<td>Nalge Nunc International Corporation</td>
			<td>2324-0015</td>
			<td>15 L,&#160; polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom Peltier plate, optional</td>
			<td>Williams Machine, Foxboro, MA&#160;</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:&#160; Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).&#160; The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is&#160; &#34;anchored&#34; to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a &#34;foot&#34; that fits into the opening of your microscope&#39;s base plate.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power source (for Peltier plate), optional</td>
			<td>B &#38; K Precision</td>
			<td>1665</td>
			<td>Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other common supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scope with gooseneck lighting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chopstick rests, optional</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surgical ablation assay for studying eye regeneration in planarians

Yetişkin kök hücreleri ve rejeneratif mekanizmaların çalışmada planarya yassı kurtların vivo model sisteminde bir elyaf. Bu onların bol pluripotent kök hücre nüfus ve çoğu hayvanlar için felaket olacaktır yaralanmalar sonrasında tüm hücre ve doku tiplerini rejenere etme kabiliyetine büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, planarya göz rejenerasyon için bir model olarak popülerlik kazanmıştır. (Iki doku tiplerinin gibidir: pigment hücreleri ve fotoreseptör) tüm göz yeniden kabiliyetleri görme sistemi rejenerasyonunu düzenleyen mekanizmaların diseksiyon sağlar. Göz ablasyon rejenerasyon büyük ölçüde tek başına göz doku ile sınırlı olduğunu En önemli olan göz spesifik yolları ve mekanizmaları incelemek için (örneğin, başı kesilerek ya da delik açma gibi) diğer tekniklere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Bu Video makalenin amacı güvenilir beyni rahatsız veya dokuları çevreleyen olmadan planarian optik fincan nasıl kaldırılacağını göstermektir.solucan ve kurulu bir koloninin bakım kullanımı da tarif edilmektedir. Bu teknik, cerrahi soğuk plaka üzerinde immobilize Planaryalar optik fincan oymak için bir 31 G, 5/16 inç insülin iğne kullanır. Bu yöntem geniş bir uygulama yelpazesi için izin 1-2 hafta içinde rejenere gözlü, tek ve çift göz ablasyon kapsar. Özel olarak, bu ablasyon tekniği kolayca rejeneratif mekanizmaları ve evrim, göz kök hücreleri ve bakım ve phototaxic davranışsal tepkileri ve nörolojik olarak daha iyi anlaşılması için farmakolojik ve genetik (RNA interferansı) ekranları ile birleştirilebilir.

ilk 1-2 saat sonra cerrahi, hayvanlar sağlam solucanlar (ancak yine de hareket edecek) ile karşılaştırıldığında hareket azalma gösterebilir. Arzu edildiği takdirde, solucanlar (RNAi beslenmesi için, örneğin) ameliyattan sonraki 24 saat içinde yiyeceklerdir. zamanla aynı bireylerde göz rejenerasyonu aşağıdaki, her iki ameliyat öncesi (bozulmamış) ve 1 saat sonrası ablasyon (HPA) her solucanın fotoğrafını çekmek için emin olun. 4 gün sonra ablasyonu (DPA) tar...

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians at JoVE.com

Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir.

Cerrahi Ablasyon Tahlili Planaryalar Göz Rejenerasyon incelenmesi için

In the study of adult stem cells and regenerative mechanisms, planarian flatworms are a staple in vivo model system. This is due in large part to their ...

surgical-ablation-assay-for-studying-eye-regeneration-in-planarians

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.9K Görüntüleme.  Western Michigan University.  Bu protokol sürekli çevredeki dokulara bozmadan planarian gözleri (optik bardak) çıkarılması için nasıl gösterir. ya bir ensülin iğne ve şırınga kullanılarak, ya da her iki gözü göz rejenerasyon, görsel yenilenme evrimi, ve ışık kaynaklı bir davranışın temel düzenleyici mekanizmalarının soruşturma kolaylaştırmak için kesilip edilebilir. 

Video: Surgical Ablation Assay for Studying Eye Regeneration in Planarians

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

Fare Endometrial stromal ve epitelyal hücrelerin izolasyonu için<em&gt; İn Vitro</em&gt; sidualizasyonu

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult liver regeneration after 70% partial hepatectomy results in hepatocyte hypertrophy with some replication in remaining lobes with restoration of metabolic activity, but with permanent loss of the injured lobe&#39;s morphology and architecture. Here, we detail a new surgical method in the neonate that leaves a physiologic environment conducive to regeneration. This model involves amputation of the left lobe apex and a subsequent conservative management regimen, and lacks the necessity for ligation of major liver vessels or chemical injury, leaving a physiologic environment where regeneration may occur. We extend this protocol to amputations on juvenile (P7-14) mice, during which the injured liver transitions from organ regeneration to compensatory growth by hypertrophy. The presented, brief 30 min protocol provides a framework to study the mechanisms of regeneration, its age-associated decline in mammals, and the characterization of putative hepatic stem or progenitors.

