Nós gostaríamos de reconhecer o apoio financeiro do centro da Legião real britânica para estudos de lesão explosão HA e financiamento do Conselho de pesquisa médica (M01858X/1) para CAH.

1. cultura de células e preparação da amostra <ol><li>obter uma linha de célula apropriada (por exemplo, as células da papila dérmica). 
	Nota: O protocolo atual foi concebido para células aderentes, com fibroblastos de papila dérmica de rato isolados de vibrissae usado como um modelo.</li>
	<li>Cultura de células em um frasco de T-75 contendo o mínimo essencial médio (MEM) α suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina estreptomicina. Manter as células em condições de cultura padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 em um ambiente umidificado até atingirem 80% confluência.</li>
	<li>o meio de aspirar e lavar duas vezes as células Dulbecco &#39; s fosfato salino (PBS). Dissociar as células do recipiente incubando-os em 2 mL de tripsina/EDTA na cultura padrão condições 5 min. verificar brevemente para assegurar que as células com êxito tem dissociada o balão usando um microscópio de contraste de luz/fase (com uma lente de objetiva X 10 ).</li>
	<li>Adicionar 4 mL de meio de cultura para neutralizar a reação tripsinização. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 mL.</li>
	<li>Centrífuga no x 200 g de 4 min para as células de Pelotas. Lentamente, Aspire o sobrenadante, tomando cuidado para não deslocar o pellet. Ressuspender o pellet em 5 mL de meio.</li>
	<li>Transferir uma alíquota de 20 µ l de suspensão de célula para um hemocytometer limpo e contar as células usando um microscópio equipado com uma lente de objetiva 10 X.</li>
	<li>Preparar células para a explosão, colocando três pratos de 35 milímetros dentro de um prato de 90 mm. Rotulá-los adequadamente. Adicionar 2 mL do meio de cada prato de 35mm e um total de 5 x 10 4 células por prato, distribuir as células uniformemente ao redor do prato de sementes. Incubar as amostras experimentais durante a noite, em condições de cultura padrão para permitir a penhora de célula adequada antes da onda de choque exposição. 
	Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril.</li>
</ol> 2. Conjunto de tubo de choque <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> Figura 2 : EVOC Rig e choque tubo Assembly. Imagem do (A) da plataforma EVOC. (B) esquema de aparelho de tubo de choque. Dimensões do tubo de choque incluem um diâmetro interno de 59 mm e um comprimento total, incluindo o equipamento EVOC, de 4,13 m. O comprimento do tubo conduzido e os totais de equipamento EVOC 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Usar botas biqueira de aço e um casaco de laboratório durante os procedimentos de montagem.</li>
	<li>Inserir as barras de dois alinhamento através dos furos de dois parafuso encontraram no plano horizontal da flange de saída. Coloque uma folha de gaxeta de borracha nitrílica sobre a extremidade das barras de alinhamento para que senta-se entre o flange de saída e o equipamento de cultura (EVOC) ex vivo órgão. 
	Nota: O equipamento de EVOC é um dispositivo elétrico projetados para uso com pratos de Petri 35mm ( Figura 2A).</li>
	<li>Coloque o equipamento EVOC para o flange de saída do tubo de choque deslizando o dispositivo elétrico sobre as barras de alinhamento, garantindo que é orientado corretamente para que a seção que contém a placa de Petri está localizada em sua base.</li>
	<li>Introduzir quatro M24 parafusos e anilhas nos furos restantes. Coloque as porcas para que eles toquem a flange.</li>
	<li>Firmemente apertar as porcas e parafusos sequencialmente de forma simétrica na diagonal enquanto visualmente verificar que o tubo de equipamento e choque EVOC ter alinhado com sucesso.</li>
	<li>Anexar um transdutor de pressão para o equipamento de EVOC e conectá-lo à fonte de corrente usando um cabo do sensor. Então, usando um cabo BNC, ligue a fonte de corrente para osciloscópio.</li>
	<li>, Certifique-se de que todos solte válvulas e fluem de controles sobre o tubo de choque está fechadas. Abra a linha interna externa de ar comprimido e manualmente rode o regulador de pressão para carregar o solenoide para 2,5 bar</li>
	<li>Abra a válvula da garrafa de gás comprimido, girando-a no sentido anti-horário 180°.</li>
	<li>Lentamente gire o regulador de pressão, localizado na parte superior da garrafa de gás, no sentido horário para aumentar a pressão para aproximadamente 15 bar 
	Nota: O ponto de ajuste deste regulador deve ser ligeiramente acima do mais alto estourando a pressão do diafragma mais grosso que deve ser usada no experimento.</li>
	<li>Preparar os diafragmas por uma folha de plástico de 0,125 mm de espessura de corte em quadrados de 10 x 10 cm. 
