Vorremmo riconoscere il sostegno finanziario del Royal British Legion centro per gli studi di lesione Blast HA e finanziamenti dal Medical Research Council (M01858X/1) di CAH.

1. coltura delle cellule e preparazione del campione <ol><li>ottenere un'opportuna linea cellulare (ad es., cellule di papilla dermica). 
	Nota: Il protocollo attuale è stato progettato per le celle aderenti, con fibroblasti di papilla dermica del ratto isolati da vibrisse usati come modello.</li>
	<li>Della coltura le cellule in una bottiglia di T-75 contenente α di medie essenziale minimo (MEM) completati con 10% siero bovino fetale e 1% penicillina streptomicina. Mantenere le cellule in condizioni di coltura standard di 37 ° C e 5% di CO 2 in un ambiente umidificato, fino a quando non raggiungono la confluenza di 80%.</li>
	<li>Il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte in Dulbecco &#39; soluzione tampone fosfato (PBS) e s. Dissociare le cellule dalla beuta di incubarle in 2 mL di tripsina/EDTA alle impostazioni cultura standard condizioni per 5 min, brevemente verifica per assicurare che le cellule hanno correttamente dissociato dalla beuta utilizzando un microscopio a contrasto di fase luce (con un obiettivo obiettivo 10x ).</li>
	<li>Aggiungere 4 mL di terreno di coltura per neutralizzare la reazione di trypsinization. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.</li>
	<li>Centrifuga a 200 x g per 4 min agglomerare le cellule. Lentamente e aspirare il supernatante, facendo attenzione a non per staccare il pellet. Risospendere il pellet in 5 mL di terreno.</li>
	<li>Trasferire un'aliquota di 20 µ l della sospensione delle cellule un emocitometro pulito e contare le celle utilizzando un microscopio dotato di un obiettivo obiettivo 10 X.</li>
	<li>Preparare le celle per l'esplosione inserendo tre piatti di 35 mm all'interno di un piatto di 90 mm. Etichettarli in modo appropriato. Aggiungere 2 mL di terreno ad ogni piatto di 35mm e un totale di 5 x 10 4 celle per ogni piatto, distribuire le cellule in modo uniforme intorno al piatto del seme. Incubare i campioni sperimentali durante la notte in condizioni di coltura standard per consentire per adesione cellulare adeguata prima dell'esposizione Ondashock. 
	Nota: Per l'imaging di fluorescenza, le cellule devono essere seminate su lamelle di vetro sterile.</li>
</ol> 2. Assemblea di tubo di scossa <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig2.jpg" /> Figura 2 : EVOC Rig e Shock Tube Assembly. (A) immagine del rig EVOC. (B) disegno schematico dell'apparato del tubo di scossa. Dimensioni del tubo di scossa includono un diametro interno di 59 mm e una lunghezza totale, compreso l'impianto di perforazione EVOC, 4,13 m. La lunghezza del tubo guidato e i totali di rig EVOC 2,71 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>Indossare stivali da lavoro in acciaio-punta e un camice da laboratorio durante le procedure di montaggio.</li>
	<li>Inserto delle due barre attraverso i due fori trovano sul piano orizzontale della flangia presa. Posizionare un foglio di guarnizione di gomma nitrilica sopra l'estremità delle barre di allineamento in modo che si trova tra la flangia di uscita e il rig ex vivo organo cultura (EVOC). 
	Nota: L'impianto di perforazione EVOC è un apparecchio di misura destinato all'uso con 35 mm di Petri ( Figura 2A).</li>
	<li>Collegare l'impianto di perforazione EVOC per la flangia di uscita del tubo di scossa facendo scorrere il fissaggio delle barre, assicurando che sia orientato correttamente affinché la sezione che contiene la capsula di Petri si trova alla sua base.</li>
	<li>Inserire i fori rimanenti quattro bulloni M24 e rondelle. Posizionare i dadi in modo che tocchino la flangia.</li>
	<li>Fissare saldamente i dadi e bulloni in sequenza in modo diagonale simmetrico mentre controllando visivamente che il tubo di rig e scossa EVOC sono correttamente allineati.</li>
	<li>Allegare un trasduttore di pressione per l'impianto di perforazione EVOC e collegarlo all'origine corrente utilizzando un cavo sensore. Quindi, utilizzando un cavo BNC, collegare la sorgente di corrente all'oscilloscopio.</li>
	<li>Assicurarsi che tutte le valvole di rilascio e controlli del tubo di scossa di flusso sono chiusi. Aprire la linea di aria compressa esterna incorporata e girare manualmente il regolatore di pressione in senso orario per caricare il solenoide a 2,5 bar</li>
	<li>Aprire la valvola di sicurezza sulla bombola del gas compresso ruotandolo in senso antiorario 180°.</li>
	<li>Girare lentamente il regolatore di pressione, situato sulla cima di bombola del gas, in senso orario per aumentare la pressione di circa 15 bar 
	Nota: Il punto di impostazione di questo regolatore dovrebbe essere leggermente sopra il più alta pressione di scoppio del diaframma più spesso che deve essere utilizzato nell'esperimento.</li>
	<li>Preparare i diaframmi tagliando un foglio di plastica di spessore mm 0,125 in quadrati di 10 cm x 10 cm. 
	Nota: Lo spessore del diaframma mette in correlazione con la pressione di scoppio, alterando la pressione di picco dell'onda d'urto (cioè, un diaframma più spesso si tradurrà in un'onda d'urto con una più grande pressione di picco; Tabella 1).</li>
</ol> < tavolo fo:keep-together.within-pagina = "1" &gt; <tbody><tr><td>diaframma Mylar dimensioni (cm)</td> <td>pressione (bar) di scoppio</td> <td>Sensor 3 range di pressione (kPa)</td></tr> <tr><td>x 10 x 10 0,023</td> <td>2 ± 0,2</td> <td>47 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.050</td> <td>4 ± 0.2</td> <td>72 ± 7,5</td></tr> <tr><td>10 x 10 x 0.125</td> <td>9,5 ± 0,5</td> <td>127 ± 12.5</td></tr></tbody> < / t in grado > tabella 1: Burst pressione corrispondente allo spessore del diaframma e picco di pressione.
<ol start="11"> <li>creare maniglie dal nastro, fissano gli stessi alla parte superiore e inferiore del diaframma e utilizzarli per posizionare con attenzione il diaframma accanto alla piccola flangia anteriore dall'alloggiamento della culatta. Assicurarsi che il diaframma è dritto e il corretto posizionamento prima di chiusura dell'otturatore.</li>
	<li>Questo fissare con quattro bulloni M24 e dadi. Fissare saldamente i dadi e bulloni in sequenza in modo diagonale simmetrico.</li>
