פרוטוקול זה הוא משמעותי, כמו PIVEC מאפשר חשיפה ישירה של תרבות התא כדי אירוסולים בעולם האמיתי. ניתן להזהיר את המערכת לדגום את אותו אוויר שאדם נושם, מה שמאפשר סוג חדש של ניטור איכות אוויר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הקלות של לכידת אירוסולים על תאי ריאות מתורבתים במקומות שאינם נגישים למערכות ספסל העליון, כגון במקור הכניסה או בתוך אזור הנשימה.
הדגימו את ההליך יהיו ד"ר לין סונו, בוגרת המעבדה שלי לאחרונה, ונתנאל ויגאל, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלי. לניסוי זה, חומרי בדיקה מאוחסנים וסביבה מבוקרת במשך 24 שעות לפני הבדיקה. כדי להרכיב את מערכת הפיזור היבשה, לחבר את שסתום הכדור לקצה אחד של צינור אורך ארבעה אינץ ', 1/8 גודל מושחל.
זה משמש כהופר החלקיק. דרך הקצה הפתוח של הופר החלקיקים, לשים את הכמות הרצויה של חלקיקי נחושת. ואז לסגור את הופר החלקיק עם שסתום כדור אחר.
חבר את צינור שני אינץ' ארוך, 1/8 גודל לשסתום. מניחים צינורות בקוטר חיצוני באורך 3 אינץ', בקוטר 1/2 אינץ' סביב צינור שני אינץ'. הכנס מסנן HEPA בתוך צינורות קצרים, הבטחת כיוון הזרימה הוא דרך שסתום הכדור.
באמצעות השחלה, לחבר את מחולל ואקום לשסתום הכדור השני. לאחר מכן, חבר את גנרטור הוואקום למיכל האוויר. שים צינורות בקוטר חיצוני 1/4 אינץ ' מעל השקע של גנרטור ואקום כדי לחבר אותו ההתקנה הניסיונית.
הפעל את שסתום הראשי שסתומי וסת על מיכל האוויר כדי להגדיר את הזרימה הרצויה. פתח את שסתום הכדור, הקרוב ביותר למסנן HEPA ולאחר מכן פתח את שסתום הכדור הקרוב ביותר לגנרטור ואקום. השאר אותם פתוחים במהלך האפיון או החשיפה לפני סגירתם.
ראשית שסתום הכדור הקרוב ביותר לגנרטור ואקום, ולאחר מכן שסתום הכדור הקרוב ביותר למסנן HEPA. סגור שסתומים ראשיים וסת על מיכל אוויר כדי לעצור את הזרימה. כדי לנקות, השתמש 70% אתנול לשטוף שסתומי כדור גנרטור ואקום.
שים צינורות מתכת במקלבה אוטומטית לסטריליזציה. לאחר culturing תאים בממשק נוזלי אוויר, לאפשר לתאים לצייד במשך 24 שעות. כדי להרכיב, קח את בסיס PIVEC עם הבאר הפונה כלפי מעלה וחבר את מתאם הכנסת תרבות התאים בחלק העליון.
הוסף ארבעה מיליליטר של מדיה לתרבות התאים ל הבאר של הבסיס של PIVEC באמצעות micropipette. השתמש פינצטה כדי למקם את תרבות התא להוסיף בתוך המתאם. כאשר החלק הצר של החלק העליון של PIVEC פונה כלפי מעלה, התחבר למתאם.
בזהירות, לעטוף PIVEC עם שכבה אחת של סרט דביק. דחוף כדי לחבר חתיכות קלטת 37 מילימטר על החלק העליון והתחתון של PIVEC. מניחים 1/4 מתאמים דוקרניים אינץ' לתוך מגירה ושקע.
לעטוף תנור התנגדות סביב PIVEC עם החוטים בבסיס. קלטת לאבטח. לעטוף PIVEC עם שמונה סיבובים של רדיד אלומיניום לבידוד, ומאובטח עם סרט הדבקה.
