Gli autori riconoscono il sostegno di questo lavoro con borse U54 RR022220 e P50 GM076547 a JDA presso gli Istituti Nazionali di Salute degli Stati Uniti. FDM è un collega postdoctoral con gli Istituti Canadesi per la Ricerca sulla Salute. Ringraziamo inoltre il Centro di Lussemburgo per la Sistemi Biomedicina e l&#39;Università di Lussemburgo per il supporto.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il test ODELAY ha diversi punti critici per garantire misure fenotipiche riproducibili e affidabili. Il primo punto critico è la preparazione costante delle colture di lievito. Occorre prestare attenzione a raccogliere le cellule del lievito dalla crescita logaritmica. Se le culture sono saturate, la loro eterogeneità della popolazione sarà aumentata, che può offuscare l&#39;eterogeneità causata da fattori genetici o ambientali ( ad esempio, fonte di carbonio) 11 . Il secondo punto critico è la preparazione coerente dei supporti. In generale, è necessario generare un ampio volume di 10X media media solution e quindi utilizzare nel tempo per ridurre al minimo gli effetti batch. Formulare i supporti in peso, quando possibile, aiuta a migliorare la consistenza del mezzo nel tempo assicurando la densità di agar e il tenore totale dell&#39;acqua dell&#39;agarosio può essere strettamente monitorato. Il terzo punto critico comporta minimizzare o eliminare qualsiasi deformazione meccanica dell&#39;agarosio media. La deformazione meccanica dei supporti si verifica più frequentemente durante la separazione dell&#39;agarosio dalle vetrate. Come per molte tecniche di laboratorio, è necessaria la pratica per capire questo passo. La variazione del tempo di ritardo come mostrato nella figura 4 è spesso correlata a uno dei tre fattori: deformazione meccanica del mezzo agarosio, variazione dello spessore agarizzato o una sorgente luminosa instabile. Se il mezzo di agarosio varia in altezza Z attraverso l&#39;array spotted, la variazione di altezza può superare l&#39;intervallo della routine di autofocus, causando che le immagini iniziali siano leggermente fuori fuoco. Per questo motivo, controllare l&#39;altezza di messa a fuoco in più punti al centro e lungo i bordi della matrice macchiata per assicurare che la routine di autofocus abbia una sufficiente gamma di Z per trovare la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il pannello Autofocus per aumentare l&#39;intervallo di messa a fuoco e aumentare il numero di passi di messa a fuoco. Un terzo possibile conditIone che può portare a un cattivo fuoco è una sorgente luminosa instabile o sfarfallante che può interrompere il punteggio di focalizzazione calcolato per una specifica altezza Z. Le lampade alogene del tungsteno tendono a sfarfallare ben prima che le lampadine bruciano. L&#39;effetto di scarsa attenzione viene osservato in un esempio in cui le curve di crescita inumidiscono tra il primo e il secondo punto temporale ( Figura 5 A ), mentre il punto adiacente non ha lo stesso tuffo ( Figura 5 B ). In questo caso, la scarsa condizione di messa a fuoco è stata alleviata sostituendo la sorgente di luce alogena al tungsteno. In pratica, gli autori hanno scoperto che per ridurre il sfarfallio di lampadine alogene da 100W, le lampadine devono essere sostituite ogni 500 ore circa ogni due mesi quando i microscopi sono sotto uso pesante. Per evitare problemi di messa a fuoco poveri da una lampadina di sfarfallio, sostituire spesso la fonte di luce alogena al tungsteno o sostituire la lampada alogena con una sorgente luminosa a diodi. UnEsempio di un set di dati che mostra una scarsa variabilità dei tempi di raddoppiamento e tempi di ritardo più uniformi è mostrato in Figura 6 . Questo set di dati è stato scattato con un diodo illuminante che fornisce un&#39;illuminazione più stabile nel tempo durante l&#39;esecuzione dell&#39;autofocus. Mentre molti dei punti menzionati qui per ottimizzare la preparazione dei media potrebbero apparire evidenti, nella letteratura gli schermi di grandi dimensioni non si replicano bene tra loro 8 , 11 . Di conseguenza, abbiamo descritto con cura la preparazione di culture e agarosi in modo da generare schermature fenotipiche più riproducibili. Il test ODELAY è attualmente limitato nel throughput se confrontato con i test basati sul pinning come gli array genetici sintetici o il dosaggio Scan-O-Matic. Mentre questi metodi aumentano il numero di ceppi misurati, non hanno la capacità di risolvere singole cellule aE quindi non è possibile misurare l&#39;eterogeneità della popolazione che osserviamo nei ceppi di lievito clonale. L&#39;origine di questa eterogeneità della popolazione non è attualmente compresa, ma la fusione della tecnologia e del calcolo come qui dimostrato offre un&#39;opportunità per affrontare oggettivamente i meccanismi cellulari sottostanti 12 . Gli autori vogliono notare che ODELAY è attualmente ottimizzato solo per uno specifico marchio e tipo di corpo del microscopio. La modifica di ODELAY per altri sistemi di microscopio è diretta, ma richiede la conoscenza dell&#39;API open source 13 . Tuttavia, sia l&#39;API che gli script ODELAY sono scritti per essere facilmente adattati a diversi sistemi e test sperimentali. Mentre ODELAY è stato originariamente sviluppato per il lievito, siamo stati in grado di utilizzarlo senza modifiche per osservare la crescita di Mycobacterium smegmatis . Osservazione dell&#39;altra colonia che formano microrganismi èPossibile con modifiche al codice sorgente fornito 11 . In generale, ODELAY è uno strumento potente e flessibile per confrontare i microrganismi coltivati ​​in condizioni ambientali differenti e perturbazioni genetiche.