</ol> 3. Preparazione di cellule appena prima dell'esposizione alle onde di Shock <ol><li>preparare una cappa a flusso laminare tessuto eseguendo sterilizzazione a raggi ultravioletti. Pulirlo con un disinfettante soluzione e 70% di etanolo. Raccogliere tutti gli elementi necessari per manipolazione cellule preventiva per/post-shock wave esposizione e inserirli all'interno della cappa sterile. 
	Nota: Questo include mezzo fresco, adesive membrane permeabili al gas, forbici sterili, le pipette e pipetta suggerimenti.</li>
	<li>Trasferire un piatto di Petri di 90 mm contenente tre campioni sperimentali dall'incubatrice alla cappa sterile.</li>
	<li>Taglio una membrana permeabile al gas adesiva foglio (Vedi la Tabella materiali) in sei quadrati, tale che ognuno è grande abbastanza per coprire la parte superiore di una piastra di Petri di 35 mm.</li>
	<li>Aspirare il mezzo da 35 mm di Petri, mettere il coperchio su un lato e coprire con due sezioni di adesivo membrane permeabili al gas, assicurando che ci sia una perfetta tenuta tra la membrana e il bordo del piatto.</li>
	<li>Trasferire il campione per l'impianto di perforazione EVOC e fissarlo alla base dell'apparecchio in modo che la parte superiore del piatto è allineata la base interna del tubo di scossa.</li>
</ol> 4. Funzionamento del tubo di scossa <ol><li>indossare cuffie antirumore, occhiali, stivali di sicurezza e un camice da laboratorio quando pressurizzando il sistema del tubo di scossa.</li>
	<li>Ruotare la manopola di controllo del flusso del regolatore in senso orario, consentendo di gas di fluire nel tubo flessibile collegare la bombola di aria compressa per il tubo d'urto.</li>
	<li>Nella parte inferiore del pannello di controllo, selezionare il &#34; doppia culatta &#34; ingresso per un wav di scossa di breve duratae o il &#34; Driver tubo &#34; ingresso per una durata maggiore onda.</li>
	<li>Interruttore sulla fonte di alimentazione CC e oscilloscopio per acquisire i dati di forma d'onda. Impostare la frequenza di campionamento di oscilloscopio a 50,0 MS/s, con record di lunghezza di 1 M punti. Impostare un intervallo di 50 mV per la cottura a 2 bar e 100 mV per sopra 4 bar</li>
	<li>Accendere le luci di sicurezza utilizzando l'interruttore sulla parete di fronte il pannello di controllo. 
	Nota: Questo dice di non entrare nella stanza quando il tubo d'urto è in carica, altri ricercatori.</li>
	<li>Accendere l'interruttore sulla casella di controllo solenoide per chiudere l'elettrovalvola. 
	Nota: Questa funzionalità di sicurezza chiude una valvola posta sulla camera doppia culatta, permettendo al sistema per l'addebito.</li>
	<li>Il pannello di controllo, aprire lentamente il controllo di flusso, ruotando la manopola in senso antiorario per aumentare gradualmente la pressione all'interno della camera di compressione. Monitorare la pressione utilizzando il display del pannello di controllo.</li>
	<li>Una volta che il diaframma pressione di scoppio è raggiunto, rompe il diaframma e un &#34; bang &#34; si sentirà. Chiudere rapidamente il controllo di flusso, ruotando la manopola. 
	Nota: L'onda d'urto si recherà giù per il tubo sopra il campione di cellule e fuori l'estremità del tubo.</li>
	<li>Aprire il solenoide disattivando l'interruttore sulla casella di controllo solenoide e spegnere la luce di sicurezza (utilizzando l'interruttore sulla parete di fronte il pannello di controllo).</li>
	<li>Trasferire il campione di cellule per la cappa sterile, rimuovere l'adesive membrane permeabili al gas e riempire il piatto con 2 mL di terreno di coltura fresco. Le celle possono essere utilizzate immediatamente per la valutazione, come descritto nel passaggio 5, o restituite nell'incubatore per studi a più lungo termine.</li>
</ol> 5. Vitalità cellulare <ol><li>valutare la vitalità cellulare dopo l'esposizione di onde d'urto utilizzando la combinazione di un saggio di indicatore redox e l'imaging fluorescente di vivi e morte cellule. 
	Nota: Per l'imaging di fluorescenza, le cellule devono essere seminate su lamelle di vetro sterile durante la sezione 1: cultura e preparazione di campioni di cella. Questi può essere posizionati all'interno le capsule di Petri 35 mm.</li>
	<li>Trasferire 200 µ l del reagente indicatore redox (Vedi la Tabella materiali) a ogni piatto sperimentale direttamente dopo il loro riempimento con 2 mL di post-shock media onda dell'esposizione. Incubare a condizioni di coltura standard per 4 h.</li>
	<li>Per ogni piatto, trasferire (in un cappuccio scuro sterile) aliquote di 2 x 100 µ l per entrambi un nero o deselezionare piastra a 96 pozzetti, a seconda se la fluorescenza o assorbanza verrà utilizzato per valutare la fattibilità.</li>
	<li>Trasferire la piastra a 96 pozzetti per un lettore di piastra appropriato con i filtri corretti e leggere con eccitazione bande 530ex/590em per fluorescenza o 570 nm combinata con un riferimento di 600 nm per assorbanza. Esportare e salvare i dati.</li>
	<li>Analizzare i dati per identificare eventuali differenze tra onde d'urto-esposti campioni e controlli non esposto, poiché questo può indicare un calo nell'attuabilità delle cellule. 
	Nota: Un controllo negativo deve essere inclusi anche nel disegno sperimentale. Inoltre, l'interpolazione di una curva standard può essere utilizzato per calcolare i numeri di cell.</li>
	<li>Aspirare il supporto contenente il reagente di indicatore redox. Sostituirlo con 2 mL di terreno nuovo e incubare le cellule in condizioni di coltura standard per 24 h.</li>
	<li>Ripetere i passaggi precedenti come necessario ottenere un secondo punto di tempo di attuabilità.</li>
	<li>Per l'imaging di fluorescenza delle cellule vivi e morte, il mezzo di aspirare e lavare le cellule due volte in 1 mL di PBS. Trasferire 100 µ l del reagente completo trovato nell'imaging kit (vedere la Tabella materiali) per ogni campione e incubare a temperatura ambiente al riparo dalla luce per 15 min.</li>
	<li>Il reagente di aspirare e lavare una volta con 1 mL di PBS. Usando pinze a punta fine, attentamente rimuovere il vetrino coprioggetto dal piatto di 35 mm e metterlo a faccia in giù su un vetrino di microscopia.</li>
