사진과 함께 도움을 주신 샘플 Trace와 Tin Ki Tsang의 도움으로 Ye Zhang에게 감사드립니다. 이 작품은 Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award와 C.-YS 및 NIH 교부금 (R01DC009597 및 R01DK092640)에 대한 NIH 교부금 (R01DC015519)에 의해 JWW에 지원되었습니다.

1. at4 녹음을위한 하드웨어 준비 <ol><li> 피펫 끌어 당기 도구를 사용하여 알루미 노 규산염 유리 모 세관 (OD 1.0 mm, ID 0.64 mm)으로 전극을 준비하십시오. 비행의 clypeus에 삽입을 용이하게하기 위해 미세한 포셉 한 쌍으로 참조 전극의 끝을 약간 뭉게하십시오 ( 즉 , 머리 부분 앞쪽의 둥근 접시). 참고 : 7 일된 WT 남성 (베를린)이이 연구에 사용되었습니다. 두 전극의 전해액으로 AHL 식염수 용액 14 를 사용하십시오. </li><li> 염화나트륨 6.312 g,의 KCl 0.373 g,의 NaHCO3 0.337 g에 증류수 900 mL를 혼합하여 AHL 1 L을 준비에 NaH 2 PO 4, 트레할로스 ּ 2 H 2 O의 1.892 g의 0.1120 g, 수 크로즈 3.423 g, 1.192 g의 HEPES 및 1M의 MgCl 2 mL의 8.2. 증류수를 사용하여 1L까지 총 부피를 가져온다. 1N NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 가져 와서 용액을 멸균한다.진공 구동 필터 시스템. 장기간 보관하려면 AHL 분취 량을 4 ° C로 유지하십시오. 참고 : palmitoleic acid의 일관된 전달은 카트리지 간의 균일성에 달려 있습니다. 각 카트리지가 재현 가능한 방식으로 조립되는 것이 중요합니다. </li><li> 면도날을 사용하여 200 μL 피펫 팁 끝에서 0.9 cm를 제거하여 4.1 cm 크기의 첫 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 그림 1A에 설명 된 치수를 참조하십시오. 다른 200 μL 피펫 팁을 사용하여 팁과베이스에서 각각 1.7 cm와 1.5 cm를 제거하여 1.8 cm ( 그림 1A ) 인 두 번째 카트리지 섹션을 만듭니다. 자를 사용하여 재현성을 보장하십시오. </li><li> 여과지에서 디스크를 자르려면 1/8 &quot;구멍 펀치를 사용하십시오. </li><li> 집게를 사용하여 두 번째 카트리지 섹션의 끝 부분에 여과지 디스크를 놓습니다. 공기가 통과 할 수있는 카트리지 팁에 구멍이 있는지 육안으로 확인하십시오. </li><li> 그림 1A 와 같이 첫 번째 및 두 번째 카트리지 섹션을 함께 부착하십시오. 두 번째 카트리지 섹션을 아래쪽으로 기울여 사분면에서의 조준을 용이하게하십시오 ( 그림 1B ). </li><li> micromanipulator에 장착되어있는 악취 전달 튜브와 카트리지를 연결하십시오. 참고 :이 디자인은 교환을 용이하게하기 위해 카트리지를 바깥쪽으로 회전시킬 수 있습니다 ( 그림 1C ). </li><li> 하나의 질량 제어기에서 일정한 가습 공기 흐름을 2 L / min으로 설정하고 다른 질량 제어기에서 냄새 물질 흐름을 500 mL / min으로 흐르게하십시오. </li><li> 소프트웨어를 사용하여 ( 재료 표 참조) 500 ms 냄새 퍼프를 관리하는 절차를 프로그래밍하십시오. </li></ol> 2. 배달을위한 팔 미트 톨 산성 악취 용액의 제조 참고 : Or47b ORN은 cis- 와 trans -palmitoleic acid 모두에 반응합니다. palmitoleic acid가 R에서 불안정하기 때문에T는 -20 ° C에서 저장되며 개봉시 한 달 이내에 사용됩니다. 에탄올은 팔미 톨 렌산의 용매로 사용됩니다. <ol><li> 소용돌이 믹서를 사용하여 10 mL의 시스 또는 트랜스 팔미 톨레산 저장 액 또는 희석액을 1.7 mL 미세 튜브에서 10 배 연속 희석 용 100 μL의 에탄올 90 μL와 완전히 혼합하십시오. 