עבודה זו נתמכה על ידי NIH גרנט 1R21AG031965-01A1. ח&quot;כ הוא רפואי אליסון קרן מלומד חדש הזדקנות.

חלק 1: הכנת תרבויות הזדקנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streak זנים של עניין ממניות קפוא על גבי צלחות אגר YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, אגר 2%, גלוקוז 2%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 30 ˚ C למשך 48 שעות או עד מושבות יחיד להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות יחיד לחסן לתוך 5 מ&quot;ל של מדיום נוזלי YEPD (1% תמצית שמרים, 2% bacto-peptone, גלוקוז 2%) במבחנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה ב 30 ˚ C תוך שמירה על תסיסה מתמדת שימוש או שייקר או תוף הרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מ&quot;ל של מדיום מלאכותי (SC) שלמה (טבלה 1) עם 50 μL של תרבות לילה. בדרך כלל שלוש תרבויות SC מוכנים להתאמץ כדי לספק כל שכפול בשלושה עותקים הביולוגי של ניתוח תוחלת החיים עבור כל זן נבדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרבויות ב 30 ˚ C עם תסיסה מתמדת על תוף מכבש לצורך הניסוי כולו (בדרך כלל 2 או יותר שבועות). </li></ol> חלק 2: לקיחת הכדאיות גיל נקודה לאחר יומיים של התרבות SC התקשורת, התאים צריכים להיות בשלב נייחים הראשונה בגיל נקודת מוכן לקחת. לאחר גיל נקודות צריך לקחת כל 2-3 ימים למשך תקופה מינימלית של שבועיים. עבור כל נקודה גיל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את Bioscreen 100-גם צלחות הכוורת עבור חיסון ידי מילוי כל טוב עם 145 μL של YEPD. הקפד להשאיר לפחות אחד מילא היטב עם YEPD בלבד ולא התאים לניתוח נתונים מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את התרבויות הזדקנות מן החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בקצרה את התרבות הראשון מחוסן לתוך הצלחת הכוורת, בעוד נזהרים שלא לשפוך את כל התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת 5 μL של התרבות מעורבת פיפטה אותו היטב הראשון של הצלחת הכוורת. הלהבה את קצה הצינור כל בדיקה לפני ואחרי הסרת aliquot 5 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה עבור כל תרבות הזדקנות להיות בטוח לציין את המיקום המתאים גם כל תרבות. עמדות גם זהים יש להשתמש עבור כל הבאים לגיל נקודה לאורך הניסוי כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את תרבויות לתוך 30 ˚ C החממה כאשר סיים עם חיסונים. </li></ol> חלק 3: טעינת המכשיר Bioscreen C-MBR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את תא חממה על ידי הרמת המכסה והסר את כיסוי למגש המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צלחת הכוורת מחוסן החדש למגש מדגם (להשתמש בחריץ שמאל אם אתה רק קריאה אחת צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את מכסה למגש מדגם ולהפחית את המכסה לתא האינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כדי לוודא את הנוזל העברת החום הוא מעל פני המילוי המינימלי. אם נמוך, להוסיף יותר באמצעות פיפטה 1000 μL עם הנוזל החום העברת סיפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנה Bioscreen &quot;EZExperiment&quot;, להגדיר את הפרמטרים הבאים כדי להשיג עקומות גדילה מתאים cerevisiae Saccharomyces: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר דוגמאות: הזן את מספר בארות עם התקשורת או 200 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן: 420-580nm, פס רחב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפרטורה: 30 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אורך הניסוי: יום 1, 0 שעות, 0 שניות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרווח מדידה: 30 דקות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טלטול: ביום רועד, רציף, גבוהה </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ &quot;התחל&quot; כדי להתחיל בקריאה. </li></ol> חלק 4: ניתוח נתונים בדרך כלל, שישה לגיל נקודות נלקחים במשך שבועיים. גיל נקודות נלקחה ב 2 ימים, 4, 6, 9, 11 ו 13. בהתאם לעיצוב ניסיוני זנים למבחן, זה עשוי להיות רצוי לקחת לגיל נקודות פחות או יותר, לעתים קרובות או למשך זמן ארוך יותר מ -2 שבועות. חשוב לטעון את הכוורת צלחת באותו סדר עבור נקודת בגיל כל כך שכל תרבות הזדקנות מתאים לתפקיד גם באותה נקודה בכל גיל, כמו זו יהפכו את ניתוח הנתונים הרבה יותר קל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את קבצי פלט מן המכונה C-MBR Bioscreen. התוכנה &quot;EZExperiment&quot; יהיה פלט הנתונים Bioscreen כקובץ מופרד באמצעות טאבים התואמת Microsoft Excel, כמו גם תוכנות אחרות. העמודה הראשונה מראה באיזו שעה המדידה OD צולמה במהלך הניסוי, עם עמודות עוקבות המייצגים כל היטב את הצלחות Bioscreen הכוורת (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הקריאה הראשונה OD מהעמודה מדי. קריאה זו היא &quot;רעש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נרמל את הנתונים על ידי הפחתת ערך OD הבאר עם YEPD לבד כל עמודה מכל ערכי OD. זה מסיר את ספיגת רקע על ידי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את הקימורים תוצאה. עקומות יעבור כפונקציה של גיל (איור 2). לדוגמה, על ידי מתכננים את עקומות תולדה מעמודה 1 (גם 1 הצלחת הכוורת) על שש נקודות זמן, יש תזוזה ימינה של עקומות שונות לאורך זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את זמן ההכפלה (δ) עבור כל מבוסס היטב על קינטיקה צמיחה של 2 יום לגיל נקודה. המשוואה לחישוב זמן ההכפלה is: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="משוואה" /> שם OD OD 1 ו 2 מייצגים מדידות עוקבות OD ו-t 1 ו t 2 לעת עתה בין המדידות. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. חישוב הכפלת פעמים בלבד בין ערכי OD של 0.2 עד 0.5. הממוצע של ערכים אלה הוא זמן ההכפלה עבור היטב. רוב wild-type זני שמרים צריך לתת זמן הכפלת ערך בין 85 עד 90 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל נקודה גיל, לחשב את זמן המעבר (Δt) את עקומות תוצאה יחסית הראשונית לגיל נקודה (יום 2). דרך קלה לעשות זאת היא לקבוע את ההבדל משך הזמן שנדרש גם כל להגיע OD של 0.3 בין ראשוני לגיל נקודה וכל הבאים לגיל נקודה. השעה מסוים הגיעו גם OD של 0.3 ניתן לחשב מתוך המשוואה רגרסיה ליניארית המתאים ln (OD) כפונקציה של זמן בין שתי נקודות זמן שניצבות OD = 0.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב חלק לשרוד בשלב בגיל זה על מנת ליצור עקומת ההישרדות (איור 3). הגדר הראשוני לגיל נקודה (יום 2) להיות הכדאיות של 100%. עבור כל רצופים גיל נקודת לחשב את אחוז ההישרדות באמצעות המשוואה: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="שנית משוואה" width="245" height="115" /> שם של n הוא אחוז ההישרדות, Δt n הוא שינוי הזמן, δ n הוא זמן ההכפלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת עקומות ההישרדות (איור 3B) הרצוי עבור כל (או לשכפל בארות) גם על ידי מתכננים את השבר (או אחוז) של תאים קיימא כפונקציה של גיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב נפרד ההישרדות (SI) עבור כל טוב. ת&quot;י מוגדר כשטח תחת עקומת ההישרדות יכול להיות מוערך על ידי הנוסחה: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="משוואה 3" width="400" height="79" /> גיל n היכן הוא הגיל נקודות (לדוגמא: 2, 4, 6, 9, 11 ו 13) ו-S n הוא ערך הישרדותי בנקודה בגיל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת פרמטרים סטטיסטיים של בארות לשכפל מהנתונים SI והישרדות. פרמטרים סטטיסטיים נפוצים עניין כוללים חציון מתכוון, ו שונות עבור כל קבוצה של הביולוגי משכפל. T-test או ניתוח דומה ניתן להשתמש לצורך השוואה pairwise של SI עבור ניסויים שונים וקבוצות שליטה. זה יכול להיות גם רצוי ליצור עקומות הישרדות, כמתואר מ בממוצע ביולוגי משכפל ב 4.8. </li></ol> חלק 5: תוצאות נציג בסיום הניסוי, תצטרך להתוות את עקומת ההישרדות וביצע ניתוח נתונים מספיקים כדי לקבוע את פוטנציאל ההזדקנות הכרונולוגי של זנים שונים, או כמה תנאים. אם מבוצעת כראוי, עקומות גדילה המתקבל המכונה C-MBR Bioscreen צריך להיראות דומים לאלה שמוצג באיור 2 ואת עקומות הישרדות וכתוצאה מכך צריכה להיות דומה לאלה שמוצג באיור 3. באופן כללי, wild-type תאים בתרבית בתנאים שתוארו כאן תהיה תוחלת החיים החציונית כרונולוגי בסדר גודל של 7 ימים. וריאציה משמעותית הישרדות היא נצפתה זנים שונים תחת כמה תנאים, כגון גדילה בתקשורת גלוקוז 0.05%, חציון ההישרדות יכול לעלות על 30 ימים. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> 1. באיור נתונים פלט מן &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen התוכנית. טור מציג את הזמן שבו קריאה ספיגת נלקח. עמודות רצופים לייצג את בארות הצלחת הכוורת מחוסן עם תאים שנלקחו מתרבויות ההזדקנות. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> איור 2. עקומות תולדה מן לשכפל ביולוגי אחד במהלך ניסוי. יש שינוי בולט עקומות במשך הזמן התאים בתרבית ההזדקנות לאבד הכדאיות. משך הזמן בין נקודת הזמן הראשונית (יום 2) ונקודת זמן רצופים קובע הכדאיות בגיל מסוים. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> איור 3. א) עקומת ההישרדות שנוצר באמצעות הנתונים תולדה של איור 1. 2 ביום נקודת זמן מוגדר כנקודת את הכדאיות של 100%. B) עקומות הישרדות הסופי של שני הזנים שנבדקו בניסוי זהה. אלה עקומות הישרדות לייצג את viabilities ממוצע של שלושה ביולוגיים משכפל עבור כל זן. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן תוך ביולוגי משכפל. אזור מוצל מתחת לעקומה מייצג את הישרדות הישרדות אינטגרלי (SI) עבור זן 1. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> טבלה 1. מוגדר בינוני סינתטי משמש ללימודי הזדקנות כרונולוגית (זן backgrouBY4743 nd) </td></tr><tr><td> רכיב </td><td> ריכוז (g / L) </td></tr><tr><td> D-גלוקוז </td><td> 20 </td></tr><tr><td> חנקן שמרים הבסיס (-AA/AS) </td><td> 1.7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> אדנין </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-ארגנין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-חומצה אספרטית </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-היסטידין </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-ליזין </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 0.375 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-טריפטופן </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0.03 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> אורציל </td><td> 0.1 </td></tr></tbody></table> הערה: מתכון זה מהווה auxotrophies ב זן דיפלואידי BY4743. Auxotrophies חומצות אמינו צריך להיות מתוגמל על ידי הוספת הריכוז הסופי 5X למדיום להשלים סינתטי.