	<li>Acquisire immagini per ciascun campione utilizzando un microscopio a fluorescenza (obiettivo obiettivo 10x, 0.50 apertura numerica) montato con i filtri di eccitazione e di emissione corretti (ex / em 488 nm/515 nm e 570 nm nm/602). 
	Nota: Cellule vive emette fluorescenza intensa, uniforme, verde. Cellule morte o morenti con una membrana cellulare compromessa saranno l'assorbimento il componente kit morto, con conseguente emissione di fluorescenza rossa, trovati principalmente nella regione nucleare della cellula.</li>
	<li>Utilizzare l'analisi di immagine software per sia manualmente o automaticamente contare il numero di cellule vivi e morti da ogni immagine.</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Lesioni primarie ottenute dall'esposizione agli eventi esplosione ancora completamente non sono capite. Identificare e comprendere i meccanismi che si innescano lesioni blast-indotta, come di lesioni cerebrali traumatiche3,4 e ossificazione heterotopic6,7, sono passi importanti per lo sviluppo metodi efficaci di profilassi. Per raggiungere questo obiettivo, un numero di sistemi sperimentali è stato sviluppato per replicare blast evento esposizione11,12,13,14,18,19 . La tecnica descritta qui utilizza attrezzature di tubo di shock (Figura 2) in grado di sparare onde d'urto in una gamma di pressioni al corpo intero (cioè, roditore), tessuto o campioni di cellule. La possibilità di caricare tipi di cellule individuali piuttosto che interi tessuti dà la possibilità di analizzare le risposte cellulari distinte, come danni possono verificarsi contemporaneamente tramite una serie di meccanismi1,2. Ad esempio, per modellare traumatico cranico, la valutazione di singoli tipi di cellule, quali i neuroni ed astrociti, può consentire per l'identificazione di lesioni di cellula-specifico. Inoltre, la risposta di tutto-organo può essere valutata utilizzando il tessuto cerebrale. Entrambi i tipi di cellule individuali e gli esemplari del tessuto hanno valore e possono dare informazioni diverse. È anche possibile modificare la quantità di aria che è pressurizzato per generare lo shock selezionando l'ingresso doppio-culatta o driver-tubo. Questo controlla la durata dell'onda d'urto. Un'altra possibilità consiste nel modificare il materiale della membrana e lo spessore di alterare la pressione di picco25.
Un altro fattore da considerare sono gli effetti di fine di interferenza che possono essere presenti quando l'alloggiamento del campione si trova vicino all'uscita del tubo di scossa, come quello trovato su rig EVOC descritto nel sistema attuale. Corbetta et al. visto anche blast wave profili trovati su posizioni diverse su un tubo di compressione-driven shock e trovato che la forma d'onda di Friedlander meglio è stata rappresentata in una posizione profonda nell'urto tubo15. Kuriakose et al. anche studiato secondaria caricamento del campione e trovato che il posizionamento di una piastra terminale all'estremità del tubo di scossa è stato in grado di eliminare le onde riflesse indesiderate16. Considerando i dati trovati in queste pubblicazioni15,16, future modifiche per migliorare il sistema del tubo di scossa descritto in questo articolo potrebbero coinvolgere il posizionamento dell'impianto di perforazione EVOC in una posizione più profonda all'interno del tubo guidato o, in alternativa, l'inclusione di una piastra di estremità del tubo di scossa. Limitazioni del metodo descritto potrebbero includere la relativamente bassa velocità di trasmissione dei campioni. Un singolo utente può utilizzare il tubo di scossa in piena sicurezza ad una produzione di circa 6-8 campioni / ora. Allo stato attuale, il sistema è stato progettato intorno all'uso singola 35 mm piastre Petri. Pertanto, gli esperimenti più grandi che contengono più gruppi e replicati biologici possono essere difficili da raggiungere.
Questo articolo di metodi viene illustrato come la vitalità delle cellule della papilla dermica aderente è stata influenzata dall'esposizione a una singola onda d'urto. Un'onda di scossa di breve durata (&#60; 10 ms) di ≤72 kPa non ha influenzato la redditività rispetto al controllo (Figura 3 e Figura 4). Al contrario, un'onda d'urto a 127 kPa ha stimolato un calo significativo nell'attuabilità a post-spasso 24h, come mostrato da un saggio di indicatore redox (Figura 3) e l'analisi delle immagini fluorescenti (Figura 4). Miller et al ha segnalato una riduzione simile nell'attuabilità delle cellule nelle colture hippocampal fetta di ratto organotipiche quando le cellule sono state esposte a un uno una 147 kPa o 278 kPa shock wave utilizzando un open-ended, Elio-driven shock tubo14. Al contrario, VandeVord et al ha segnalato che non c'era alcun effetto sulla vitalità negli astrociti di ratto esposti ad una sovrapressione di breve durata di &#62; 200 kPa, anche se una camera di decompressione è stato usato piuttosto che una scossa tubo18. Dovrebbe essere notato che la pressione esterna si affida all'onda d'urto, anche se questo crea onde stress complesso all'interno del corpo, rendendo quindi la natura del carico altamente dipendono le proprietà meccaniche dei tessuti o delle cellule. Studi di ulteriore caratterizzazione della risposta cellulare agli eventi di esplosione è necessaria. Inoltre, di valutare l'esposizione di onda d'urto a livello cellulare, come mostrato in questa tecnica, risposte biologiche innescate dal pregiudizio, come ad esempio la perturbazione della segnalazione vie o i cambiamenti epigenetici, possono essere identificate e ulteriormente esplorate.
In conclusione, questo lavoro viene descritto l'utilizzo di un tubo di acciaio inox scossa e un rig EVOC modificato per incorporare colture cellulari primarie. Onde d'urto in una gamma di pressioni può essere generate e propagate su cellule vive per replicare gli effetti che si verificano da esposizione a un'onda d'urto. Questo protocollo viene illustrato come valutare la vitalità cellulare, ma anche possono essere studiate più a lungo termine modifiche ai tipi di cella singola. Andando avanti, ci proponiamo di valutare gli effetti differenziali che complesse onde d'urto può suscitare in diversi tipi cellulari, con l'obiettivo di favorire la nostra comprensione delle lesioni primarie blast-indotta.

