אנו מודים יה זאנג לעזרה עם עקבות מדגם ופח קי Tsang לעזרה עם התמונות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן תומכת קרן ריי אדוארדס מוקדם קריירה מענק NIH (R01DC015519) כדי C-YS ומענקים NIH (R01DC009597 ו R01DK092640) כדי JWW

1. הכנת החומרה עבור הקלטה 4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בכלי פיפטה מושך להכין אלקטרודות עם נימי זכוכית aluminosilicate (OD 1.0 מ&quot;מ, 0.64 מ&quot;מ מזהה). Blunt קצה האלקטרודה התייחסות מעט עם זוג מלקחיים בסדר כדי להקל על הכניסה לתוך clypeus של זבוב ( כלומר צלחת מעוגלת בחלק הקדמי של הראש לטוס, מעל הפה). הערה: במחקר השתתפו 7 גברים בני 7 ימים (WT). השתמש תמיסת מלח AHL 14 כמו אלקטרוליט עבור שתי האלקטרודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 L של AHL על ידי ערבוב 900 מ&quot;ל של מים מזוקקים עם 6.312 גרם של NaCl, 0.373 גרם של KCl, 0.337 גרם של NaHCO 3 , 0.1120 גרם NaH 2 PO 4 , 1.892 גרם של Trehalose 2 2 H 2 O, 3.423 גרם של סוכרוז, 1.192 גרם של HEPES, ו 8.2 מ&quot;ל של 1M MgCl 2 . באמצעות מים מזוקקים, להביא את עוצמת הקול הכולל עד 1 L. תביא את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ו לעקר את הפתרון עםמסנן ואקום מערכת מסנן. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על aliquots AHL ב 4 ° C. הערה: אספקה ​​עקבית של חומצה palmitoleic מותנים אחידות בין מחסניות. זה קריטי כי כל מחסנית הוא התאספו באופן לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, להסיר 0.9 ס&quot;מ מקצה פיפטה 200 μL μ כדי ליצור את החלק הראשון מחסנית, מדידה 4.1 ס&quot;מ; עיין בממדים המפורטים בתרשים 1 א . השתמש אחר 200 פיפטה μL להסיר ולהסיר 1.7 ס&quot;מ ו 1.5 ס&quot;מ מהקצה ואת הבסיס, בהתאמה, כדי ליצור את המחסנית השנייה בסעיף, מדידה 1.8 ס&quot;מ ( איור 1 א ). השתמש בסרגל כדי להבטיח שחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ⅛ &quot;אגרוף חור לחתוך דיסקים מסנן נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי להציב דיסק נייר סינון בקצה החלק השני של המחסנית. יש לאשר באופן חזותי כי יש פתח בקצה המחסנית שדרכו האוויר יכול לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את חלקי המחסנית הראשונה והשנייה יחד, כפי שמוצג באיור 1 א . זווית החלק מחסנית השנייה כלפי מטה כדי להקל על כיכר מכוון הכנה ( איור 1 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחסנית עם צינור ריח משלוח, אשר מותקן על micromanipulator. הערה: תכנון זה מאפשר למחסנית להיות מסובב החוצה כדי להקל על חילופי ( איור 1 ג ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את זרימת האוויר humidified קבוע ל 2 L / min בבקר אחד המוניים ואת זרימת אודורנט ל 500 מ&quot;ל / דקה בבקר המוני אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות התוכנה (ראה טבלה של חומרים ), תוכנית ההליך לנהל 500 מ&quot;ל ריח הריח. </li></ol> 2. הכנת פתרונות חומצה Palmitoleic חומצה עבור משלוח הערה: ORNs מגיבים הן לחומצה cis והן לחומצה טרנס- פאלמטולית. כמו חומצה palmitoleic אינו יציב ב RT, מניות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס, ומשמשים בתוך חודש לאחר הפתיחה. אתנול הוא ממס של בחירה עבור חומצה palmitoleic. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיקסר מערבולת לערבב ביסודיות 10 μL של cis- או טרנס מניות חומצה palmitoleic או דילולים עם 90 μL של 100% אתנול עבור דילולים סדרתי של פי עשרה 1.7 microtubes מ&quot;ל. הכן דילולים חומצה palmitoleic טריים מדי יום לפני ניסויים ושימוש בתוך יום. הערה: עבור odorants שאינם מסיסים באתנול, בקבוקון זכוכית מומלץ להכנת דילולים ריח עם סוגים אחרים של ממיסים אורגניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות micropipette P10, להחיל 5 μL של פתרונות חומצה CIS -palmitoleic של דילולים הרצוי על נייר הסינון בכל מחסנית המתאימה. הערה: המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל 450 מיקרוגרם של המתחם. עבור פתרונות חומצה טרנס- חומצתית, יש ליישם 4.5 μL במקום כך המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל גם 450 מיקרוגרם של tהוא מורכב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגמרי להתאדות הממס, במקום מחסניות חומצה palmitoleic ב desiccator ואקום עבור 1 שעה ב RT ו 7.59 mmHg של לחץ. הערה: ניתן להשתמש במחסניות עד 4 שעות ב - RT. </li></ol> 3. הכנת תסיסנית עבור גישה מוכנה AT4 Sensilla עבור הקלטות אלקטרו vivo הערה: זבובים WT (ברלין) הם גידלו בינוני תירס רגיל ב 25 מעלות צלזיוס במחזור כהה 12:12. עם זאת, הזבובים מופרדים במין לקבוצות של עשרה, לפיו הם שוכנים עד גיל 7. Or47s ב זבובים זכר ונקבות להגיב חומצה palmitoleic. לפשטות, רק זבובים גברים נבדקים במחקר הנוכחי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שקופית זבוב הכנה: על שקופית זכוכית, במקום coverslip זכוכית (18 x 18 מ&quot;מ 2 ) על כמות קטנה של חימר דוגמנות, להרכיב זווית 3 ° ~ עם שקופיות הזכוכית. מקם קלטת דו צדדית על הקצה הפנימיDge של coverslip ועל השטח של השקופית מיד מתחת. החלף עם סרט חדש עבור כל יום של הקלטה ( איור 2 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש aspirator לטוס 15 כדי לאסוף את זבוב עניין צינורות ולאחר מכן להתאים קצה פיפטה 200 μL מעל סוף הצינור. בו זמנית מזנק את הצינור קדימה תוך נושבת אוויר לתוך הצינור לדחוף את הזבוב עד קצה קצה פיפטה. השתמש בסכין גילוח לחתוך ממש מתחת לגוף של זבוב 2 אורכים ראשי מעל לטוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טמפ את החלק התחתון של קצה פיפטה עם חימר דוגמנות, דוחפים את הזבוב כלפי מעלה עד שתי האנטנות ואת clypeus נחשפים ( איור 2 ב ). כדי למנוע להרוג את הזבוב, להוסיף רק מספיק חומר כדי לחשוף את האנטנות ואת aristae, כמו זה מונע את הבטן של הזבוב מלהיות מרוסק. יתר על כן, להוסיף טיט לאט בעדינות כדי למנוע כל התכווצות פתאומית. ודא כי הוא זבוב חי על ידי בדיקת antennalאו תנועת חוטם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מלקחיים לתמרן את קצה פיפטה כי הבתים זבוב. אוריינט את הראש כך clypeus פונה ימינה של הצופה. התאם את הכנה לאורך coverslip באמצעות מלקחיים בסדר עד הצד הצדדי של האנטנה מונח על משטח coverslip מוקלט ( איור 2 ב ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מוט אחיזה על arista כדי לאבטח את האנטנה לקלטת דו צדדית כדי למנוע תנועה ( איור 2 ב ). הערה: מוט ההחזקה הוא משך זכוכית borosilicate נימי עם משיכה פיפטה והחזיק במיקום עם חימר דוגמנות ( איור 2 א ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכנה על הבמה של המתקן ( איור 2 ג ). באמצעות המיקרוסקופ, ודא כי הטריכוידים נראים לאורך קצה דיסטלי לרוחב של החלק השלישי של האנטנה. הערה: באופן אידיאלי, את sensilla צריך להיות ברור צללית על רקע, אשר מפשט שלהם<html> זיהוי ומקלה הקלטה ( איור 3 ). בהכנה זו, רוב הטריכואיד הטריכואיד הנגיש הם מסוג AT4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על הכנה תחת זרימת אוויר humidified קבוע (2 L / min) נמסר דרך צינור אספקת אוויר נפרד ממרחק של כ 2 ס&quot;מ מן הכנה ( איור 4 ), כמתואר בעבר 2 , 15 . </li></ol> 4. הקלטה של ​​פעילות סנסילום ב 4 ORNs ORNs ב 4 Trichoids בתגובה חומצה Palmitoleic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את האלקטרודה התייחסות לתוך clypeus ( איור 3 א ). כדי למנוע נזק לרקמות, ודא כי האלקטרודה מוכנס ממש מתחת לפני השטח, שם הוא יכול ליצור קשר עם hemolymph תחת לציפורן, עם תנועה מהירה וחלק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנמיך את האלקטרודה ההקלטה לאט לאט זה נכנס למישור זהה של נוף כמו sensillum היעד (= &quot;Xfig&quot;&gt; איור 3 ב). שיא תחת עדשה אובייקטיבית 50X. הערה: לציפורן trichoidal קשה מחייב הכנסת אלקטרודה ההקלטה לבסיס sensillar, אשר אזור רחב יותר מספק יעד גדול יותר אשר מקטין את הסבירות כי האלקטרודה הוא הסיר משם ( איור 3 ב , inset). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החלת גירויים ריח על סנסילום, לבחון את הקריטריונים הבאים הבחירה; כל טריכאיד לא עומד בסטנדרטים אלה צריך להידחות סנסילום אחר נבחר במקום. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב יחס אות לרעש גבוה (ראה איור 3 ג לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון קוצים מזוהים מ ב 4A ו נוירונים ב 4C ( איור 3 ג ). הערה: הערה, משרעת ספייק ב 4B נראה דומה מאוד ב 4A 10 ולא ניתן לזהות בקלות ללא גירוי ריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימו לב כי קצב הירי הבסיסי של נוירונים ב 4A הואסביב או מתחת 20 הרץ. הערה: קריטריון זה הוא ספציפי עבור at4A כי קצב הירי הבסיסי עבור הנוירון הוא גבוה יותר מזה של ORNs בסיסי 2 . ירי ביזי גבוה הרבה יותר מציין כי הנוירונים ייתכן שנפגעו במהלך הכניסה אלקטרודה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המחסנית לצינור אספקת האדים. התחל עם שליטה ממס ואז את odorants, מ נמוך עד ריכוז גבוה. השתמש micromanipulator לתמרן את המחסנית לקראת הכנה תוך מכוון את המחסנית ישירות בראש הכנה. ודא כי המחסנית מכוונת ישירות לאנטנה ( איור 4 ) ממרחק של מילימטרים ספורים. הערה: המטרה היא לכוון את פתיחת המחסנית ישירות לאנטנה ולמקם אותה בקרבת רקמת היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי מחסנית odorant מופרד האלקטרודה ההקלטה בצד ימין שלה על ידי 1 - 2 מ&quot;מ ו מן לטוס מראשP שקופית מתחת כ 1 מ&quot;מ. הערה: בהתקנה המתוארת כאן, מחסנית אודורנט הוא גובל מקרוב על ידי האלקטרודה הקלטה, האלקטרודה התייחסות, ואת זבוב הכנה זבוב ( איור 4 ). הערה: שימו לב למרחק שבין המחסנית לבין האלקטרודות של ההקלטה / הפניה. במרחק של כ 4 מ&quot;מ מומלץ 1. מגע לא מכוון עלול לסיים את האות ולשבור את קצה האלקטרודה הקלטה, פגיעה נוירון הנוכחי מסובך הקלטות נוספות. הערה: שקול את המרחק המפריד בין המחסנית לבין השקופית הזזה. נגיעה coverslip עשוי גם לבטל את האלקטרודה הקלטה כדי לשבש את ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;שיא&quot; בתוכנה רכישת נתונים כדי להתחיל את ההקלטה. הערה: עבור כל הקלטה של ​​10 שניות, דופק יחיד של 500 מילישניות מועבר ישירות לאנטנה, כמתואר בשלב 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר יישום אודורנט,הסר בזהירות את המחסנית לפני החלפתה במחסנית של הריכוז הבא הגבוה ביותר. המשך עד לקבלת טווח המינון כולו. הערה: מומלץ כי רק ORN אחד OR47b נרשם מכל זבוב, כדי למנוע כל ההשפעות האפשריות של הסתגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשטוף את האלקטרודה הקלטה עם מים מזוקקים לאחר סיום הקלטה עבור היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח זמין באופן לא מקוון זמין מסחרית. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems.">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li><li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila.">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila.">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li><li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons.">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li><li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein.">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li><li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins.">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).</li><li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila.">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li><li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids.">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li><li>Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+back+or+front:+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males.">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li><li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila.">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, תיארנו הליך שבו תשובות של ORNs ORNs לחומצה palmitoleic יכול להיות המושרה בחוזקה נרשמה. שינינו שיטת קונבנציונאלי ארוכת טווח משלוח ריח 2 , 7 , 10 כדי לפתור את הבעיה של משלוח pheromone מספיק odorant. התייחסנו לסוגיית התנודתיות הזעירה ע?...