매일 실험 및 사용하기 전에 신선한 palmitoleic 산 희석물을 준비합니다. 참고 : 에탄올에 녹지 않는 냄새 물질의 경우 다른 유형의 유기 용제와 함께 냄새 희석액을 준비 할 때 유리 병을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> P10 마이크로 피펫을 사용하여 원하는 희석액의 cis -palmitoleic acid 용액 5 μL를 해당 카트리지의 여과지에 바릅니다. 참고 : 가장 높은 용량 (10 -1 )에는 450 μg의 화합물이 들어 있습니다. trans -palmitoleic acid 용액의 경우, 4.5μL을 대신 사용하여 가장 높은 용량 (10 -1 )에 450μg의 t그는 화합물. </li><li> 용매를 완전히 증발 시키려면 palmitoleic acid 카트리지를 RT와 7.59 mmHg에서 1 시간 동안 진공 데시 케이 터에 넣으십시오. 참고 : 카트리지는 RT에서 최대 4 시간 동안 사용할 수 있습니다. </li></ol> 3. 생체 전기 생리 학적 녹음을위한 at4 Sensilla에 즉시 접근하기위한 Drosophila 의 준비 참고 : WT 파리 (베를린)는 표준 번식 매질에서 25 ° C로 12:12의 명암주기에서 양육됩니다. eclosion시, 파리는 10 개의 그룹으로 성별로 구분되며, 따라서 그룹은 7d 시대까지 그룹으로 수용됩니다. 암컷과 수컷 모두에서 or47b ORN이 팔미 톨 레산에 반응한다. 단순화를 위해, 현재의 연구에서 수컷 파리 만 시험 하였다. <ol><li> 플라이 준비 슬라이드 조립 : 유리 슬라이드에서 유리 슬라이드에 ~ 3 °의 각을 형성하는 소량의 모델링 점토에 유리 커버 슬립 (18 x 18mm 2 )을 놓습니다. 내부 E에 양면 테이프 놓기coverslip의 dge와 바로 아래 슬라이드의 영역에. 매일 녹음 할 때마다 새 테이프로 교체하십시오 ( 그림 2A ). </li><li> 플라이 aspirator 15 를 사용하여 튜빙에서 관심있는 파리를 수집 한 다음 튜빙 끝에 200 μL 피펫 팁을 장착하십시오. 동시에 피펫 팁의 끝 부분에 파리를 밀어 튜브에 공기를 불어 넣은 채로 튜브를 앞으로 내리십시오. 면도날을 사용하여 파리의 몸 바로 아래와 2 개의 머리 길이를 날아서 자릅니다. </li><li> 안테나와 clypeus가 노출 될 때까지 파리를 밀어 올리면서 모델링 점토로 피펫 팁의 바닥을 감싸줍니다 ( 그림 2B ). 파리를 죽이는 것을 피하려면 파리와 복부가 노출되지 않도록 찰흙을 충분히 넣으십시오. 파리의 복부가 부서지는 것을 막을 수 있습니다. 또한 점토를 천천히 부드럽게 넣어 급격한 수축을 예방하십시오. 안테나가 있는지 확인하여 파리가 살아 있는지 확인하십시오.또는 코 움직임. </li><li> 플라이가 들어있는 피펫 팁을 움직이려면 집게를 사용하십시오. clypeus가 관찰자의 오른쪽을 향하도록 머리를 배향하십시오. 안테나의 측면이 테이프로 덮여 coverslip 표면 ( 그림 2B )에 대한 거짓말 때까지 미세한 집게를 사용하여 coverslip 함께 준비를 조정합니다. </li><li> 이동을 방지하기 위해 안테나를 양면 테이프에 고정시키는 고정대 위에 고정 막대를 놓습니다 ( 그림 2B ). 참고 : 지주 막대는 피펫 풀러가있는 붕 규산염 유리 모세관에서 끌어 당겨 모델링 점토로 고정됩니다 ( 그림 2A ). </li><li> 리그의 스테이지에 prep을 놓으십시오 ( 그림 2C ). 현미경을 사용하여, trichoids는 안테나의 세 번째 세그먼트의 말초 측면 가장자리를 따라 볼 수 있는지 확인합니다. 참고 : 이상적으로, sensilla는 배경에 대해 명확하게 윤곽을 그리게되어,<html> 식별 및 녹음을 용이하게합니다 ( 그림 3 ). 