Con la recente tendenza verso l'uso di dispositivi esplosivi improvvisati in modern warfare e azioni terroristiche contro i civili, comprensione degli effetti di eventi esplosivi sul corpo umano è di grande importanza. Lesioni ottenute attraverso l'esposizione a eventi di esplosione possono essere mortale e letale, con i processi fisici della ferita è diviso in quattro categorie. Risultato di lesioni primarie dall'esposizione diretta all'onda d'urto, che interagisce localmente con il corpo in un modo alla compressione e successivamente espansivo, provocando la rottura delle membrane e dei tessuti molli1. Lesioni secondarie includono il trauma smussato o penetrative ferite causate dall'impatto con oggetti di bassa massa azionati ad alta velocità dall'onda d'urto. Terziarie lesioni si verificano quando l'onda d'urto ha energia sufficiente per lanciare oggetti di massa elevata o individui contro oggetti. Infine, lesioni da esplosione quaternario sono definite da altre lesioni varie che non rientrano nelle altre categorie, quali burns flash2. A seguito dell'esposizione ad eventi di scoppio, lesioni primarie includono cerebrali traumatiche lesioni3,4,5, ossificazione heterotopic6,7, esplosione del polmone lesioni8, perdita dell'udito 9e gli altri10.
Una forma d'onda comunemente osservata da eventi di scoppio è l'onda di Friedlander, che rappresenta un campo libero, al contrario di uno spazio racchiuso, esplosione. La forma d'onda è costituito da un fronte di scoppio che può essere definito come un forte e rapido aumento della pressione positiva. Questo è immediatamente seguito da un vento di scoppio di aria in movimento ad alta velocità e un'onda di rilascio che riduce la pressione di sotto livelli atmosferici. Un vuoto parziale è lasciato alla regione dell'esplosione iniziale, che provoca il lento ritorno dell'aria. Le fasi positive e negative dell'onda (Figura 1A) causare il movimento di opposizione del blast wave1. Per contribuire a delucidare i meccanismi dietro lesioni da esplosione primaria, modelli sperimentali sono stati creati per produrre forme d'onda, come l'onda di Friedlander, che cellule e tessuti si troveranno ad affrontare quando esposti all'evento vera esplosione. Gli attuali sistemi elencati nella letteratura includono scossa tubi11,12,13,14,15,16,17, barochambers18,19, la Kolsky bar20, blast avanzati simulatori21, Split Hopkinson pressione bar22e la ricreazione di eventi alternativi esplosione in un ambiente controllato utilizzando Tetranitrato di pentaeritrite23. Nonostante la vasta gamma di modelli disponibili, molte variabili influenzano la ferita ottenuta da onde di esplosione, tra cui lo pre-stress applicato e le proprietà meccaniche del, tipi di singole cellule o tessuti sotto valutazione24. Mentre lo studio di tessuti o organi può gettare luce su deformazione del tessuto ed i cambiamenti morfologici lordi subiti a seguito di eventi di scoppio, analisi al livello cellulare può rivelare i cambiamenti epigenetici e post-trascrizionali, influenzato dall'onda d'urto.
In questo articolo di metodi descrive una tecnica per propagare le onde d'urto in una gamma di pressioni sopra in un monostrato di cellule vive. Questo permette l'immediata caratterizzazione di attuabilità delle cellule, delucidando soglie di danno potenziale da onde d'urto. Inoltre, cellule vitali possono essere restituite a condizioni di coltura standard, e gli effetti biologici a lungo termine dell'evento di esplosione possono essere valutati. Il protocollo qui di seguito vengono descritte due tecniche di attuabilità delle cellule che possono essere utilizzati su cellule in coltura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig1.jpg"> 
Figura 1: Approssimazione di onda Friedlander. (A) un'approssimazione di un'onda di Friedlander osservata al sensore 3 sul tubo di scossa. (B) dati rappresentativi che mostra i profili di pressione differenti osservati a sensori 1, 2 e 3 del tubo di scossa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1124">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td>MEM &#945;, nucleosides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>22571020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, US origin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>Supplement to create complete growth media.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15400-054</td>
			<td>Dilute 1 in 10 before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>CytoOne T-75 Flask, TC-Treated, vented</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7682-4875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>TC Dish (PS) 35mm, 8.5 cm2</td>
			<td>Triple Red</td>
			<td>TCD010035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Petri dish (PS) 90x14.2mm no vent</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>391-0453&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Gas Permeable Adhesive Plate Seals</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AB-0718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>R37601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Alamarblue cell viability reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13494309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Virkon tablets</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>115-0020</td>
			<td>Use to create 2% solution as viability control reagent.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>SurgicalTools</td>
			<td>11295-10</td>
			<td>Use to remove coverslips from petri dish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Cover glass, square</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Microscope slides</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>631-1553</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, solid black</td>
			<td>AppletonWoods</td>
			<td>CC760</td>
			<td>Plate to be used for fluorescence measurements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>96 Well plate, clear, (PS)</td>
			<td>VWR UK</td>
			<td>734-1799</td>
			<td>Plate to be used for absorbance measurments.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Leica DMi1 Camera stand outfit</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>Optical microscope used for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture Microdisseciton</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microsope used for LIVE/DEAD imaging.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>EnVision Multilabel Reader</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>2104-0010A</td>
			<td>Plate reader to be used for fluorescence/absorbance readings.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.023mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0782</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.05mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0786</td>
			<td>Use to creatw shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td>Mylar Electrical &#38; Chemical Insulating Film, 304mm x 200mm x 0.125mm&#160;</td>
			<td>RS Components</td>
			<td>785-0798</td>
			<td>Use to create shock tube diaphragm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Current source power unit</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>4103C</td>
			<td>Power source for 2300V1 sensor.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>IEPE Pressure Sensor</td>
			<td>Dytran Intruments Inc.</td>
			<td>2300V1</td>
			<td>Pressure sensor located on shock tube.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td>Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO 4104B</td>
			<td>Use to gather and save sensor 2300V1 data.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating primary blast effects in vitro

