Os autores reconhecem o apoio a este trabalho através das subvenções U54 RR022220 e P50 GM076547 à JDA dos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA. FDM é um colega pós-doutorado dos Institutos canadenses de pesquisa em saúde. Também agradecemos o apoio do Centro Luxemburgo para Sistemas de Biomedicina e da Universidade do Luxemburgo.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O teste ODELAY tem vários pontos críticos para garantir medições fenotípicas reprodutíveis e confiáveis. O primeiro ponto crítico é a preparação consistente das culturas de fermento. Deve-se ter cuidado para colher as células de levedura do crescimento logarítmico. Se as culturas estiverem saturadas, então a sua heterogeneidade populacional aumentará, o que pode ofuscar a heterogeneidade causada por fatores genéticos ou ambientais ( por exemplo, fontes de carbono) 11 . O segundo ponto crítico é a preparação consistente da mídia. Em geral, um grande volume de solução de mídia de estoque 10X deve ser gerado e, em seguida, usado ao longo do tempo para minimizar os efeitos do lote. Formular meios de comunicação, em peso, sempre que possível, ajuda a melhorar a consistência do meio ao longo do tempo, assegurando a densidade de ágar e o teor global de água da agarose podem ser monitorados de perto. O terceiro ponto crítico envolve minimizar ou eliminar qualquer deformação mecânica da agarose meDia. A deformação mecânica da mídia geralmente ocorrerá durante a separação da agarose das lâminas de vidro. Tal como acontece com muitas técnicas de laboratório, a prática é necessária para dominar esta etapa. A variação no tempo de atraso, conforme ilustrado na Figura 4 , está frequentemente relacionada a um dos três fatores: deformação mecânica do meio de agarose, variação na espessura de ágar moldada ou fonte de luz instável. Se o meio de agarose variar em altura Z em toda a matriz manchada, a variação de altura pode sobrecarregar o alcance da rotina de focagem automática, fazendo com que as imagens iniciais estejam ligeiramente fora de foco. Por esse motivo, verifique a altura do foco em vários pontos no centro e ao longo das bordas da matriz manchada para garantir que a rotina de focagem automática tenha alcance Z suficiente para encontrar o foco. Se necessário, use o painel Autofocus para aumentar o alcance de foco e aumentar o número de etapas de focagem. Uma terceira condição possívelO íon que pode levar a um foco fraco é uma fonte de luz instável ou cintilante, que pode interromper a pontuação de foco calculada para uma altura Z específica. As lâmpadas de halogéneo de tungstênio tendem a cintilar bem antes que as lâmpadas se queimem. O efeito do foco fraco é observado em um exemplo em que as curvas de crescimento mergulham entre o primeiro e o segundo tempo ( Figura 5 A ), enquanto o ponto adjacente não tem o mesmo mergulho ( Figura 5 B ). Neste caso, a má condição de foco foi atenuada pela substituição da fonte de luz de halogênio de tungstênio. Na prática, os autores descobriram que, para reduzir a cintilação de 100W de lâmpadas halógenas de tungstênio, as lâmpadas precisam ser substituídas a cada 500 h ou aproximadamente a cada 2 meses quando os microscópios estão em uso intenso. Para evitar problemas de focagem fracos de uma lâmpada cintilante, substitua a fonte de luz halógena de tungstênio frequentemente ou substitua a lâmpada halógena por uma fonte de luz de diodo. AO exemplo de um conjunto de dados que mostra pouca variação nos tempos de duplicação bem como tempos de atraso mais uniformes é mostrado na Figura 6 . Este conjunto de dados foi tomado com um iluminador de diodo que fornece uma iluminação mais estável ao longo do tempo enquanto executa o autofoco. Embora muitos dos pontos mencionados aqui para otimizar a preparação da mídia possam parecer óbvios, na literatura as telas de maior escala não se replicam bem umas com as outras 8 , 11 . Portanto, descrevemos cuidadosamente a preparação de culturas e meios de agarose para que possam ser geradas telas fenotípicas mais reprodutíveis. O ensaio ODELAY está atualmente limitado em termos de produção quando comparado aos ensaios baseados em fixação, tais como matrizes genéticas sintéticas ou o ensaio Scan-O-Matic. Embora esses métodos aumentem o número de cepas que são medidas, eles não possuem capacidade para resolver células individuais.Nd, portanto, não pode medir a heterogeneidade da população que observamos dentro das cepas de fermento clonal. A origem dessa heterogeneidade populacional não é atualmente compreendida, mas a fusão de tecnologia e computação, como demonstrado aqui, oferece uma oportunidade para abordar objetivamente os mecanismos celulares subjacentes 12 . Os autores desejam notar que o ODELAY atualmente é otimizado apenas para uma marca específica de microscópio e tipo de corpo. Modificar o ODELAY para outros sistemas de microscópio é direto, mas exigirá conhecimento da API 13 de código aberto. No entanto, tanto a API como os scripts ODELAY são escritos para serem facilmente adaptados a diferentes sistemas e ensaios experimentais. Embora o ODELAY tenha sido originalmente desenvolvido para fermento, conseguimos utilizá-lo sem modificações para observar o crescimento de Mycobacterium smegmatis . A observação dos outros microrganismos formadores de colônias éPossível com alterações no código fonte fornecido 11 . Em geral, a ODELAY é uma ferramenta poderosa e flexível para comparar microorganismos cultivados sob diferentes condições ambientais e perturbações genéticas.