Here, we present a new method for partial resection of the left hepatic lobe in neonatal (day 0) mice. This new protocol is suitable for studying acute liver injury and injury response in the neonatal setting.

Kısmi Lobular Hepatectomy: Morfolojik karaciğer rejenerasyonu için cerrahi bir Model

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Enhanced Green Fluorescence Protein-based Assay for Studying Neurite Outgrowth in Primary Neurons

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic dysfunction occur in various neurodegenerative diseases and age-related degeneration. Investigation of the mechanisms that regulate neurite outgrowth would not only shed valuable light on brain developmental processes but also on such neurological disorders. Due to the low transfection efficiency, it is currently challenging to study the effect of a specific protein on neurite outgrowth in primary mammalian neurons. Here, we describe a simple method for the investigation of neurite outgrowth by the co-transfection of primary rat cortical neurons with EGFP and a protein of interest (POI). This method allows the identification of POI transfected neurons through the EGFP signal, and thus the effect of the POI on neurite outgrowth can be determined precisely. This EGFP-based assay provides a convenient approach for the investigation of pathways regulating neurite outgrowth.

In this report, we describe a simple protocol for studying neurite outgrowth in embryonic rat cortical neurons by co-transfecting with EGFP and the protein of interest.

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

Neurite outgrowth is a fundamental event in the formation of the neural circuits during nervous system development. Severe neurite damage and synaptic ...

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally replenished in non-mammalian vertebrates such as zebrafish. The zebrafish lateral line system is a useful model for characterizing sensory hair cell regeneration. The lateral line is comprised of hair cell-containing organs called neuromasts, which are linked together by a string of interneuromast cells (INMCs). INMCs act as progenitor cells that give rise to new neuromasts during development. INMCs can repair gaps in the lateral line system created by&#160;cell death. A method is described here for selective INMC ablation using a conventional laser-scanning confocal microscope and transgenic fish that express green fluorescent protein in INMCs. Time-lapse microscopy is then used to monitor INMC regeneration and determine the rate of gap closure. This represents an accessible protocol for cell ablation that does not require specialized equipment, such as a high-powered pulsed ultraviolet laser. The ablation protocol may serve broader interests, as it could be useful for the ablation of additional cell types, employing a tool set that is already available to many users. This technique will further enable the characterization of INMC regeneration under different conditions and from different genetic backgrounds, which will advance the understanding of sensory progenitor cell regeneration.

Laser ablation is a widely applicable technology for studying regeneration in biological systems. The presented protocol describes use of a standard laser-scanning confocal microscope for laser ablation and subsequent time-lapse imaging of regenerating interneuromast cells in the zebrafish lateral line.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, and stress response. More than a decade ago, stem cells were identified in the pituitary gland. However, despite the application of transgenic in vivo approaches, their phenotype, biology, and role remain unclear. To tackle this enigma, a new and innovative organoid in vitro model is developed to deeply unravel pituitary stem cell biology. Organoids represent 3D cell structures that, under defined culture conditions, self-develop from a tissue's (epithelial) stem cells and recapitulate multiple hallmarks of those stem cells and their tissue. It is shown here that mouse pituitary-derived organoids develop from the gland's stem cells and faithfully recapitulate their in vivo phenotypic and functional characteristics. Among others, they reproduce the activation state of the stem cells as in vivo occurring in response to transgenically inflicted local damage. The organoids are long-term expandable while robustly retaining their stemness phenotype. The new research model is highly valuable to decipher the stem cells' phenotype and behavior during key conditions of pituitary remodeling, ranging from neonatal maturation to aging-associated fading, and from healthy to diseased glands. Here, a detailed protocol is presented to establish mouse pituitary-derived organoids, which provide a powerful tool to dive into the yet enigmatic world of pituitary stem cells.

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

The pituitary gland is the key regulator of the body's endocrine system. This article describes the development of organoids from the mouse pituitary as a novel 3D in vitro model to study the gland's stem cell population of which the biology and function remain poorly understood.

Hipofiz Kök Hücre Biyolojisini Keşfetmek için Fare Hipofizinden In Vitro Model Olarak Organoidlerin Geliştirilmesi

The pituitary is the master endocrine gland regulating key physiological processes, including body growth, metabolism, sexual maturation, reproduction, ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...