Esposizione a eventi di esplosione può causare gravi traumi agli organi vitali quali i polmoni, le orecchie e nel cervello. La comprensione dei meccanismi dietro tali lesioni di scoppio-indotta è di grande importanza considerando la recente tendenza verso l'uso di esplosivi in modern warfare e incidenti correlati terrorista. Per comprendere appieno la lesione indotta da scoppio, dobbiamo prima essere in grado di replicare tali eventi esplosione in un ambiente controllato utilizzando un metodo riproducibile. In questa tecnica utilizzando attrezzature tubo shock, onde d'urto in una gamma di pressioni può essere propagate su cellule vive coltivate in 2D, e marcatori di attuabilità delle cellule possono essere analizzati immediatamente utilizzando un dosaggio di indicatore redox e l'imaging fluorescente di cellule vivi e morte. Questo metodo ha dimostrato che aumentando la sovrappressione di scoppio di picco a 127 kPa può stimolare un calo significativo nell'attuabilità delle cellule rispetto ai comandi non trattati. Campioni di prova non sono limitati a cellule aderenti, ma possono includere sospensioni cellulari, corpo intero e campioni di tessuto, attraverso piccole modifiche per l'installazione del tubo di scossa. Replicare le esatte condizioni che tessuti e cellule verificano quando esposti ad un evento di vera esplosione è difficile. Tecniche come quello presentato in questo articolo possono aiutare a definire le soglie di danno e identificare i cambiamenti epigenetici e post-trascrizionali all'interno delle cellule che derivano dall'esposizione a onde d'urto.