이 준비에서 접근 가능한 trichoid sensilla의 대부분은 at4 유형입니다. </li><li> 이전의 2 , 15에서 설명한 것처럼 prep에서 약 2 cm 떨어진 곳에서 별도의 공기 공급 튜브를 통해 일정한 습도의 공기 흐름 (2 L / min)으로 유지하십시오 ( 그림 4 ). </li></ol> 4. Palmitoleic Acid에 대한 at4 Trichoids의 or47b ORN으로부터의 at4 Sensillum 활성의 기록 <ol><li> 참조 전극을 clypeus에 삽입하십시오 ( 그림 3A ). 조직 손상을 피하려면 표피 아래의 체액과 접촉 할 수있는 표면 바로 아래에 전극을 신속하고 부드럽게 움직여야합니다. </li><li> 타겟 전극과 동일한 평면으로 들어가기까지 기록 전극을 천천히 낮추십시오 (= &quot;xfig&quot;&gt; 그림 3B). 50X 대물 렌즈 아래에서 기록하십시오. 참고 : 거친 삼각형 큐티클은 기록 전극을 감지기베이스에 삽입 할 필요가 있습니다. 넓은 영역은 전극이 빗나가게 할 가능성을 줄여주는 더 큰 타겟을 제공합니다 ( 그림 3B , 삽입). </li><li> sensillum에 악취 자극을 가하기 전에 다음 선택 기준을 준수하십시오. 이러한 기준을 충족시키지 못하는 모든 삼각근은 거부되어야하고 다른 감각제가 대신 선택되어야합니다. <ol><li> 높은 신호대 잡음비를 관찰하십시오 (예를 들어 그림 3C 참조). </li><li> at4A 및 at4C 뉴런에서 확인할 수있는 스파이크를 관찰합니다 ( 그림 3C ). 참고 : at4B 스파이크 진폭은 at4A 10 과 매우 유사하게 나타나 냄새 자극없이 쉽게 식별 할 수 없습니다. </li><li> at4A 뉴런의 기본 발사 속도는 다음과 같습니다.20 Hz 부근 또는 미만. 참고 :이 기준은 뉴런의 기본 발사 속도가 기본 ORNs 2 보다 높기 때문에 at4A에만 해당됩니다. 훨씬 더 높은 기저 발화는 전극이 삽입되는 동안 뉴런이 손상되었을 수 있음을 나타냅니다. </li></ol></li><li> 카트리지를 냄새 전달 튜브에 연결하십시오. 솔벤트 컨트롤부터 시작하여 낮은 농도에서 높은 농도까지 냄새 제거제를 사용하십시오. 준비 작업의 머리에 카트리지를 정면으로 향하게하면서 micromanipulator를 사용하여 카트리지를 준비쪽으로 움직이십시오. 시각적으로 카트리지가 몇 밀리미터 떨어진 곳에서 안테나에 직접 향하게되었는지 확인하십시오 ( 그림 4 ). 참고 : 목표는 카트리지 입구를 안테나에 직접 놓고 대상 조직 가까이에 배치하는 것입니다. </li><li> 냄새 제거제 카트리지가 기록 전극에서 오른쪽으로 1 ~ 2 mm 분리되고 플라이 프리p를 약 1 mm 아래로 밉니다. 참고 : 여기에 설명 된 설정에서 냄새 제거 장치 카트리지는 기록 전극, 참조 전극 및 플라이 - 준비 슬라이드 ( 그림 4 )와 밀접하게 경계를 이루고 있습니다. 참고 : 카트리지와 기록 / 참조 전극 사이의 거리에주의하십시오. 약 4mm의 거리를 권장합니다 1 . 의도하지 않은 접촉으로 인해 신호가 끊어 지거나 기록 전극의 끝이 끊어져 현재 뉴런이 손상되거나 추가 기록이 복잡해질 수 있습니다. 참고 : 카트리지와 플라이 - 준비 슬라이드를 분리하는 거리를 고려하십시오. 커버 슬립을 만지면 녹음 전극이 튕겨져 녹음이 중단 될 수 있습니다. </li><li> 레코딩을 시작하려면 데이터 수집 소프트웨어에서 &quot;Record&quot;를 누릅니다. 참고 : 10 초 녹음 할 때마다 1.9 단계에서 설명한대로 단일 500 ms 악취 펄스가 안테나로 직접 전달됩니다. </li><li> 냄새 제거제 도포 후,다음으로 높은 농도의 카트리지로 교체하기 전에 조심스럽게 카트리지를 집어 넣으십시오. 전체 용량 범위가 확보 될 때까지 계속하십시오. 참고 : 적응의 영향을 피하기 위해 각 비행에서 하나의 Or47b ORN 만 기록하는 것이 좋습니다. </li><li> 하루 동안 녹음을 마치면 녹음 전극을 증류수로 완전히 헹구십시오. </li><li> 상업적으로 이용 가능한 오프라인 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯합니다. </li></ol>