Os fenótipos de crescimento de microorganismos são um forte indicador de sua aptidão genética subjacente a uma determinada condição ambiental. O crescimento é classicamente segregado em 3 regimes de crescimento diferentes: fase retardada, fase logarítmica e crescimento da fase estacionária 1 . Cada fase de crescimento pode revelar diferentes aspectos da aptidão que dependem de várias condições ambientais e genéticas. Por exemplo, o tempo de atraso ou o período de tempo que um organismo gasta em fase de atraso antes do início do crescimento exponencial, pode ser indicativo da capacidade de um organismo responder a condições ambientais alteradas 2 . O tempo de duplicação durante o crescimento da fase logarítmica, a métrica mais comum da aptidão celular, revela a eficiência geral da capacidade de divisão de um organismo ao metabolizar e utilizar materiais ambientais para replicação. A fase estacionária, onde o crescimento após a fase logarítmica é rapidamente reduzida, é outro indicador de aptidão, que é regularUsado como um ponto final de crescimento em testes de crescimento de leveduras baseados em manchas. Vários ensaios de crescimento de levedura estão atualmente disponíveis e considerados métodos padrão para avaliação de fenótipos de crescimento em leveduras 3 , 4 , 5 . Estes ensaios baseiam-se principalmente em métodos de crescimento de fermento quer em meios sólidos quer em meios líquidos. Em meios sólidos, os ensaios de fixação de colônia transferem um pequeno número de células em agar sólido com um pino e as células de fermento podem crescer por um período de tempo definido. As colônias são então formadas e os seus tamanhos são comparados em um terminal terminal 6 . Esses ensaios de fixação de colônias provaram ser robustos e escaláveis ​​para gerar telas genômicas. Mais recentemente, imagens periódicas usando escaneadores de cama plana e câmeras de reflexão de lente única (SLR) foram incorporadas nestes ensaios para registrar o crescimento de colônias ao longo do tempo 7 , 8, 9 . No entanto, a resolução desses dispositivos os impede de detectar células únicas e, portanto, esses ensaios de fixação de colônia não observam diretamente o tempo de latência e não podem observar variações entre as células individuais que crescem em colônias. Os ensaios de crescimento baseados em líquidos também foram utilizados para realizar telas 3 do genoma. O acoplamento de um teste de crescimento líquido com microscopia em lapso de tempo revelou heterogeneidade populacional no tempo de duplicação de células individuais geneticamente idênticas, o que oferece uma perspectiva importante para a compreensão da regulação genética e da adaptação ambiental. No entanto, este ensaio não mede outros aspectos do crescimento, como tempo de atraso e capacidade de carga 10 . Aqui, apresentamos um método para caracterizar as três fases de crescimento de microorganismos formadores de colônias em meio sólido utilizando um ensaio que denominamos ODELAY 11 . ODELAY é composto por utiliMicroscópio de lapso de tempo de alto rendimento zing para registrar imagens de células únicas que crescem em colônias em mídia sólida. Esta população de células individuais que crescem em colônias revela a heterogeneidade da população subjacente, que não é detectada por outras medidas menos sensíveis, como a pontuação terminal final. Nós demonstramos o método em levedura, mas ODELAY pode ser aplicado a qualquer organismo que mostre contraste em microscopia de campo brilhante.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agarose UltraPure</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td style="width:413px;">Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract Peptone (YEP)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete Suplement Mixture (CSM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP114560222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td>
			<td style="width:131px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4741</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4742</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430291</td>
			<td>1 case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate flat bottom</td>
			<td style="width:131px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hydra liquid handleing robot</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">1096-DT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">5527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Synergy H4 Plate Reader</td>
			<td style="width:131px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">H4MLFAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica DMI6000 B Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica 10X/0.3NA objective</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">11506289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td>
			<td style="width:131px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MATLAB with image processing tool box</td>
			<td style="width:131px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MicroManager</td>
			<td style="width:131px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Microscope Chamber</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Agar Molds</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