Utilizzando il metodo sopra descritto, cresciute in un monostrato di cellule sono state esposte in triplice copia a onde d'urto generate utilizzando un tubo d'urto (Figura 2B). Marcatori di attuabilità delle cellule sono stati valutati. Usando un'analisi di indicatore redox, è stato trovato che l'applicazione di un'onda d'urto di 127 kPa era in grado di ridurre significativamente l'attuabilità delle cellule di papilla dermica rispetto ai controlli dopo 24 h nella cultura (Figura 3). L'applicazione di un onda d'urto ≤72 kPa non ha ridotto la redditività. Per supportare queste osservazioni, un'analisi di immagine fluorescente capace di fluorescente etichettatura vivi o morte cellule con fluorofori verde o rosso, rispettivamente, è stata usata. La quantificazione delle cellule vivi e morte da 13 immagini fluorescenti per replica biologico hanno dimostrato una riduzione nell'attuabilità delle cellule in quelle esposte per l'onda d'urto 127 kPa rispetto al controllo (Figura 4). L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di confronto più di Tukey, con p &#60; 0.05 considerato statisticamente significativo. La dimensione del campione per ogni gruppo è pari a 9 per il dosaggio di indicatore redox e 39 per l'analisi di formazione immagine di fluorescenza quantitativa.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig3.jpg"> 
Figura 3 : Redox indicatore analisi dati risultati corso di tempo della vitalità cellulare dopo l'esposizione Ondashock. Significativamente meno cellule sono state osservate dopo 24 h del gruppo di onda d'urto-esposti 127-kPa rispetto al controllo non trattato. Il controllo negativo che consisteva in un trattamento di 30-s con 2% disinfettante (Vedi la tabella materiali) hanno mostrato significativamente meno cellule sia T0 e 24h rispetto a tutti gli altri gruppi. Ogni barra rappresenta la deviazione standard media ± 1 (SD); replicati biologici, N = 3; tecnico viene replicato, n = 3. = p &#60; 0,0001. * = p &#60; 0.05. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55618/55618fig4.jpg"> 
Figura 4 : Fluorescenza. (A) dati quantitativi raccolti dalle immagini fluorescenti delle cellule vivi e morte, acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza all'esposizione di onda post-d'urto 24 h. Significativamente meno cellule vitali sono state osservate nel 127 kPa (dire = 93.42) campione di onda d'urto-esposti rispetto ai 47 kPa (significa = 98.18), 72 kPa (significa = 98.87) e gruppi di controllo (significa = 99,10). Nessun cellule vitali sono state osservate nel gruppo di controllo negativo dopo 24 h (media = 0). Immagini di fluorescenza rappresentativo di (B). Verde Mostra cellule vive, mentre il rosso indica le cellule morte. Ogni box-plot Mostra i quartili superiori ed inferiori con whiskers di Tukey; replicati biologici, N = 3; tecnico viene replicato, n = 13. = p &#60; 0,0001. Barra della scala = 300 µm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55618/55618fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

