Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
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Die Autoren bestätigen die Unterstützung für diese Arbeit durch Zuschüsse U54 RR022220 und P50 GM076547 an JDA von den US National Institutes of Health. FDM ist ein Postdoktorand mit den kanadischen Instituten für Gesundheitsforschung. Wir danken dem luxemburgischen Zentrum für Systembiomedizin und der Universität Luxemburg für die Unterstützung.

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der ODELAY-Test hat mehrere kritische Punkte, um reproduzierbare und zuverlässige phänotypische Messungen zu gewährleisten. Der erste kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Hefekulturen. Es muss darauf geachtet werden, die Hefezellen aus logarithmischem Wachstum zu ernten. Wenn die Kulturen gesättigt sind, dann wird ihre Heterogenität der Bevölkerung erhöht, die Heterogenität durch genetische oder umweltbedingte ( z. B. Kohlenstoffquellen) Faktoren beeinträchtigen kann 11 . Der zweite kritische Punkt ist die konsequente Vorbereitung der Medien. Im Allgemeinen sollte ein großes Volumen von 10X-Stammmedien-Lösung generiert und dann im Laufe der Zeit verwendet werden, um Batch-Effekte zu minimieren. Die Formulierung von Medien nach Gewicht, wann immer möglich, hilft, die Konsistenz des Mediums im Laufe der Zeit zu verbessern, indem die Dichte des Agars sichergestellt wird und der Gesamtwassergehalt der Agarose genau überwacht werden kann. Der dritte kritische Punkt beinhaltet die Minimierung oder Beseitigung jeder mechanischen Verformung der Agarose michDia Eine mechanische Verformung des Mediums erfolgt am häufigsten bei der Trennung der Agarose aus den Glasscheiben. Wie bei vielen Labortechniken ist die Praxis erforderlich, diesen Schritt zu beherrschen. Die Variation der Verzögerungszeit, wie in Fig. 4 dargestellt , ist oft mit einem der drei Faktoren verbunden: mechanische Verformung des Agarosemediums, Veränderung der geformten Agardicke oder einer instabilen Lichtquelle. Wenn sich das Agarose-Medium in der Z-Höhe über das gefleckte Array ändert, kann die Höhenvariation den Bereich der Autofokus-Routine überwältigen, wodurch die Anfangsbilder leicht unscharf werden. Aus diesem Grund überprüfen Sie die Fokushöhe an mehreren Stellen in der Mitte und entlang der Kanten des gefleckten Arrays, um sicherzustellen, dass die Autofokusroutine genügend Z-Bereich hat, um Fokus zu finden. Wenn nötig, verwenden Sie das Autofocus-Bedienfeld, um den Fokusbereich zu erhöhen und die Anzahl der Fokussierungsschritte zu erhöhen. Ein dritter möglicher conditIonen, die zu einem schlechten Fokus führen können, ist eine instabile oder flackernde Lichtquelle, die die berechnete Fokusbewertung für eine bestimmte Z-Höhe stören kann. Wolfram Halogenbirnen neigen dazu, gut zu flackern, bevor die Birnen ausbrennen. Die Wirkung eines schlechten Fokus wird in einem Beispiel beobachtet, bei dem die Wachstumskurven zwischen den ersten und zweiten Zeitpunkten eintauchen ( Abbildung 5 A ), während der benachbarte Punkt nicht das gleiche Dip hat ( Abbildung 5 B ). In diesem Fall wurde die schlechte Fokusbedingung durch Ersetzen der Wolfram-Halogen-Lichtquelle gemildert. In der Praxis haben die Autoren festgestellt, dass, um das Flackern von 100W-Wolfram-Halogenlampen zu reduzieren, die Glühbirnen alle 500 h oder etwa alle 2 Monate ausgetauscht werden müssen, wenn die Mikroskope stark untergebracht sind. Um eine schlechte Fokusausgabe von einer flackernden Glühlampe zu vermeiden, ersetzen Sie die Wolfram-Halogen-Lichtquelle oft oder ersetzen Sie die Halogenlampe mit einer Diodenlichtquelle. EinBeispiel eines Datensatzes, der eine geringe Variation der Verdopplungszeiten sowie einheitlichere Verzögerungszeiten zeigt, ist in Fig. 6 gezeigt . Dieser Datensatz wurde mit einem Dioden-Illuminator aufgenommen, der eine stabilere Ausleuchtung über die Zeit bietet, während er den Autofokus durchführt. Während viele der hier erwähnten Punkte zur Optimierung der Medienvorbereitung offensichtlich erscheinen, zeigen sich in der Literatur die meisten Großbildschirme nicht gut miteinander, 8 , 11 . Daher haben wir sorgfältig die Vorbereitung von Kulturen und Agarose-Medien beschrieben, so dass mehr reproduzierbare phänotypische Bildschirme erzeugt werden können. Der ODELAY-Assay ist derzeit im Durchsatz im Vergleich zu Pinning-basierten Assays wie synthetischen genetischen Arrays oder dem Scan-O-Matic-Assay begrenzt. Während diese Methoden die Anzahl der gemessenen Stämme erhöhen, fehlt ihnen die Fähigkeit, einzelne Zellen zu lösenDaher kann man die Heterogenität der Bevölkerung nicht messen, die wir in klonalen Hefestämmen beobachten. Der Ursprung dieser Heterogenität wird derzeit nicht verstanden, aber die hier beschriebene Verschmelzung von Technik und Berechnungen bietet eine Möglichkeit zur objektiven Adressierung der zugrunde liegenden zellulären Mechanismen 12 . Die Autoren möchten beachten, dass ODELAY derzeit nur für eine bestimmte Mikroskopmarke und Körpertyp optimiert ist. Das Ändern von ODELAY für andere Mikroskopsysteme ist einfach, erfordert jedoch Kenntnisse der Open Source API 13 . Allerdings werden sowohl die API als auch die ODELAY Scripts geschrieben, um leicht an verschiedene Systeme und experimentelle Assays angepasst zu werden. Während ODELAY ursprünglich für Hefe entwickelt wurde, konnten wir es ohne Veränderung nutzen, um das Wachstum von Mycobacterium smegmatis zu beobachten. Die Beobachtung der anderen Kolonie bildenden Mikroorganismen istMöglich mit Änderungen am Quellcode 11 . Im Allgemeinen ist ODELAY ein leistungsfähiges und flexibles Werkzeug für den Vergleich von Mikroorganismen, die unter verschiedenen Umgebungsbedingungen und genetischen Störungen gewachsen sind.