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un forte indicatore della loro forma genetica sottostante a una determinata condizione ambientale. La crescita è classicamente segregata in 3 diversi regimi di crescita: la fase a ritardo, la fase log-fase e la fase stazionaria 1 . Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che dipendono da varie condizioni ambientali e genetiche. Ad esempio, il tempo di ritardo o la lunghezza di tempo che un organismo trascorre in fase di ritardo prima dell&#39;inizio della crescita esponenziale può essere indicativo della capacità di un organismo di rispondere alle condizioni ambientali alterate 2 . Il tempo di raddoppiamento durante la fase di fase log-phase, la metrica più comune di idoneità cellulare, rivela l&#39;efficienza complessiva dell&#39;abilità di un organismo di dividere metabolizzando e utilizzando materiali ambientali per la replica. La fase stazionaria, in cui la crescita dopo la fase log-fase è rapidamente ridotta, è un altro indicatore di idoneità, che è regolareUtilizzata come punto finale di crescita nei test di crescita del lievito a base di spot. Sono attualmente disponibili diversi test di crescita del lievito e considerati metodi standard per la valutazione dei fenotipi di crescita nel lievito 3 , 4 , 5 . Questi dosaggi sono basati principalmente sui metodi per la coltivazione di lieviti sia su supporti solidi che liquidi. Sui supporti solidi, i test di colonizzazione della colonia trasferiscono un piccolo numero di cellule su agar solido con un perno e le cellule di lievito sono lasciate crescere per un determinato periodo di tempo. Le colonie vengono poi visualizzate e le loro dimensioni vengono confrontate ad un terminale terminale 6 . Questi test di colonizzazione della colonia sono stati dimostrati robusti e scalabili per generare schermi di genoma. Più recentemente, in questi saggi sono state incorporate immagini periodiche con scanner a piatto e telecamere a riflessione a lenti singole (SLR) per registrare la crescita della colonia nel tempo 7 , 8, 9 . Tuttavia, la risoluzione di questi dispositivi impedisce loro di individuare singole celle e, di conseguenza, questi dosaggi della colonia non osservano direttamente il ritardo e non possono osservare variazioni tra le singole cellule che crescono in colonie. I test di crescita a base liquida sono stati impiegati anche per eseguire schermi a livello genomico 3 . Accoppiare un test di crescita liquido con la microscopia a tempo trascorso ha rivelato l&#39;eterogeneità della popolazione nel tempo di raddoppiamento delle cellule geneticamente identiche, che offre una prospettiva importante per comprendere la regolazione genetica e l&#39;adattamento ambientale. Tuttavia, questo dosaggio non misura altri aspetti della crescita, come il tempo di ritardo e la capacità di trasporto 10 . Qui presentiamo un metodo per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita dei microrganismi che formano la colonia su supporti solidi usando un saggio di cui abbiamo termine ODELAY 11 . ODELAY consiste di utiliZing la microscopia ad alta velocità di throughput per registrare le immagini delle cellule singole che crescono in colonie su supporti solidi. Questa popolazione di singole cellule che crescono in colonie rivela l&#39;eterogeneità della popolazione che non è rilevata da altre misurazioni meno sensibili come il punteggio finale di terminale. Noi dimostriamo il metodo sul lievito, ma ODELAY può essere applicato a qualsiasi organismo che mostra il contrasto in microscopia a campo luminoso.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agarose UltraPure</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td style="width:413px;">Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract Peptone (YEP)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete Suplement Mixture (CSM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP114560222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td>
			<td style="width:131px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4741</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4742</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430291</td>
			<td>1 case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate flat bottom</td>
			<td style="width:131px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hydra liquid handleing robot</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">1096-DT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">5527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Synergy H4 Plate Reader</td>
			<td style="width:131px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">H4MLFAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica DMI6000 B Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica 10X/0.3NA objective</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">11506289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td>
			<td style="width:131px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MATLAB with image processing tool box</td>
			<td style="width:131px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MicroManager</td>
			<td style="width:131px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Microscope Chamber</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Agar Molds</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un indicatore forte della loro forma genetica sottostante e possono essere segregati in 3 regimi di crescita: fase a fase di fase, fase log-fase e fase stazionaria. Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che sono legati a varie condizioni ambientali e genetiche. Le misurazioni ad alta risoluzione e quantitativa di tutte e tre le fasi di crescita sono generalmente difficili da ottenere. Qui presentiamo un metodo dettagliato per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita su supporti solidi usando un saggio chiamato Valutazione delle matrici viventi di lieviti (ODELAY) di una sola cellula. ODELAY ha quantificato i fenotipi di crescita di singole cellule che crescono in colonie su supporti solidi utilizzando microscopia a tempo trascorso. Questo metodo può osservare direttamente l&#39;eterogeneità della popolazione con ogni parametro di crescita in cellule geneticamente identiche che crescono in colonie. Questa eterogeneità della popolazione offre una prospettiva unica per comprendere la regolazione genetica e epigenetica, e le risposte aPerturbazioni genetiche e ambientali. Mentre il metodo ODELAY è dimostrato utilizzando il lievito, può essere utilizzato su qualsiasi microrganismo che produce la colonia che è visibile dalla microscopia a campo luminoso.