Comprendere come le cellule sono modulate dall'esposizione a onde d'urto può aiutare a identificare i meccanismi dietro lesioni attivate da eventi di esplosione. Questo protocollo utilizza attrezzature di tubo su misura shock di applicare onde d'urto in una gamma di pressioni di monostrati di cellule umane e di identificare i conseguenti effetti sulla vitalità cellulare.

Valutazione primaria Blast effetti In Vitro

Exposure to blast events can cause severe trauma to vital organs such as the lungs, ears, and brain. Understanding the mechanisms behind such ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Evaluating Primary Blast Effects In Vitro

7.9K Views.  Imperial College London. Comprendere come le cellule sono modulate dall'esposizione a onde d'urto può aiutare a identificare i meccanismi dietro lesioni attivate da eventi di esplosione. Questo protocollo utilizza attrezzature di tubo su misura shock di applicare onde d'urto in una gamma di pressioni di monostrati di cellule umane e di identificare i conseguenti effetti sulla vitalità cellulare.

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Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in vitro. Nutrients delivered by vasculature fail to reach all parts of tumors, giving rise to heterogeneous microenvironments consisting of viable, quiescent and necrotic cell types. Many cancer drugs fail to effectively penetrate and treat all types of cells because of this heterogeneity. Monolayers of cancer cells do not mimic this heterogeneity, making it difficult to test cancer drugs with a suitable in vitro model. Our microfluidic devices were fabricated out of PDMS using soft lithography. Multicellular tumor spheroids, formed by the hanging drop method, were inserted and constrained into rectangular chambers on the device and maintained with continuous medium perfusion on one side. The rectangular shape of chambers on the device created linear gradients within tissue. Fluorescent stains were used to quantify the variability in apoptosis within tissue. Tumors on the device were treated with the fluorescent chemotherapeutic drug doxorubicin, time-lapse microscopy was used to monitor its diffusion into tissue, and the effective diffusion coefficient was estimated. The hanging drop method allowed quick formation of uniform spheroids from several cancer cell lines. The device enabled growth of spheroids for up to 3 days. Cells in proximity of flowing medium were minimally apoptotic and those far from the channel were more apoptotic, thereby accurately mimicking regions in tumors adjacent to blood vessels. The estimated value of the doxorubicin diffusion coefficient agreed with a previously reported value in human breast cancer. Because the penetration and retention of drugs in solid tumors affects their efficacy, we believe that this device is an important tool in understanding the behavior of drugs, and developing new cancer therapeutics.

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We present the procedure for fabrication and operation of a microfluidic device that recreates heterogeneous tumor microenvironments in vitro. The variability in apoptosis within tumor tissue was quantified using fluorescent stains and the effective diffusion coefficient of the chemotherapeutic drug doxorubicin into tumor tissue was evaluated.

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Ricerca

Bioingegneria

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Basso Peso Molecolare proteina di arricchimento sul film sottili di silice mesoporosi per la scoperta di biomarcatori

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradable nanoparticles have emerged as a versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines against respiratory infectious diseases. Specifically, polyanhydride nanoparticles composed of the aliphatic sebacic acid (SA), the aromatic 1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPH), or the amphiphilic 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane (CPTEG) display unique bulk and surface erosion kinetics1,2 and can be exploited to slowly release functional biomolecules (e.g., protein antigens, immunoglobulins, etc.) in vivo3,4,5. These nanoparticles also possess intrinsic adjuvant activity, making them an excellent choice for a vaccine delivery platform6,7,8.
	In order to elucidate the mechanisms governing the activation of innate immunity following intranasal mucosal vaccination, one must evaluate the molecular and cellular responses of the antigen presenting cells (APCs) responsible for initiating immune responses. Dendritic cells are the principal APCs found in conducting airways, while alveolar macrophages (AM&#632;) predominate in the lung parenchyma9,10,11. AM&#632; are highly efficient in clearing the lungs of microbial pathogens and cell debris12,13. In addition, this cell type plays a valuable role in the transport of microbial antigens to the draining lymph nodes, which is an important first step in the initiation of an adaptive immune response9. AM&#632; also express elevated levels of innate pattern recognition and scavenger receptors, secrete pro-inflammatory mediators, and prime na&iuml;ve T cells12,14. A relatively pure population of AM&#632; (e.g., greater than 80%) can easily be obtained via lung lavage for study in the laboratory. Resident AM&#632; harvested from immune competent animals provide a representative phenotype of the macrophages that will encounter the particle-based vaccine in vivo. Herein, we describe the protocols used to harvest and culture AM&#632; from mice and examine the activation phenotype of the macrophages following treatment with polyanhydride nanoparticles in vitro.