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Eignung zu einem gegebenen Umgebungszustand. Das Wachstum wird klassisch in 3 verschiedene Wachstumsregimes getrennt: Lag-Phase, Log-Phase und stationäres Phasenwachstum 1 . Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die von verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen abhängig sind. Zum Beispiel kann die Verzögerungszeit oder die Zeitspanne, in der ein Organismus vor dem Beginn des exponentiellen Wachstums in der Verzögerungsphase verbringt, auf die Fähigkeit eines Organismus hinweisen, auf veränderte Umgebungsbedingungen zu reagieren 2 . Die Verdopplungszeit während des Log-Phase-Wachstums, die häufigste Metrik der zellulären Fitness, zeigt die Gesamteffizienz der Fähigkeit eines Organismus, sich durch Metabolisierung und Nutzung von Umweltmaterialien für die Replikation zu teilen. Stationäre Phase, wo Wachstum nach Log-Phase schnell reduziert wird, ist ein weiterer Indikator für Fitness, die regelmäßig istAls Wachstumsendpunkt in punktbasierten Hefewachstums-Assays verwendet. Mehrere Hefewachstumstests sind derzeit verfügbar und gelten als Standardmethoden zur Bewertung von Wachstumsphänotypen in Hefe 3 , 4 , 5 . Diese Assays basieren in erster Linie auf Methoden zum Anbau von Hefe entweder auf festen oder in flüssigen Medien. Auf festen Medien übertragen Kolonie-Pinning-Assays eine kleine Anzahl von Zellen auf einen festen Agar mit einem Pin und Hefe-Zellen können für eine definierte Zeitspanne wachsen. Kolonien werden dann abgebildet und ihre Größen werden an einem Endpunkt 6 verglichen. Diese Kolonie-Pinning-Assays haben sich als robust und skalierbar erwiesen, um genomweite Bildschirme zu erzeugen. In jüngster Zeit wurde eine periodische Bildgebung mit Flachbett-Scannern und Einzelobjektivreflex (SLR) -Kameras in diese Assays integriert, um das Koloniewachstum über die Zeit 7 , 8 aufzuzeichnen, 9 Die Auflösung dieser Vorrichtungen verhindert jedoch, dass sie einzelne Zellen detektieren und somit diese Kolonie-Pinning-Assays nicht direkt die Verzögerungszeit beobachten und die Variation zwischen den einzelnen Zellen, die in Kolonien wachsen, nicht beobachten können. Flüssigbasierte Wachstumstests wurden auch zur Durchführung von genomweiten Schirmen eingesetzt 3 . Die Kopplung eines Liquidwachstums-Assays mit der Zeitraffer-Mikroskopie zeigte die Heterogenität der Population in der Verdopplungszeit genetisch identischer Einzelzellen, die eine wichtige Perspektive für das Verständnis der genetischen Regulation und der Umweltanpassung bietet. Dieser Assay misst jedoch nicht andere Aspekte des Wachstums wie Verzögerungszeit und Tragfähigkeit 10 . Hier stellen wir eine Methode vor, um alle drei Wachstumsphasen von koloniebildenden Mikroorganismen auf festen Medien unter Verwendung eines Assays zu charakterisieren, den wir ODELAY 11 bezeichnen . ODELAY besteht aus utiliZing hohe Durchlauf-Zeitraffer-Mikroskopie zur Aufzeichnung von Bildern von einzelnen Zellen, die in Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Population einzelner Zellen, die in Kolonien wachsen, zeigt die zugrundeliegende Heterogenität der Bevölkerung, die von anderen weniger empfindlichen Messungen, wie z. B. terminaler Endpunkt-Scoring, nicht erkannt wird. Wir zeigen die Methode auf Hefe, aber ODELAY kann auf jeden Organismus angewendet werden, der Kontrast in der Hellfeldmikroskopie zeigt.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