<html> Le immagini esemplari di lieviti che crescono in microscopia a tempo trascorso sono mostrate nella Figura 3B . Dopo aver elaborato le immagini di time-lapse, è mostrato in Figura 4 un insieme di dati rappresentativo che confronta i ceppi di lievito BY4741 &amp; BY4742. In questo set di dati di esempio, vi è una scarsa variazione nel tempo di raddoppiamento tra diverse posizioni sulla piastra. Se il mezzo agarosio è preparato male, allora una evidente deviazione sia nel tempo di raddoppiamento che nel tempo di ritardo sarebbe apparente nelle posizioni di scatto che coincidono con la regione deformata del gel agarosio. Mentre i tempi di raddoppiamento sembrano essere relativamente uniformi, questo esempio mostra variazioni nelle misurazioni del tempo di ritardo. Un insieme di dati più coerente è mostrato in Figura 6 . In questo set di dati, sia il tempo di ritardo che il tempo di raddoppiamento sono uniformi. File / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Assemblaggio della muffa di agar. I componenti dello stampo agar sono mostrati in ( A ). Montare la base come illustrato in ( B ) e quindi fissare la base con piccoli fermi di legante. Posizionare i pezzi più in posizione longitudinale nella cavità della base ( C ) e quindi incollare le diapositive nello stampo come mostrato in ( D ). Una vista laterale che mostra l&#39;angolo dello stampo e l&#39;orientamento del cerchio di stampo necessario per una separazione uniforme dell&#39;agar dalla slitta di vetro ( E ). Notare la posizione del pollice e dei forefingers, così come la linea retta dell&#39;agar che separa dalla diapositiva ( F ) e nota la freccia orizzontale. La linea di separazione deve spostarsi uniformemente in direzione delle frecce verticali. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> = &quot;Jove_content&quot; per: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Figura 2: Metodo di Sonication e Spotting. Sonicare la piastra in acqua di ghiaccio e utilizzare un supporto per secchi di centrifuga per aiutare a sostenere la piastra ( A ). Posare le piastre dalle fasi 3.8.1 fuori per la macchia sulla piastra agarosa ( B ). Inoltre, predisporre le punte in modo che la scatola sinistra più punta ha una punta nella posizione C10 e poi quattro altri punta con le loro estremità tagliate in modo che non rompino il supporto piastra ( C ). Posizionare i rimanenti rimanenti in quattro scatole in modo che le posizioni interne 24 punte siano occupate ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Interfaccia utente grafica ODELAY. Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Questa interfaccia consente di monitorare la fotocamera e di regolare le impostazioni di illuminazione del microscopio per le modalità epifluorescenti e quelle a campo luminoso. Le frecce rosse puntano sui pulsanti Focus e Transmitted che attivano la fotocamera per acquisire rapidamente le immagini e aprire rispettivamente l&#39;otturatore luminoso trasmesso. Le frecce blu vengono utilizzate per spostare lo stadio per l&#39;origine e quindi impostare l&#39;origine con il pulsante &quot;Go Origin&quot; e il pulsante &quot;Set&quot;. Le frecce verdi puntano a &quot;Reset&quot; e &quot;ODELAY !!!