Herein, we describe protocols for harvesting murine alveolar macrophages, which are resident innate immune cells in the lung, and examining their activation in response to co-culture with polyanhydride nanoparticles.

Raccolta murini macrofagi alveolari e Valutare l&#39;attivazione cellulare indotta da nanoparticelle polianidride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Oculare Test (EIT) per identificazione del pericolo di sostanze chimiche irritanti oculari utilizzando Ricostruito umana Cornea come epiteliale (RHCE) Tessuto Modello

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from traumatic injury, disease and various congenital, genetic and acquired conditions are quite common. Tissue engineering and regenerative medicine technologies have enormous potential to provide a therapeutic solution. However, utilization of biologically relevant animal models in combination with longitudinal assessments of pertinent functional measures are critical to the development of improved regenerative therapeutics for treatment of VML-like injuries. In that regard, a commercial muscle lever system can be used to measure length, tension, force and velocity parameters in skeletal muscle. We used this system, in conjunction with a high power, bi-phase stimulator, to measure in vivo force production in response to activation of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. We have previously used this equipment to assess the functional impact of VML injury on the tibialis anterior (TA) muscle, as well as the extent of functional recovery following treatment of the injured TA muscle with our tissue engineered muscle repair (TEMR) technology. For such studies, the left foot of an anaesthetized rat is securely anchored to a footplate linked to a servomotor, and the common peroneal nerve is stimulated by two percutaneous needle electrodes to elicit muscle contraction and dorsiflexion of the foot. The peroneal nerve stimulation-induced muscle contraction is measured over a range of stimulation frequencies (1-200 Hz), to ensure an eventual plateau in force production that allows for an accurate determination of peak tetanic force. In addition to evaluation of the extent of VML injury as well as the degree of functional recovery following treatment, this methodology can be easily applied to study diverse aspects of muscle physiology and pathophysiology. Such an approach should assist with the more rational development of improved therapeutics for muscle repair and regeneration.

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

applicazioni di<em&gt; In Vivo</em&gt; Test funzionale del Topo tibiale anteriore per la valutazione di ingegneria tessutale muscolo scheletrico di riparazione

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modello del disco intervertebrale Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths from the myocardium. Genetic program defects in the Notch signaling cascade are involved in ventricular defects such as Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy or Hypoplastic Left Heart Syndrome. Using this protocol, it can be determined that shear stress driven trabeculation and Notch signaling are related to one another. Using Light-sheet Fluorescence Microscopy, visualization of the developing zebrafish heart was possible. In this manuscript, it was assessed whether hemodynamic forces modulate the initiation of trabeculation via Notch signaling and thus, influence contractile function occurs. For qualitative and quantitative shear stress analysis, 4-D (3-D+time) images were acquired during zebrafish cardiac morphogenesis, and integrated light-sheet fluorescence microscopy with 4-D synchronization captured the ventricular motion. Blood viscosity was reduced via gata1a-morpholino oligonucleotides (MO) micro-injection to decrease shear stress, thereby, down-regulating Notch signaling and attenuating trabeculation. Co-injection of Nrg1 mRNA with gata1a MO rescued Notch-related genes to restore trabeculation. To confirm shear stress driven Notch signaling influences trabeculation, cardiomyocyte contraction was further arrested via tnnt2a-MO to reduce hemodynamic forces, thereby, down-regulating Notch target genes to develop a non-trabeculated myocardium. Finally, corroboration of the expression patterns of shear stress-responsive Notch genes was conducted by subjecting endothelial cells to pulsatile flow. Thus, the 4-D light-sheet microscopy uncovered hemodynamic forces underlying Notch signaling and trabeculation with clinical relevance to non-compaction cardiomyopathy.

Here, we present a protocol to visualize developing hearts in zebrafish in 4-Dimensions (4-D). 4-D imaging, via light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), takes 3-Dimensional (3-D) images over time, to reconstruct developing hearts. We show qualitatively and quantitatively that shear stress activates endocardial Notch signaling during chamber development, which promotes cardiac trabeculation.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio di catturare immagini 4-dimensionale degli effetti di modulazione dello sforzo di taglio sul cuore Zebrafish in via di sviluppo

The hemodynamic forces experienced by the heart influence cardiac development, especially trabeculation, which forms a network of branching outgrowths ...