חבר צינורות בקוטר חיצוני בגודל 1/2 אינץ' למתאם בחלק העליון של PIVEC. מוציאים צינורות נקבוביים ממים סטריליים וממקמים בתוך צינורות על גבי PIVEC. העבר את המערכת למכסה המנוע של האדים והדק את ה- PIVEC על מעמד הטבעת ומאובטח.
חבר PIVEC למערכת תרסיס על ידי חיבור צינורות בקוטר 1/4 אינץ 'בשקע של גנרטור תרסיס אל צינורות נקבובי. חבר את היציאה של PIVEC צינורות בקוטר 1/4 אינץ' המחובר למסנן HEPA ומשאבת ואקום על ידי מחבר Y. הפעל את השסתומים והגדר את קצב זרימת המשאבה ל 0.5 ליטר לדקה.
חשוף את התאים לננו-חלקיקי נחושת במשך עשר דקות לפני סגירת השסתומים וכיבוי המשאבה. הסר PIVEC ממערכת תרסיס. מוציאים את תרבות התאים מוסיפים באמצעות פינצטה ומכניסים אותה לצלחת הבאר הסטרילית כדי להתחיל את ההתמדה הביולוגית הרצויה.
נקודות זמן חשיפה מוצעות, להחזיר את המוסף לאנקובטור פחמן דו חמצני. שאף מדיה מ- PIVEC באמצעות טפטפת. השתמש 70% אתנול לשטוף PIVEC ולעקר אותו עם אור אולטרה סגול לפחות 30 דקות לפני הניסוי הבא.
PIVEC התאפיין בשלושה גדלים של חלקיקי נחושת כדי לקבוע יעילות תצהיר. תצהיר מוגבר נצפתה בסך הכל עבור 24 עיצוב היטב, אז שישה עיצוב היטב. זה פוחת מעט עבור 100 ננומטר בהשוואה 40 ננומטר ו 800 חלקיקי נחושת ננומטר.
ריכוז מספר חלקיקים של אירוסולים ננו-חלקיקי נחושת נקבע על ידי מסננת מבוססי סריקה של מייזר חלקיקי ניידות, כמו גם מדידות sizer חלקיקים אופטיים. ניתוח שלאחר החשיפה יכול להיות מזורז על ידי קביעת יחסי המינון בין מסנן 37 מילימטר לבין לתוספת תרבות התא. ההשוואה מראה מתאם חזק עבור חלקיקי נחושת 800 ננומטר עם ערך p פחות מ 0.05.
בהשוואה לתזרים בניצב במערכות חשיפה במבחנה לאורך הספרות, יעילות התצהיר של PIVEC על פני טווח גדלי החלקיקים שנבדקו דומה לערכים המדווחים או גדלה. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא שלמרות שפרוטוקול זה מדגים את השימוש ב- PIVEC בסביבה מעבדתית, הוא נועד למדוד תגובות תאיות לתרסיסים באתר החשיפה. בעת ביצוע בדיקות באתר, חשוב לאפיין את יעילות התצהיר של תרסיס הבדיקה.
יעילות התצהיר קובעת את המינון המופקד של חלקיקים שאליהם נחשפים התאים. ניתן לבצע בדיקות ביולוגיות נוספות כדי לחקור נקודות קצה נוספות של תגובה תאית עקב חשיפה. PIVEC שימש כדי להעריך את התגובה התאית עקב אירוסולים שנוצרו במהלך תהליכי הדפסה בתלת-ממד, כגון סילון קלסר מתכת, ייצור סיבי מותך.
שימוש בננו-חלקיקים, במיוחד בצורת תרסיס, יכול להיות מסוכן וכל חשיפה צריכה להתבצע במכסה המנוע של האדים. עבודה סלולרית צריכה להיעשות בארון בטיחות ביולוגית.