	Nota: A espessura do diafragma será correlacionar com a pressão de rotura, alterando a pressão de pico da onda de choque (ou seja, um diafragma mais grosso irá resultar em uma onda de choque com uma maior pressão de pico; A tabela 1).</li>
</ol> < tabela fo:keep-together.within-página = "1" &gt; <tbody><tr><td>diafragma de Mylar dimensões (cm)</td> <td>pressão (bar) de ruptura</td> <td>Sensor 3 faixa de pressão (kPa)</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,023</td> <td>2 ± 0,2</td> <td>± 47 7.5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0,2</td> <td>± 72 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0,125</td> <td>9,5 ± 0,5</td> <td>± 127 12.5</td></tr></tbody> < / t capaz > tabela 1: Burst pressão correspondente à espessura do diafragma e pressão de pico.
<ol start="11"> <li>criar identificadores sem fita, corrigi-los para a parte superior e inferior do diafragma e usá-los cuidadosamente, posicionar o diafragma ao lado do flange dianteira pequena pela câmara de culatra. Certifique-se de que o diafragma é reta e corretamente posicionado antes de fechar a culatra.</li>
	<li>Este seguro usando quatro M24 parafusos e porcas. Firmemente, aperte as porcas e parafusos em sequência de forma simétrica na diagonal.</li>
</ol> 3. Preparação de células apenas antes da onda de choque exposição <ol><li>Prepare um capuz de fluxo laminar de tecido através da realização de esterilização ultravioleta. Limpá-lo com um desinfetante solução e 70% de etanol. Recolher todos os itens necessários para a manipulação de células prévia para/post-choc exposição de onda e colocá-los dentro do capô estéril. 
	Nota: Isto inclui meio fresco, adesivas membranas permeável ao gás, tesoura estéril, pipeta e pipeta dicas.</li>
	<li>Transferir um prato de Petri de 90 milímetros contendo três amostras experimentais de incubadora para o capô estéril.</li>
	<li>Corte uma membrana permeável ao gás adesiva da folha (ver a Tabela de materiais) em seis quadrados, tal que cada um é grande o suficiente para cobrir o topo de um prato de Petri de 35 mm.</li>
	<li>Aspire o médio de 35 milímetros de Petri, coloque a tampa de um lado e cubra com duas seções de adesivo membranas permeável ao gás, garantindo que não há um selo apertado entre a membrana e a borda do prato.</li>
	<li>Transferir a amostra para o equipamento de EVOC e fixá-lo na base de fixação do modo que a parte superior do prato está alinhada com a base interna do tubo de choque.</li>
</ol> 4. Operação do tubo de choque <ol><li>usar protectores auriculares, óculos de proteção de olho, botas de segurança e um casaco de laboratório ao pressurizar o sistema de tubo de choque.</li>
	<li>Rode o botão de controle de fluxo da válvula, permitindo que o gás flua a mangueira flexível conectando o cilindro de ar comprimido para o tubo de choque.</li>
	<li>Na parte inferior do painel de controle, selecione o &#34; duplo culatra &#34; entrada para um wav de choque de curta duraçãoe ou o &#34; tubo condutor &#34; entrada para uma duração maior onda.</li>
	Ligue a fonte de alimentação CC e osciloscópio para adquirir os dados de forma de onda de <li>. Definir a taxa de amostragem osciloscópio de 50,0 MS/s, com um comprimento de 1 M do registro pontos. Definir um intervalo de 50 mV para disparar no bar 2 e 100 mV para acima de 4 bar</li>
	<li>Ligar as luzes de segurança utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle. 
	Nota: Este diz que outros pesquisadores não para entrar na sala quando o tubo de choque está cobrando.</li>
	<li>Ligue o interruptor da caixa de controle do solenoide para fechar o solenoide. 
	Nota: Esse recurso de segurança fecha uma válvula situada na câmara de culatra dupla, permitindo o sistema a ser carregado.</li>
	<li>No painel de controle, abra lentamente o controle de fluxo girando o botão no sentido anti-horário para aumentar gradualmente a pressão dentro da câmara de compressão. Monitorar a pressão usando o visor do painel de controle.</li>
	<li>, Uma vez que a pressão de ruptura do diafragma é alcançado, o diafragma se romper e um &#34; bang &#34; será ouvido. Fechar rapidamente o controle de fluxo girando o botão. 