Wachstums-Phänotypen von Mikroorganismen sind ein starker Indikator für ihre zugrunde liegende genetische Fitness und können in 3 Wachstumsregimes getrennt werden: Lag-Phase, Log-Phase und stationäre Phase. Jede Wachstumsphase kann verschiedene Aspekte der Fitness zeigen, die mit verschiedenen ökologischen und genetischen Bedingungen zusammenhängen. Hochauflösende und quantitative Messungen aller 3 Phasen des Wachstums sind in der Regel schwer zu erreichen. Hier präsentieren wir eine detaillierte Methode zur Charakterisierung aller 3 Wachstumsphasen auf festen Medien mit einem Assay namens One-Cell Doubling Evaluation von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY). ODELAY quantifiziert die Wachstumsphänotypen einzelner Zellen, die unter Verwendung von Zeitraffer-Mikroskopie zu Kolonien auf festen Medien wachsen. Diese Methode kann die Heterogenität der Population mit jedem Wachstumsparameter in genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, direkt beobachten. Diese Heterogenität der Bevölkerung bietet eine einzigartige Perspektive für das Verständnis der genetischen und epigenetischen Regulierung und der Reaktionen aufGenetische und umweltbedingte Störungen. Während die ODELAY-Methode unter Verwendung von Hefe demonstriert wird, kann sie auf jedem koloniebildenden Mikroorganismus verwendet werden, der durch eine helle Feldmikroskopie sichtbar ist.