&quot; Pulsanti che ripristina le modalità di immagine ODELAY alle condizioni attuali e inizia la collezione di immagini ODELAY. Immagini di lieviti che si coltivano su un mezzo solido a 0, 3, 6 e 9 ore dopo la comparsa ( B ). Un colpo di schermo dell&#39;interfaccia grafica per &quot;ODELAY_IPT.m&quot; o th<html> E ODELAY Strumento di elaborazione delle immagini ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio ODELAY Output. Questo insieme di dati confronta i ceppi BY4741 e BY4742 su supporti YPD. Questa figura è un esempio di uno scivolo agarosico ben preparato; Tuttavia, le impostazioni di autofocus non sono ottimali. I dati presentati in ciascuna colonna, da sinistra a destra, sono: la capacità di carico nel log 2 dell&#39;area colonia; Il tempo di raddoppiamento, dato in min; E tempi di ritardo, dati in min. In questo esempio, i tempi di raddoppiamento di tutti i punti sulla linea di agar si allineano bene con una piccola quantità di tempo di raddoppiamento aumentato verso la colonna. Tuttavia, i tempi di ritardo variano notevolmente in questo set di dati._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Figura 5: Esempi di curva di crescita. Questo esempio dimostra come la focalizzazione iniziale scarsa può causare il tempo di ritardo stimato (t lag ) per aumentare ( A ), mentre la posizione adiacente mostra un tempo di ritardo più breve ( B ). T d è il tempo di raddoppiamento in min e t lag è il tempo di ritardo in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Figura 6: Esempio di esperimento di prova eseguito bene. Un eEsemplare del ceppo BY4742 testato dopo aver sostituito una lampadina alogena al tungsteno con un diodo illuminante e assicurando che l&#39;autofocus sia impostato correttamente. Tutti i tempi di raddoppiamento sembrano sovrapporsi bene ei tempi di ritardo sembrano essere coerenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata &quot;Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito&quot; (ODELAY). L&#39;eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Institute for Systems Biology.  Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata "Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito" (ODELAY). L'eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata. 

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Ricerca

Biologia

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

Immunostaining lotto per la grande rivelazione di proteine ​​nel cervello della scimmia Whole

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Screen piccole molecole

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

Assistita da computer su larga scala di visualizzazione e quantificazione della Messa di isole pancreatiche, distribuzione delle dimensioni e architettura

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

Lievito Colony metodo di inserimento

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

I saggi di crescita per valutare la tossicità poliglutamina nel lievito

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parametro di misura della apertura dei pori di transizione di permeabilità nel Cuore mouse mitocondri isolati

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

Una strategia per sensibili, su larga scala quantitative Metabolomica

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

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Lievito Colony metodo di inserimento

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Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

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