	Nota: A onda de choque vai viajar para baixo o tubo da amostra de célula e a extremidade do tubo.</li>
	<li>Abrir o solenoide, desligando o interruptor na caixa de controle do solenoide e desligar a luz de segurança (utilizando o interruptor na parede em frente ao painel de controle).</li>
	<li>Transferir a amostra de células para o hood estéril, remova as adesivas membranas permeável ao gás e encher o prato com 2 mL de meio de cultura fresco. As células podem ser usadas imediatamente para avaliação, conforme descrito na etapa 5, ou voltou para a incubadora para estudos de longo prazo.</li>
</ol> 5. Viabilidade celular <ol><li>avaliar viabilidade de celular após a exposição de ondas de choque, usando a combinação de um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. 
	Nota: Para a imagem latente fluorescente, células devem ser propagadas para as lamelas de vidro estéril durante a seção 1: preparação de cultura e amostra de células. Estes podem ser colocados dentro os pratos de petri 35mm.</li>
	<li>Transferência de 200 µ l de reagente indicador redox (consulte a Tabela de materiais) para cada prato experimental diretamente depois da recarga-los com 2 mL de pós-choque médio onda exposição. Incubar a condições de cultura padrão para 4 h.</li>
	<li>Para cada prato, transferir (em uma capa escura de estéril) alíquotas de 2 x 100 µ l para um preto ou limpar a placa de 96 poços, dependendo se fluorescência ou absorvância será usada para avaliar a viabilidade.</li>
	<li>Transferir a placa de 96 poços para um leitor adequado equipado com os filtros corretos e ler usando a excitação bandas 530ex/590em de fluorescência ou 570 nm combinado com uma referência de 600 nm para absorvância. Exportar e salvar os dados.</li>
	<li>Analisar os dados para identificar qualquer diferença entre a onda de choque-expostos amostras e controles não-expostos, como isso pode indicar uma queda na viabilidade celular. 
	Nota: Um controle negativo também deve ser incluído no projeto experimental. Além disso, a interpolação de uma curva padrão pode ser usada para calcular números de celular.</li>
	<li>, Aspire o meio contendo o reagente de indicador redox. Substituí-lo com 2 mL de meio fresco e incube as celulas em condições de cultura padrão para 24 h.</li>
	<li>Repita os passos acima, se necessário para obter um segundo ponto de tempo de viabilidade.</li>
	<li>Para a imagem fluorescente de células vivas e mortas, Aspire o meio e lavar as células duas vezes em 1 mL de PBS. Transferir 100 µ l de reagente completo encontrado na imagem kit (veja a Tabela de materiais) para cada amostra e incubar a temperatura ambiente protegida da luz por 15 min.</li>
	<li>Reagente de aspirar e lavar uma vez usando 1 mL de PBS. Usando pinças de ponta fina, cuidadosamente remova o prato de 35mm a lamela e colocá-lo virado para baixo sobre uma lâmina de vidro de microscopia.</li>
	<li>Adquirir imagens para cada amostra, usando um microscópio fluorescente (10 X da lente objetiva, abertura numérica 0.50) equipados com os filtros de excitação e emissão corretos (ex / em 488 nm/515 nm e 570 nm nm/602). 
	Nota: Células vivas irão emitir fluorescência intensa, uniforme, verde. Mortos ou moribundos células com uma membrana celular comprometida serão absorção do componente kit morto, resultando em emissão de fluorescência vermelha, encontrados predominantemente na região nuclear da célula.</li>
	<li>Usar a análise de imagem, software para também manualmente ou automaticamente contar o número de células vivas e mortas de cada imagem.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Lesões primárias obtidas da exposição a eventos de explosão ainda não são totalmente compreendidos. Identificar e compreender os mecanismos que provocam lesões induzida pela explosão, como da lesão cerebral traumática3,4 e ossificação heterotópica6,7, são importantes primeiros passos para o desenvolvimento métodos eficazes de profilaxia. Para ajudar a alcançar este objetivo, um número de sistemas experimentais foram desenvolvido para replicar a explosão evento exposição11,12,13,14,18,19 . A técnica descrita aqui usa tubo equipamento de choque (Figura 2) capaz de disparar ondas de choque em uma gama de pressões em todo o corpo (ou seja, roedores), amostras de células ou tecidos. A capacidade de carregar tipos de células individuais em vez de tecidos dá a capacidade de analisar respostas celulares distintas, como dano pode ocorrer simultaneamente através de uma variedade de mecanismos1,2. Por exemplo, para modelar traumático lesão cerebral, a avaliação dos tipos de células individuais, tais como os neurônios e astrócitos, pode permitir a identificação de lesões de células específicas. Além disso, a resposta de todo órgão pode ser avaliada usando o tecido cerebral. Ambos os tipos de célula individual e as amostras de tecido tem valor e podem dar informações diferentes. Também é possível alterar a quantidade de ar que é pressurizado para gerar o choque, selecionando a entrada dupla-culatra ou condutor-tubo. Este controla a duração da onda de choque. Outra possibilidade é mudar o diafragma material e espessura para alterar a pressão de pico25.