Os fenótipos de crescimento de microorganismos são um forte indicador de sua condição genética subjacente e podem ser segregados em 3 regimes de crescimento: fase de desfase, fase logarítmica e fase estacionária. Cada fase de crescimento pode revelar diferentes aspectos da aptidão que estão relacionados a várias condições ambientais e genéticas. Medições de alta resolução e quantitativas de todas as 3 fases de crescimento geralmente são difíceis de obter. Aqui, apresentamos um método detalhado para caracterizar todas as 3 fases de crescimento em meios sólidos usando um ensaio chamado Avaliação de Duplicação de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifica fenótipos de crescimento de células individuais crescendo em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo. Este método pode observar diretamente a heterogeneidade da população com cada parâmetro de crescimento em células geneticamente idênticas que crescem em colônias. Essa heterogeneidade de população oferece uma perspectiva única para a compreensão da regulação genética e epigenética e respostas aPerturbações genéticas e ambientais. Embora o método ODELAY seja demonstrado com levedura, ele pode ser utilizado em qualquer microrganismo formador de colônias que seja visível por microscopia de campo brilhante.

<html> As imagens de exemplo de crescimento de fermento em microscopia de lapso de tempo são mostradas na Figura 3B . Após o processamento das imagens de lapso de tempo, um conjunto de dados representativo que compara as tensões de levedura BY4741 e BY4742 é mostrado na Figura 4 . Neste conjunto de dados de exemplo, há muito pouca variação no tempo de duplicação entre diferentes posições na placa. Se o meio de agarose for bem preparado, então um desvio óbvio em tempo de duplicação e tempo de atraso seria aparente nas posições de mancha que coincidem com a região deformada do gel de agarose. Enquanto os tempos de duplicação parecem ser relativamente uniformes, este exemplo mostra variações nas medidas do tempo de atraso. Um conjunto de dados mais consistente é mostrado na Figura 6 . Neste conjunto de dados, o tempo de atraso e o tempo de duplicação são uniformes. Arquivos / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Montagem do molde Agar. Os componentes do molde de ágar são mostrados em ( A ). Monte a base como mostrado em ( B ) e, em seguida, prenda a base com pequenos grampos de pasta. Coloque os pedaços verticais mais longos na cavidade da base ( C ) e acampe as lâminas para o molde conforme mostrado em ( D ). Uma vista lateral mostrando o ângulo do molde e a orientação do molde kerf necessário para a separação consistente do ágar da lâmina de vidro ( E ). Observe a posição do polegar e dos dedos da frente, bem como a linha reta do ágar que se separa do slide ( F ) e observe a seta horizontal. A linha de separação deve se mover uniformemente na direção das setas verticais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Método de Sonicação e Spotting. Sonicate a placa na água gelada e use um suporte de balde centrífugo para ajudar a suportar a placa ( A ). Coloque as placas dos passos 3.8.1 para a mancha na placa de agarose ( B ). Além disso, organize as dicas para que a caixa de ponta mais à esquerda tenha uma dica na posição C10 e, em seguida, outras quatro pontas com as extremidades cortadas para que não colam o suporte da placa ( C ). Coloque as dicas restantes em quatro caixas para que as posições internas de 24 pontas estejam ocupadas ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interface gráfica de usuário ODELAY. Uma captura de tela da Interface Gráfica do Usuário para &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Esta interface permite o monitoramento da câmera e para ajustar as configurações de iluminação do microscópio para modos de campo epifluorescente e brilhante. As setas vermelhas apontam para os botões Foco e Transmissão que ativam a câmera para adquirir imagens rapidamente e abre o obturador leve transmitido, respectivamente. As setas azuis são usadas para mover o palco para a origem e depois definir a