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여기에서 우리는 or47b ORNs의 palmitoleic acid에 대한 반응을 강력하게 유도하고 기록 할 수있는 절차를 설명했다. 우리는 불충분 한 페로몬 냄새 전달 문제를 해결하기 위해 전통적인 장거리 냄새 전달 방법 2 , 7 , 10 을 변경했습니다. 우리는 냄새 제거제 카트리지를 통해 화합물을 전달함으로써 냄새 제거제의 낮은 휘발성 문제를 ...

<html> Drosophila ORN은 에스테르, 알콜, 케톤, 락톤, 알데히드, 테르펜, 유기산, 아민, 황 화합물, 헤테로 고리 및 방향족 화합물을 포함하여 광범위한 탄소 사슬 길이와 다양한 작용기를 가진 방대한 냄새 물질에 반응합니다 2 , 3 . 그들의 물리 화학적 특성에있어서 다양한 냄새 물질은 화합물의 증기압에 의해 현저하게 상이한 휘발성을 나타낼 수있다. 특히, Drosophila melanogaster에 대한 생물학적으로 관련된 냄새 물질은 그들의 휘발성이 엄청나게 다릅니다. 예를 들어, Ir92a ORN은 휘발성이 높은 암모니아 4 에 20 ° C에서 6,432 mmHg의 증기압으로 반응합니다. 반대로 Or67d ORNs (VA c) 남성 페로몬, CIS -vaccenyl 아세트산 5, 6에 대응 증기압은 20 ℃에서 43 mmHg로한다. ov_content &quot;&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 냄새가 운반기 공기 흐름을 통해 상대적으로 장거리 ( 즉, 수 센티미터)에 걸쳐 전달되는 기존의 냄새 전달 방법에서 특히 어려움이 있습니다. 예를 들어, 고 선량의 c VA에 대한 Or67d ORN의보고 된 반응은 ~ 40 7 -&gt; 200 spikes / s 6 범위에 해당합니다. 더욱이 전통적인 전달 방법을 이용한 c VA의 효과적이지 않은 전달은 잘못된 결과에 기인 할 가능성이 높기 때문에 c VA만으로 Or67d ORNs 8 을 활성화시키는 데 충분하지 않다는 해석으로 이어진다. 근거리 악취 전달 방법 9. 따라서 impera저 휘발성의 냄새를 효과적으로 표출 할 수있는 강력한 악취 전달 시스템을 개발하려고합니다. 최근에 우리는 Or47b ORN의 리간드로서 몇몇 긴 사슬 큐티 릭 지방산을 확인했다. 그들은 유형 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4)에 있습니다. 장쇄 지방산 냄새 물질 중 Palmitoleic acid는 Or47b ORNs 1 을 활성화시킴으로써 남성 구애를 촉진시키는 최음 제지 페로몬으로서 기능한다는 것을 발견했다. 그러나, 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 다른 연구에서, 메틸 라우 레이트가 동일한 거리 (10)로부터 제공 될 때 팔 미트 산 응답을 유발하지는 않지만 Or47b ORNs 응답을 유도하는 것으로 나타났다. VA C에 비해, 장쇄 지방산은 25 ° C 11 0.001 mmHg로는 증기압, 심지어 덜 휘발성이다. 장쇄 지방산 냄새의 본질적으로 낮은 휘발성은 안테나를 통한 효과적인 프리젠 테이션을 방해합니다.기존의 악취 전달 시스템은 위음성 결과를 설명 할 가능성이 높습니다 10 . 이러한 불일치는 저 휘발성 냄새 물질을 제시 할 때 기존의 악취 전달 시스템의 부적합 함을 강조합니다. 이것은 이전에 플라이 cuticular 냄새를 효과적으로 전달 악취 소스 및 대상 조직 (6) 사이의 근접을 요구하는 것이 도시되었다. 그들은 아마 성격 (12), (13)에 초파리에 의해 발생되는로부터의 거리를 모방, 우리는 최소한의 거리가 우리의 절차에 높은 우선 순위를 부여해야한다는 합의 동안 따라서, 완전히 생물학적 활성 페로몬의 효과를 특징입니다. 우리의 방법은 표준 전기 물리학 리그 및 기술과의 호환성을 포함하여 추가 이점을 보유합니다. 기존 장비 설치는이 프로토콜을 수용하기 위해 최소한의 수정 만 필요로하며 대부분의 SSR 단계는 사소한 조정 만 필요합니다. 이우리의 기술을 SSR 경험이있는 연구원이 쉽게 이용할 수있게합니다. 또한, 우리의 기술은 날카로운 발병 및 오프셋을 갖는 저 휘발성 냄새 물질의 제시를 허용하고, 신경 전달 반응과 자극 전달을 상관시킨다. 마지막으로, 하드웨어 레이아웃은 냄새 제거제 카트리지 간의 신속한 교환을 촉진하여 원하는 복용량 범위에서 데이터 수집을 신속하게 처리합니다. 우리는 참조 전극과 기록 전극, AHL (Adult Hemolymph-Like) 용액, 냄새 전달 카트리지 및 해당하는 감각 계의 준비를 검토합니다. 우리는 다음에 녹음을 위해 파리의 준비가 뒤따른 팔미 톨산 산 냄새 처리제의 준비에 대해 논의합니다. 우리는이 방법을 사용하여 얻은 대표 데이터를 제시하기 전에 냄새 제거제 카트리지의 위치를 ​​기록하고 더 세밀하게 조사하기 위해 삼중 모양의 감각제를 선택하는 기준을 고려합니다. 마지막으로, 우리는이 techniq의 유용한 응용을 탐구하여 결론을 내린다.ue, 몇 가지 문제가 발생했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