Outro fator a considerar são efeitos de fim de interferências que podem estar presentes quando o compartimento de amostra está localizado perto da saída do tubo de choque, como a encontrada na plataforma EVOC descrita no actual sistema. Cavalcanti et al . olhou para explosão onda perfis encontrados em locais diferentes em um tubo de choque controlado por compressão e encontrado que a forma de onda Friedlander foi melhor representada em um local dentro do tubo de choque15. Kuriakose et al também estudou o secundário carregamento da amostra e descobriu que a colocação de uma placa final no final do tubo de choque era capaz de eliminar ondas refletidas indesejados16. Considerando os dados encontrados nestas publicações15,16, futuras modificações para melhorar o sistema de tubo de choque descrito neste artigo poderiam envolver a colocação do equipamento em um local mais profundo dentro do tubo conduzido EVOC ou, Alternativamente, a inclusão de uma placa final do tubo de choque. Limitações do método descrito poderiam incluir a taxa de transferência relativamente baixa das amostras. Um único usuário pode operar o tubo de choque com segurança em uma saída de em torno de 6-8 amostras por hora. Actualmente, o sistema é projetado em torno do uso de pratos de petri 35mm único. Portanto, maiores experimentos contendo vários grupos e repetições biológicas podem ser difícil de alcançar.
Este artigo de métodos mostra como a viabilidade das células da papila dérmica aderentes foi afetada pela exposição a uma única onda de choque. Uma onda de choque de curta duração (&#60; 10 ms) de ≤72 kPa não afetou viabilidade quando comparado ao controle (Figura 3 e Figura 4). Em contraste, uma onda de choque no 127 kPa estimulou uma queda significativa na viabilidade no pós explosão 24h, como mostrado por um ensaio de indicador redox (Figura 3) e análise de imagens fluorescentes (Figura 4). Miller et al relataram uma redução similar na viabilidade celular em culturas de fatias hippocampal do rato organotypic quando as células foram expostas a um qualquer um 147 kPa ou onda de choque de 278 kPa usando um tubo de choque em aberto, orientado por Hélio14. Em contraste, VandeVord et al . reportou que não havia nenhum efeito sobre a viabilidade em astrócitos de ratos expostos a uma sobrepressão de curta duração de &#62; 200 kPa, embora um barochamber foi usado em vez de um tubo de choque18. Deve notar-se que a pressão externa é dependente da onda de explosão, embora isto cria ondas de estresse complexo dentro do corpo, portanto, tornando a natureza do carregamento altamente depende das propriedades mecânicas do tecido ou da célula. Estudos de caracterização adicional da resposta celular aos eventos de explosão é necessária. Além disso, avaliando exposição de onda de choque a nível celular, como mostrado nesta técnica, respostas biológicas acionadas por lesão, tais como a perturbação de sinalização de percursos ou alterações epigenéticas, podem ser identificadas e exploradas ainda mais.
Em conclusão, este trabalho descreve o uso de um tubo de aço inoxidável de choque e um aparelho EVOC modificado para incorporar culturas celulares primárias. Ondas de choque em uma gama de pressões podem ser geradas e propagadas em células vivas para replicar os efeitos que ocorrem pela exposição a uma onda de choque. Este protocolo demonstra como avaliar a viabilidade celular, mas a longo prazo alterações em tipos de células individuais também podem ser estudadas. Vai em frente, pretendemos avaliar os efeitos diferenciais que complexas ondas de choque pode eliciar em diferentes tipos de células, com o objectivo de aprofundar a nossa compreensão das lesões primárias induzida pela explosão.