<html> תסיסנית ORNs מגיבים למספר עצום של odorants, עם מגוון רחב של שרשרת פחמן אורכים מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות, כולל אסטרים, אלכוהול, קטונים, lactones, aldehydes, terpenes, חומצות אורגניות, אמינים, תרכובות גופרית, heterocyclics, ארומטיים 2 , 3 . ריחנים שונים התכונות הפיסיקוכימיות שלהם יכול להיות שונים volatilities שונים, המצוין על ידי לחץ אדי של המתחם. יש לציין כי ריחות ביולוגיים רלוונטיים עבור תסיסנית melanogaster שונים מאוד בתנודתיות שלהם. לדוגמה, Ir92a ORNs מגיבים לאמוניה 4 , שהיא תנודתית מאוד, עם לחץ אדי של 6,432 מ&quot;מ כספית ב 20 ° C. לעומת זאת, OR67d ORNs מגיבים על פרומון זכר, cis- acenate אצטט ( c VA) 5 , 6 , לחץ אדים של אשר 43 מ&quot;מ כספית ב 20 ° C. &quot;Ove_content&quot;&gt; בדיקת תגובת הריח ל odorants של תנודתיות נמוכה היא מאתגרת במיוחד עם שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח, שבו odorants מועברים באמצעות זרם האוויר המוביל על מרחק ארוך יחסית ( כלומר כמה סנטימטרים ).ככזה, דיווחים חוש הריח דיווח אל odorant נמוך התנודתיות נתונה יכול להשתנות במידה רבה, בהתאם לעיצוב של המערכת-המסירה ריח לדוגמא, התגובה המדווחת של Or67d ORNs למינון גבוה של ג VA נע בין ~ 40 7 -.&gt; 200 קוצים / s 6 . יתר על כן, המשלוח היעיל של VA ג עם שיטות משלוח קונבנציונליות מיוחס צפוי תוצאות false-negative, מוביל לפרשנות כי ג VA כשלעצמו אינו מספיק כדי להפעיל Or67d ORNs 8. פרשנות זו נתערערה מאוחר יותר על ידי מחקר אחר באמצעות לטווח קצר שיטת הריח משלוח 9. זה אימפרה ולכןTive לפתח מערכת ריח ריאה חזקה להצגת יעיל של odorants של תנודתיות נמוכה. לאחרונה, זיהינו כמה שרשרת ארוכה של חומצות שומן קורטיקולרי כמו ligands עבור OR47s ORNs. הם שוכנו סוג 4 Antennal Trichoid Sensillum (ב 4). בין שרשרת ארוכה של חומצות ריח odorants, מצאנו כי חומצה palmitoleic פונקציות כמו fheromone אפרודיזיאק כי מקדם החיזור הגברי על ידי הפעלת OR47b ORNs 1 . עם זאת, במחקר אחר המשתמש בשיטה של ​​מתן ריחות קונבנציונאלי, מתיל לוראטי הוצג כדי לעורר תגובות של ORNs OR47, בעוד חומצה palmitoleic עורר שום תגובה כאשר הוצגו מאותו המרחק 10 . בהשוואה ג VA, חומצות שומן ארוכות-שרשרת הן אפילו פחות תנודתי, עם לחצים אדי פחות מ 0.001 מ&quot;מ כספית על 25 מעלות צלזיוס 11. התנודתיות הנמוכה מטבען של ריחות חומצות שומן ארוכות שרשרת, המונעת הצגה יעילה לאנטנה דרךקונבנציונאלי משלוח מערכות ריח, סביר להניח את התוצאות שליליות שווא 10 . חוסר עקביות זה מדגיש את חוסר הקליטה של ​​מערכות ריחות קונבנציונאליים בהצגת ריחות נדיפים. הוכח בעבר כי המסירה האפקטיבית של ריחות זבוביים טסים דורשת קרבה בין מקור הריח לבין רקמת היעד 6 . לכן, כדי לאפיין באופן מלא את ההשפעות של pheromones פעיל ביולוגית תוך מחקה את המרחק שבו הם עשויים להיתקל על ידי זבובי פירות בטבע 12 , 13 , הסכמנו כי המרחק המינימלי חייב להיות נתון בעדיפות גבוהה בהליך שלנו. השיטה שלנו מחזיקה יתרונות נוספים, כולל תאימות עם סטנדרטי electrophysiology טכניקות. קיימים מראש setups סטנדרטי דורשים שינוי מינימלי כדי להתאים את הפרוטוקול הזה, ואת רוב הצעדים SSR דורשים רק התאמות קלות. זֶההופך את הטכניקה שלנו נגיש לחוקרים מנוסים SSR. יתר על כן, הטכניקה שלנו מאפשרת הצגה של odorants בתזוזות נמוכה עם התחלה חדה וקיזוז, מתאם מתן תמריצים עם התגובה העצבית. לבסוף, פריסת החומרה מאפשרת חילופי מהיר בין מחסניות odorant, המאיץ איסוף נתונים על פני טווח המינון הרצוי. אנו מתחילים על ידי סקירת הכנת הפניה אלקטרודות הקלטה, תמיסת Hemolymph-Adult למבוגרים (AHL) פתרון, מחסניות משלוח אודורנט, ואת olfactometer המקביל. לאחר מכן אנו דנים בהכנה של פתרונות חומצה palmitoleic odorant, ואחריו הכנת זבוב להקליט. אנו ממשיכים לשקול את הקריטריונים לבחירת סנסילום טריכואיד כדי להקליט ולבחון מקרוב את המיקום של מחסנית אודורנט לפני הצגת נתונים נציג רכשה באמצעות שיטה זו. לבסוף, אנו מסיקים על ידי בחינת יישומים שימושיים של techniq זהאו, כמה נתקלו בבעיות, ואת הפתרונות שלהם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