<html> Beispielbilder von Hefe, die in der Zeitraffer-Mikroskopie wachsen, sind in Fig. 3B gezeigt . Nach der Verarbeitung der Zeitrafferbilder ist ein repräsentativer Datensatz, der die Hefestämme BY4741 &amp; BY4742 vergleicht, in Fig. 4 gezeigt . In diesem Beispiel-Datensatz gibt es sehr wenig Abweichung in der Verdopplungszeit zwischen verschiedenen Positionen auf der Platte. Wenn das Agarosemedium schlecht vorbereitet wird, dann wäre eine offensichtliche Abweichung sowohl bei der Verdopplungszeit als auch bei der Verzögerungszeit in den Fleckpositionen offensichtlich, die mit dem deformierten Bereich des Agarosegels übereinstimmen. Während die Verdopplungszeiten relativ gleichmäßig erscheinen, zeigt dieses Beispiel Variationen der Verzögerungszeitmessungen. Ein konsistenterer Datensatz ist in Abbildung 6 dargestellt . In diesem Datensatz sind sowohl Verzögerungszeit als auch Verdopplungszeit einheitlich. Dateien / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Agar Mould Assembly. Die Komponenten der Agarform sind in ( A ) dargestellt. Montieren Sie den Sockel wie in ( B ) gezeigt und klemmen Sie den Sockel mit kleinen Binderclips. Legen Sie die längeren Ständer in den Hohlraum der Basis ( C ) und legen Sie dann die Schieber wie in ( D ) gezeigt in die Form. Eine Seitenansicht, die den Winkel der Form und die Ausrichtung des Formkörpers zeigt, der für eine gleichmäßige Trennung des Agars von dem Glasschieber ( E ) benötigt wird. Beachten Sie die Position des Daumens und der Zeigefinger sowie die Gerade des Agars, die sich von der Folie ( F ) trennt, und notieren Sie den horizontalen Pfeil. Die Trennlinie sollte sich gleichmäßig in Richtung der vertikalen Pfeile bewegen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> = &quot;Jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> Abbildung 2: Sonication and Spotting Methode. Sonden Sie die Platte in Eiswasser und verwenden Sie einen Zentrifugen-Eimerhalter, um die Platte ( A ) zu unterstützen. Legen Sie die Platten aus den Schritten 3.8.1 für das Aufsprühen auf die Agaroseplatte ( B ). Auch die Spitzen so anordnen, dass die linke meisten Kasten eine Spitze an Position C10 hat und dann vier andere Spitzen mit ihren Enden abgeschnitten, also stoßen sie nicht den Plattenhalter ( C ) an. Legen Sie die restlichen Spitzen in vier Boxen, so dass die inneren 24 Spitzenpositionen besetzt sind ( D ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: ODELAY Grafische Benutzeroberfläche. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). Diese Schnittstelle ermöglicht die Überwachung der Kamera und die Einstellung der Mikroskop-Beleuchtungseinstellungen für Epifluoreszenz- und Hellfeldmodi. Rote Pfeile zeigen auf die Focus- und Transmit-Tasten, die die Kamera aktivieren, um Bilder schnell zu erfassen und den Durchlicht-Shutter zu öffnen. Blaue Pfeile werden verwendet, um die Bühne für den Ursprung zu bewegen und dann den Ursprung mit der Taste &quot;Go Origin&quot; und &quot;Set&quot; zu setzen. Grüne Pfeile zeigen auf &quot;Reset&quot; und &quot;ODELAY !!!&quot; Tasten, die ODELAY-Bildmodi auf die aktuellen Bedingungen zurücksetzen und die ODELAY-Bildsammlung initiiert. Zeitraffer Bilder von Hefe, die auf festem Medium bei 0, 3, 6 und 9 h nach dem Spotting ( B ) wachsen. Ein Screenshot der grafischen Benutzeroberfläche für &quot;ODELAY_IPT.m&quot; oder th<html> E ODELAY Bildverarbeitungswerkzeug ( C ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> Abbildung 4: Beispiel ODELAY Ausgang. Dieser Datensatz vergleicht die Stämme BY4741 und BY4742 auf YPD-Medien. Diese Figur ist ein Beispiel für eine gut vorbereitete Agarose-Folie; Autofokuseinstellungen sind jedoch nicht optimal. Die Daten, die in jeder Spalte von links nach rechts dargestellt werden, sind: die Tragfähigkeit in Log 2 des Kolonienbereichs; Verdopplungszeit, gegeben in min; Und Verzögerungszeit, gegeben in min. In diesem Beispiel verdoppeln sich die Verdopplungszeiten aller Flecken auf der Agar-Folie gut mit einer kleinen Menge an erhöhter Verdopplungszeit in Richtung der Säule. Allerdings variieren die Lagzeiten in diesem Datensatz erheblich._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> Abbildung 5: Growth Curve Beispiele. Dieses Beispiel zeigt, wie ein schlechter Anfangsfokus die geschätzte Verzögerungszeit (t lag ) erhöhen kann ( A ), während die angrenzende Position eine kürzere Verzögerungszeit ( B ) aufweist. T d ist die Verdopplungszeit in min und t lag die Verzögerungszeit in min. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> Abbildung 6: Beispiel für gut durchgeführte Testversuche. Ein eBeispiel des BY4742-Stammes, der nach dem Austausch einer Wolfram-Halogenbirne mit einem Dioden-Illuminator getestet wurde und sichergestellt wurde, dass der Autofokus korrekt eingestellt ist. Alle verdoppelnden Zeiten scheinen sich gut zu überlappen, und die Verzögerungszeiten scheinen konsistent zu sein. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden.

ODELAY: Eine groß angelegte Methode für die Mehrparameter-Quantifizierung des Hefewachstums

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

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Research

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Biology

8.1K Aufrufe.  Institute for Systems Biology.  Wir stellen eine Methode zur Quantifizierung von Wachstumsphänotypen einzelner Hefezellen dar, da sie in festen Medien unter Verwendung der Zeitraffer-Mikroskopie in Kolonien aufwachsen, die als eine zellige Verdopplungsbewertung von lebenden Arrays von Hefe (ODELAY) bezeichnet werden. Die Populations-Heterogenität von genetisch identischen Zellen, die zu Kolonien wachsen, kann direkt beobachtet und quantifiziert werden. 

Serie: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae Beschriftung mit 4-Thiouracil und Quantifizierung der metabolischen synthetisiert neu mRNA als Proxy für RNA-Polymerase II Aktivität

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

Forschung

Genetik

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

Die Quantifizierung der Hefe Chronologisches Life Span durch Auswachsen von gealterten Zellen

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

Biologie

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

Mess-replikative Lebensspanne in der Hefe

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

Analyse des Lipidtröpfchengehalts in Spalt- und Budding-Hefen mittels automatisierter Bildverarbeitung

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

Immunologie und Infektion

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Zeitliche Quantifizierung der MAPK induzierte Expression in Einzel-Hefezellen

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Reporter-basierten Wachstumstest für die systematische Analyse von Proteinabbau

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Growth-basierte Bestimmung und biochemische Bestätigung der genetischen Voraussetzungen für Proteinabbau in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

Präzise, Hochdurchsatz-Analyse des Bakterienwachstums

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...