Com a recente tendência para a utilização de dispositivos explosivos improvisados em modern warfare e ações terroristas contra civis, compreender os efeitos de eventos explosivos no corpo humano é de grande importância. Ferimentos obtidos através da exposição a eventos de explosão podem ser mortal e letal, com os processos físicos de lesão a ser divididos em quatro categorias. Resultado de lesões primárias de exposição directa para a onda da explosão, que interage com o corpo localmente de forma compressiva e posteriormente expansiva, causando a ruptura de membranas e tecidos moles1. Lesões secundárias incluem trauma contuso ou penetrante feridas causadas pelo impacto com objetos de baixa massa impelidos a alta velocidade pela onda de explosão. Lesões terciárias ocorrem quando a onda da explosão tem energia suficiente para lançar objetos de massa alta ou indivíduos contra objetos. Por último, lesões de explosão quaternária são definidos por outros diversos ferimentos que não cabem as outras categorias, tais como queimaduras flash2. Após exposição a tais eventos de explosão, lesões primárias incluem54,3,do lesão cerebral traumática, ossificação heterotópica6,7, explosão de lesão pulmonar8, perda de audição 9e os outros10.
Uma forma de onda observada comumente de eventos de explosão é a onda de Friedlander, representando uma explosão de campo livre, em oposição a um espaço fechado. A forma de onda é composto por uma frente de explosão que pode ser definida como um aumento afiado e rápido da pressão positiva. Isto é seguido imediatamente por um vento de explosão de ar se movendo em alta velocidade e uma onda de liberação que reduz a pressão para abaixo dos níveis atmosféricos. Um vácuo parcial é deixado na região da explosão inicial, que resulta no lento refluxo de ar. As fases positivas e negativas da onda (figura 1A) resultam no movimento de encaixe da explosão onda1. Para ajudar a elucidar os mecanismos por trás de lesões de impacto, modelos experimentais foram criados para produzir formas de onda, tais como a onda de Friedlander, que células e tecidos terá de enfrentar quando exposta a um evento de explosão genuíno. Atuais sistemas listados na literatura incluem choque tubos11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, o Kolsky bar20, explosão avançados simuladores21, o Split Hopkinson pressão bar22e a recriação de eventos alternativos de explosão em um ambiente controlado usando Tetranitrato de pentaeritritol23. Apesar da ampla gama de modelos disponíveis, muitas variáveis influenciam o prejuízo obtido a partir de ondas de explosão, incluindo o pré-estresse aplicado e as propriedades mecânicas do, os tipos de células individuais ou tecidos sob avaliação24. Enquanto o estudo de tecidos ou órgãos pode lançar luz sobre a deformação do tecido e brutas alterações morfológicas sofridas como resultado de eventos de explosão, análise a nível celular pode revelar alterações epigenéticas e transcriptional influenciadas pela onda de choque.
Este artigo de métodos descreve uma técnica para propagar ondas de choque em uma gama de pressões sobre células vivas em uma monocamada. Isto permite a caracterização imediata da viabilidade celular, elucidar os limiares de dano potencial das ondas de choque. Além disso, células viáveis podem ser retornadas para as condições de cultura padrão, e podem ser avaliados a longo prazo efeitos biológicos do evento explosão. O protocolo abaixo descreve duas técnicas de viabilidade celular que podem ser usadas em células em cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figura 1: Aproximação de uma onda de Friedlander. (A) uma aproximação de uma onda de Friedlander observada no sensor 3 do tubo de choque. (B) dados representativos mostrando os perfis diferentes de pressão observados em sensores, 1, 2 e 3 do tubo de choque. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

Exposição a eventos de explosão pode causar trauma grave de órgãos vitais como os pulmões, ouvidos e cérebro. Compreender os mecanismos por trás de tais ferimentos induzida a explosão é de grande importância, tendo em conta a recente tendência para a utilização de explosivos em modern warfare e incidentes relacionados ao terrorista. Para entender completamente a lesão induzida pela explosão, nós deve primeiro ser capazes de replicar tais eventos de explosão em um ambiente controlado, usando um método reprodutível. Esta técnica usando equipamento de tubo de choque, as ondas de choque em uma gama de pressões podem ser propagadas sobre células vivas cultivadas em 2D e marcadores de viabilidade celular podem ser imediatamente analisados usando um ensaio de indicador redox e a imagem fluorescente de células vivas e mortas. Este método demonstrou que aumentando a sobrepressão de explosão de pico para 127 kPa pode estimular uma significativa queda na viabilidade celular quando comparados aos controles não tratados. Amostras de teste não estão limitadas a células aderentes, mas pode incluir suspensões celulares, amostras de tecido e todo o corpo, através de pequenas modificações para a instalação de tubo de choque. Replicar as condições exatas que tecidos e células experimentam quando expostos a um evento de explosão genuíno é difícil. Técnicas como o apresentado neste artigo podem ajudar a definir limiares de dano e identificar as alterações epigenéticas e transcriptional dentro das células resultantes de exposição de ondas de choque.