<ol>
	<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicative+aging+in+yeast:+the+means+to+the+end.">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29 (2008).</li><li>Kaeberlein, M., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of models for human aging. , 109 (2006).</li><li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae.">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73 (2003).</li><li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span.">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113 (2008).</li><li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast.">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733 (2006).</li><li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055 (2004).</li></ol>

תפוקה גבוהה כרונולוגי תוחלת החיים assay המתוארת כאן היא שיטה יעילה לכימות פוטנציאל התיישנות מספר גדול של זנים עם דיוק דיוק גבוהה. ההתקדמות העיקרית של שיטה זו על פני שיטות קלאסיות לקביעת הישרדות ידי ספירת המושבה להרכיב יחידות (לדוגמא: לראות 3) הוא השימוש במכשיר שיי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Bacto Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>211677</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Yeast Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>288620</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Difco Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BD</td>
<td>214530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast Nitrogen Base w/o A.A. and A.S.</td>
<td>Reagent</td>
<td>MidSci</td>
<td>J630-500G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amino Acids</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum</td>
<td>AM185</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dextrose</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>D16-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen C MBR machine</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>5101370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bioscreen 100-well Honeycomb plate</td>
<td>Tool</td>
<td>Growth Curves USA</td>
<td>9502550</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells

שמרים ניצני<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; הוכיחה להיות אורגניזם מודל חשוב בתחום של מחקר ההזדקנות<sup&gt; 1</sup&gt;. Replicative ואת תוחלת החיים כרונולוגי שתי פרדיגמות הוקמה בשימוש ללמוד הזדקנות בשמרים. הזדקנות replicative מוגדר כמספר התאים בת תא יחיד אמא שמרים מייצרת לפני הזדקנות, הזדקנות כרונולוגי מוגדר על ידי האורך של התאים זמן יכול לשרוד במצב הלא חלוקת קפאון כמו,<sup&gt; 2</sup&gt;. פיתחנו שיטת תפוקה גבוהה עבור מדידה כמותית של תוחלת החיים כרונולוגי. שיטה זו כרוכה הזדקנות התאים בינוני מוגדר תחת תסיסה בטמפרטורה קבועה. בשלב גיל זה, האוכלוסייה משנה של תאים יוסר התרבות הזדקנות מחוסן לתוך מדיום גידול עשיר. רזולוציה גבוהה עקומת גדילה מתקבל אז לאוכלוסייה קטן זה של תאים בגילאי באמצעות מכונה Bioscreen C-MBR. אלגוריתם מוחל אז כדי לקבוע את חלקם היחסי של תאים קיימא באוכלוסייה משנה כל מבוסס על קינטיקה צמיחה בנקודה בגיל זה. שיטה זו דורשת זמן ומשאבים באופן משמעותי פחות בהשוואה כרונולוגי מבחני אחרות תוחלת החיים תוך שמירה על שחזור ודיוק. אופי תפוקה גבוהה של assay זה אמור לאפשר בקנה מידה גדול מסכי גנטיים כימיים לזהות מכפילי אריכות ימים הרומן לבדיקה נוספת של אורגניזמים מורכבים יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells at JoVE.com