origem com o botão &quot;Go Origin&quot; e o botão &quot;Set&quot;. As setas verdes apontam para &quot;Redefinir&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Botões que reiniciam os modos de imagem ODELAY nas condições atuais e iniciam a coleta de imagens ODELAY. Imagens de lapso de tempo de crescimento de fermento em meio sólido a 0, 3, 6 e 9 h após a mancha ( B ). Uma captura de tela da interface gráfica do usuário para &quot;ODELAY_IPT.m&quot; ou th<html> E ODELAY Ferramenta de processamento de imagem ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Exemplo de saída ODELAY. Este conjunto de dados compara as tensões BY4741 e BY4742 na mídia YPD. Esta figura é um exemplo de um slide de agarose bem preparado; No entanto, as configurações de focagem automática não são otimizadas. Os dados apresentados em cada coluna, da esquerda para a direita, são: a capacidade de carga no Log 2 da área da colônia; Tempo de duplicação, dado em min; E tempo de atraso, dado em min. Neste exemplo, o tempo de duplicação de todos os pontos na corrediça de ágar se alinha bem com uma pequena quantidade de tempo de duplicação aumentado em direção à coluna. No entanto, os tempos de atraso variam consideravelmente neste conjunto de dados._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Exemplos de curva de crescimento. Este exemplo demonstra como o foco inicial fraco pode causar o tempo de atraso estimado (t lag ) para aumentar ( A ), enquanto a posição adjacente mostra um tempo de latência menor ( B ). T d é o tempo de duplicação em min, e t lag é o tempo de atraso em min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Exemplo de experiência de teste bem executada. Um eXample da estirpe BY4742 testada depois de substituir uma lâmpada de halogéneo de tungstênio por um iluminador de diodo e garantir que o foco automático esteja configurado corretamente. Todos os tempos de duplicação parecem se sobrepor bem e os tempos de atraso parecem ser consistentes. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Apresentamos um método para quantificar fenótipos de crescimento de células de levedura individuais à medida que crescem em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo denominada, avaliação de dobramento de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). A heterogeneidade da população de células geneticamente idênticas que crescem em colônias pode ser observada e quantificada diretamente.

ODELAY: um método em larga escala para a quantificação multiparamétrica do crescimento de fermento

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K visualizações.  Institute for Systems Biology.  Apresentamos um método para quantificar fenótipos de crescimento de células de levedura individuais à medida que crescem em colônias em meios sólidos usando microscopia de lapso de tempo denominada, avaliação de dobramento de uma célula de Living Arrays of Yeast (ODELAY). A heterogeneidade da população de células geneticamente idênticas que crescem em colônias pode ser observada e quantificada diretamente. 

Vídeo: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Grande Escala Telas de Bibliotecas metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Biologia

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

A imunocoloração lote de Grande Escala da detecção de proteínas no cérebro do macaco inteiro

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistida por computador visualização de grande escala e Quantificação da Missa das ilhotas pancreáticas, distribuição de tamanho e Arquitetura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Levedura Método Embedding Colony

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

Ensaios de crescimento para avaliar a toxicidade poliglutamina em Levedura

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Parâmetro Multi-Medição da abertura dos poros transição de permeabilidade em mitocôndrias isoladas de coração Rato

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Ensaio para a grande escala Applications genotipagem

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...