Crescido em uma monocamada de células usando o método acima descrito, foram expostas em triplicado para as ondas de choque geradas usando um tubo de choque (Figura 2B). Marcadores de viabilidade celular foram avaliados. Usando um ensaio de indicador redox, verificou que a aplicação de uma onda de choque de 127 kPa foi capaz de reduzir significativamente a viabilidade das células de papila dérmica em comparação aos controles após 24h em cultura (Figura 3). A aplicação de uma onda de choque ≤72 kPa não reduz a viabilidade. Para apoiar estas observações, utilizou-se um ensaio de imagem fluorescente capaz de fluorescente rotulagem células ao vivo ou mortas com fluorophores verde ou vermelha, respectivamente. A quantificação de células vivas e mortas de 13 imagens fluorescentes por replicar biológica demonstrou uma redução na viabilidade celular em pessoas expostas à onda de choque de 127 kPa quando comparado ao controle (Figura 4). Análise estatística foi realizada utilizando uma One-Way ANOVA, seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, com p &#60; 0,05 considerado estatisticamente significativo. O tamanho da amostra por grupo totalizou 9 para o ensaio de indicador redox e 39 para a análise de imagens de fluorescência quantitativa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figura 3 : Dados de ensaio de indicador redox mostrando tempo curso de viabilidade celular após a exposição de ondas de choque. Significativamente menos células foram observadas após 24 h do grupo de ondas de choque-expostos 127-kPa quando comparado com o controle não tratado. O controle negativo que consistia de um tratamento de 30-s com 2% desinfetante (consulte a tabela de materiais) mostrou significativamente menos células no T0 e 24 h, em comparação com todos os outros grupos. Cada barra representa o média ± 1 desvio-padrão (SD); réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0,05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figura 4 : Fluorescência Imaging. (A) dados quantitativos recolhidos do fluorescentes imagens de células vivas e mortas capturadas usando um microscópio de fluorescência na exposição de ondas de pós-choque 24 h. Significativamente menos células viáveis foram observadas em kPa a 127 (quer dizer = 93.42) amostra exposta por ondas de choque em comparação com o 47 kPa (quer dizer = 98.18), 72 kPa (quer dizer = 98.87) e grupos de controle (quer dizer = 99.10). Não há células viáveis foram observadas no grupo controle negativo após 24h (quer dizer = 0). (B) imagens de fluorescência representativa. Verde mostra células vivas, enquanto o vermelho mostra as células mortas. Cada parcela de caixa mostra os quartis superiores e inferiores com bigodes de Tukey; réplicas biológicas, N = 3; técnico Replica, n = 13. = p &#60; 0,0001. Barra de escala = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Compreensão de como as células são moduladas pela exposição a ondas de choque pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes lesões acionados por eventos de explosão. Este protocolo usa equipamento de tubo de choque custom-built para aplicar as ondas de choque em uma gama de pressões de monocamadas de células e identificar os efeitos subsequentes na viabilidade celular.

Avaliar impacto efeitos In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K visualizações.  Imperial College London. Compreensão de como as células são moduladas pela exposição a ondas de choque pode ajudar a identificar os mecanismos subjacentes lesões acionados por eventos de explosão. Este protocolo usa equipamento de tubo de choque custom-built para aplicar as ondas de choque em uma gama de pressões de monocamadas de células e identificar os efeitos subsequentes na viabilidade celular.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo microfluídicos para Recriando um microambiente do tumor<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Bioengenharia

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Enriquecimento protéico de baixo peso molecular em filmes finos de sílica mesoporosa para a descoberta de biomarcadores

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Colheita Murino macrófagos alveolares e Avaliação de ativação celular induzida por nanopartículas polianidrido

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

aplicações de<em&gt; In Vivo</em&gt; Teste Funcional do Rato tibial anterior para a Avaliação da engenharia de tecidos Repair Músculo Esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia de fluorescência de luz-folha para capturar imagens 4-Dimensional dos efeitos de modulação de tensão de cisalhamento sobre o coração em desenvolvimento de Zebrafish

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...