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.5K Views.  University of Washington. הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

Video: Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

A Rapid Technique for the Visualization of Live Immobilized Yeast Cells

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence microscopy. The technique is equally suited for visualization of static yeast populations, or time courses experiments up to ten hours in length. My microscopy investigates epigenetic inheritance at the silent mating loci in S. cerevisiae. There are two silent mating loci, HML and HMR, which are normally not expressed as they are packaged in heterochromatin. In the sir1 mutant background silencing is weakened such that each locus can either be in the expressed or silenced epigenetic state, so in the population as a whole there is a mix of cells of different epigenetic states for both HML and HMR. My microscopy demonstrated that there is no relationship between the epigenetic state of HML and HMR in an individual cell. sir1 cells stochastically switch epigenetic states, establishing silencing at a previously expressed locus or expressing a previously silenced locus. My time course microscopy tracked individual sir1 cells and their offspring to score the frequency of each of the four possible epigenetic switches, and thus the stability of each of the epigenetic states in sir1 cells. See also  Xu et al., Mol. Cell 2006.

A rapid technique for the visualization of growing immobilized yeast cells, here applied to fluorescent reporters at the silent mating loci HML and HMR

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

We present here a simple, rapid, and extremely flexible technique for the immobilization and visualization of growing yeast cells by epifluorescence ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as a principal model used to study the biology of aging. Because virtually every biological subsystem undergoes functional decline with increasing age, life span is the primary endpoint of interest when considering total rate of aging. In nematodes, life span is typically defined as the number of days an animal remains responsive to external stimuli. Nematodes can be propagated either in liquid media or on solid media in plates, and techniques have been developed for measuring life span under both conditions. Here we present a generalized protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid nematode growth media and fed a diet of UV-killed bacteria. These procedures can easily be adapted to assay life span under various common conditions, including a diet consisting of live bacteria, dietary restriction, and RNA interference.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span on Solid Media

In this article we present a general protocol for measuring life span of nematodes maintained on solid media with UV-killed bacterial food.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח על מדיה מוצק

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The nematode ...

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor mutations in components of age-regulatory pathways. If these mutations perturb the function of the age-regulatory pathway and therefore alter the lifespan of the entire organism, they provide important mechanistic insights1-3.
Another strategy to investigate the regulation of lifespan is to use small molecules to perturb age-regulatory pathways. To date, a number of molecules are known to extend lifespan in various model organisms and are used as tools to study the biology of aging4-16. The number of molecules identified thus far is small compared to the genetic "toolset" that is available to study the biology of aging.
Caenorhabditis elegans is one of the principle models used to study aging because of its excellent genetics and short lifespan of three weeks. More recently, C.elegans has emerged as a model organism for phenotype based drug screens5,7,16-20 because of its small size and its ability to grow in microtiter plates.
Here we present an assay to measure C.elegans lifespan in 96 well microtiter plates. The assay was developed and successfully used to screen large libraries for molecules that extend C.elegans lifespan7. The reliability of the assay was evaluated in multiple tests: first, by measuring the lifespan of wild type animals grown at different temperatures; second, by measuring the lifespan of mutants with altered lifespans; third, by measuring changes in lifespan in response to different concentrations of the antidepressant Mirtazepine. Mirtazepine has previously been shown to extend lifespan in C.elegans7. The results of these tests show that the assay is able to replicate previous findings from other assays and is quantitative. The microtiter format also makes this lifespan assay compatible with automated liquid handling systems and allows integration into automated platforms.

Measuring Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Microtiter Plates

In this protocol we present a method to measure Caenorhabditis elegans lifespan in 96 well microtiter plates.

מדידת Caenorhabditis elegans חיים טווח של 96 צלחות microtiter טוב

Lifespan is a biological process regulated by several genetic pathways. One strategy to investigate the biology of aging is to study animals that harbor ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

דור והתרבות של דם תולדה תאי אנדותל מאדם דם היקפי

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.