곤충은 식량 구하기, 육식 동물 회피, 산란, 교미와 같이 생존에 필수적인 다양한 행동을 유도하기 위해 냄새 감각에 의존합니다. 다양한 휘발성 물질의 무수한 화학 물질이 곤충 후각 수용체 뉴런 (ORN)을 활성화시키는 천연 냄새 물질로 확인되었습니다. 그러나, 저 휘발성 냄새 물질에 대한 후각 반응을 연구하는 것은 종래의 악취 전달 방법을 사용하여 그러한 자극을 효과적으로 제공 할 수 없기 때문에 방해 받고있다. 여기서는 생체 내 Single-Sensillum Recording (SSR)을 위해 저 휘발성 취기 물질을 효과적으로 제시 할 수있는 절차에 대해 설명합니다. 냄새 소스와 표적 조직 사이의 거리를 최소화함으로써이 방법은 구토 및 교미 행동에 관여하는 ORN에 대한 효과가 입증 된 자극 페로몬 인 팔미 톨 레산 (palmitoleic acid)을 포함하여 생물학적으로 현저하지만 지금까지 접근 할 수없는 냄새 물질의 적용을 허용합니다 1 .따라서 우리의 절차는 곤충 반감 및 페로몬 커뮤니케이션에 대한 연구를 위해 저 휘발성 냄새 물질을 분석하는 새로운 방법을 제시합니다.

우리의 기술은 성공적으로 palmitoleic acid의 시스 ( 그림 5B ) 이성질체 대 트랜스 ( 그림 5A )의 상대적인 효능을 결정하는 데 적용되었습니다. 우리의 대표적인 데이터는 trans -palmitoleic acid가 cis isoform과 비교했을 때 Or47b ORN에 대해보다 효과적인 리간드임을 입증합니다 ( 그림 5C ). ?...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다.

에서 전기 생리 학적 기록<em&gt; Drosophila</em&gt; 낮은 휘발성의 냄새에 반응하는 Trichoid Sensilla

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K 조회수.  University of California San Diego.  이 프로토콜의 전반적인 목표는 장쇄 사상 페로몬에 반응하는 Drosophila 후각 수용체 뉴런으로부터 단일 감각 기록을위한 낮은 휘발성의 냄새 물질을 제시하는 방법을 입증하는 것입니다. 

비디오: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Circadian 리듬을 연구 및 매개 변수 잠을 전위의 활동 시금 Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

연구

신경과학

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

애벌레의 Zebrafish의 Forebrain Electrophysiological 기록

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Odorants에 Arthropod 응답을 수직 T-미로 초이스 분석

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

동시 사전 및 사후 신경 Electrophysiological 녹화에서<em&gt; Xenopus</em&gt; 신경 근육 공동 문화

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

온전한 성인 Zebrafish의의 뇌에 전기 생리학 기록

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

에서 전기 생리학 기록<em&gt; 초파리</em&gt; Labellar는 Sensilla 맛

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

동시 전기 생리 녹화 및 설치류의 뇌에서 억제 에이전트의 마이크로 주사

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.