חרקים מסתמכים על חוש הריח שלהם כדי להנחות מגוון רחב של התנהגויות קריטי להישרדות שלהם, כגון חיפוש מזון, הימנעות טורף, oviposition, והזדווגות. כימיקלים רבים של תנודות משתנות זוהו כמו ריחות טבעיים המפעילים חרק חוש הריח נוירונים קולטן (ORNs). עם זאת, לימוד תגובות חוש הריח כדי odorants התנודתיות נמוכה כבר הקשו על ידי חוסר היכולת להציג ביעילות גירויים כאלה באמצעות שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח. כאן, אנו מתארים הליך המאפשר את ההצגה האפקטיבית של odorants נמוך התנודות עבור vivo יחיד Sensillum הקלטה (SSR). על ידי מזעור המרחק בין מקור הריח לבין רקמת המטרה, שיטה זו מאפשרת יישום של ריחות ביולוגיים בולטים אך לא נגישים עד כה, כולל חומצה palmitoleic, פרומון גירוי עם אפקט הפגינו על ORNs המעורבים חיזור התנהגות ההזדווגות 1 .ההליך שלנו ובכך מציע שדרה חדשה assay שורה של ריח odorants נמוכה לחקר olfaction חרקים תקשורת pheromone.

הטכניקה שלנו יושמה בהצלחה כדי לקבוע את היעילות היחסית של טרנס ( איור 5 א ) לעומת CIS ( איור 5 ב ) איזומרים של חומצה palmitoleic. הנתונים הייצוגיים שלנו מדגימים כי חומצה טרנס- פאלמיטולית היא ליגנד יעיל יותר עבור ORNs ...

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility at JoVE.com

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת.

הקלטה אלקטרופיזיולוגית מ<em&gt; תסיסנית</em&gt; Trichoid Sensilla בתגובה ריחות של תנודתיות נמוכה

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K Views.  University of California San Diego.  המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Assaying פעילות של תנועה כדי ללמוד בקצב היממה ושינה פרמטרים תסיסנית</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

הקלטה בו זמנית של אותות סידן מתא עצב לזהות התנהגות האכלה של תסיסנית melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Assay בחירה האנכי T-מבוך לתגובת פרוקי רגליים לodorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

סימולטני טרום והקלטת אלקטרו פוסט סינפטי מ<em&gt; Xenopus</em&gt; עצבי שרירי Co-תרבויות

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ומייקרו-הזרקות של סוכנים מעכבים במוח מכרסם

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

שיטת אלקטרו עבור תגובות מתח תאיים הקלטה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; קולטני אור ו interneurons יאירו גירויים<em&gt; In vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.