Agradecemos a Ye Zhang por la ayuda con los trazos de muestra y Tin Ki Tsang por la ayuda con las fotos. Este trabajo fue apoyado por un Premio de carrera temprana de la fundación de Ray Thomas Edwards y una concesión de NIH (R01DC015519) a las concesiones de C.-YS y de NIH (R01DC009597 y R01DK092640) a JWW

1. Preparación del hardware para la grabación de at4 <ol><li> Utilice un instrumento de extracción de pipeta para preparar electrodos con tubos de vidrio de aluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Blunt la punta del electrodo de referencia ligeramente con un par de pinzas finas para facilitar la inserción en el clypeus de la mosca ( es decir, una placa redondeada en la parte delantera de la cabeza de la mosca, por encima de las partes bucales). NOTA: En este estudio se utilizaron varones WT de 7 días de edad (Berlín). Utilice solución salina AHL 14 como el electrolito para ambos electrodos. </li><li> Preparar 1 L de AHL mediante la mezcla de 900 ml de agua destilada con 6,312 g de NaCl, 0,373 g de KCl, 0,337 g de NaHCO 3, 0,1120 g de NaH 2 PO 4, 1,892 g de trehalosa ּ 2 H 2 O, 3,423 g de sacarosa, 1,192 g de HEPES y 8,2 ml de MgCl _ { 2} 1M. Utilizando agua destilada, llevar el volumen total hasta 1 L. Llevar el pH a 7,4 usando NaOH 1 N y esterilizar la solución con unSistema de filtro accionado por vacío. Para almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de AHL a 4 ° C. NOTA: Las entregas consistentes de ácido palmitoleico dependen de la uniformidad entre los cartuchos. Es crítico que cada cartucho esté ensamblado de una manera reproducible. </li><li> Utilizando una cuchilla de afeitar, retire 0,9 cm de la punta de una punta de pipeta de 200 μl para crear la primera sección del cartucho, que mide 4,1 cm; Consulte las dimensiones detalladas en la Figura 1A . Utilice otra punta de pipeta de 200 μl y quite 1,7 cm y 1,5 cm de la punta y la base, respectivamente, para crear la segunda sección del cartucho, midiendo 1,8 cm ( Figura 1A ). Utilice una regla para asegurar la reproducibilidad. </li><li> Utilice un perforador de ⅛ &quot;para cortar los discos del papel de filtro. </li><li> Utilice fórceps para colocar un disco de papel de filtro en la punta de la segunda sección del cartucho. Confirme visualmente que hay una abertura en la punta del cartucho a través de la cual puede pasar el aire. </li><li> Conecte las secciones de cartucho primero y segundo juntos, como se muestra en la Figura 1A . Ángulo de la segunda sección del cartucho hacia abajo para facilitar la orientación cuadrada en la preparación ( Figura 1B ). </li><li> Conecte el cartucho con el tubo de suministro de olor, que está montado en un micromanipulador. NOTA: Este diseño permite que el cartucho sea girado hacia afuera para facilitar el intercambio ( Figura 1C ). </li><li> Ajuste el flujo de aire humidificado constante a 2 L / min en un controlador de masa y el flujo de odorante a 500 mL / min en otro controlador de masa. </li><li> Usando el software (vea la Tabla de Materiales ), programe el procedimiento para administrar un soplo de olor de 500 ms. </li></ol> 2. Preparación de Soluciones Odorantes de Ácido Palmitoleico para Entrega NOTA: Or47b ORNs responder tanto a cis - y ácido -palmitoleic trans. Como el ácido palmitoleico es inestable en RT, las existencias se almacenan a -20 ° C y se utilizan dentro de un mes tras la apertura. El etanol es el disolvente de elección para el ácido palmitoleico. <ol><li> Utilice un mezclador de vórtice para mezclar bien 10 μl de ácido cis- o trans- palmitoleico o diluciones con 90 μl de etanol al 100% para diluciones en serie de diez veces en microtubos de 1,7 ml. Preparar diluciones frescas de ácido palmitoleico diariamente antes de los experimentos y usarlos en un día. NOTA: Para los odorantes que no son solubles en etanol, se recomienda un vial de vidrio para preparar diluciones de olor con otros tipos de disolventes orgánicos. </li><li> Utilizando una micropipeta P10, aplicar 5 μl de soluciones de ácido cis- palmitoléico de las diluciones deseadas al papel de filtro en cada cartucho correspondiente. NOTA: La dosis más alta (10 -1 ) contiene 450 μg del compuesto. Para las soluciones de ácido trans -palmitoleico, aplique 4,5 μL en lugar de modo que la dosis más alta (10 -1 ) también contenga 450 μg de tÉl compuesto. </li><li> Para evaporar completamente el disolvente, coloque los cartuchos de ácido palmitoleico en un desecador de vacío durante 1 h a RT y 7,59 mmHg de presión. NOTA: Los cartuchos se pueden utilizar hasta 4 h en RT. </li></ol> 3. Preparación de Drosophila para acceso listo a la Sensilla at4 para grabaciones electrofisiológicas in vivo NOTA: Las moscas WT (Berlín) se crian en medio estándar de harina de maíz a 25 ° C en un ciclo 12:12 luz-oscuridad. Tras la eclosión, las moscas se separan por sexo en grupos de diez, por lo que se alojan en grupo hasta los 7 días de edad. Or47b ORNs tanto en moscas masculinas como femeninas responden al ácido palmitoleico. Por simplicidad, sólo las moscas macho se examinan en el estudio actual. <ol><li> Montar una diapositiva de mosca-prep: en una diapositiva de cristal, coloque un cubreobjetos de vidrio (18 x 18 mm 2 ) sobre una pequeña cantidad de arcilla de modelado, formando un ángulo de ~ 3 ° con el portaobjetos de vidrio. Coloque la cinta de doble cara en el interior eDge de la cubreobjetos y en el área de la corredera inmediatamente debajo. Reemplace con cinta nueva por cada día de grabación ( Figura 2A ). </li><li> Utilice un aspirador de mosca 15 para recoger la mosca de interés en el tubo y luego coloque una punta de pipeta de 200 μL sobre el extremo del tubo. Simultáneamente deslice el tubo hacia adelante mientras sopla aire en el tubo para empujar la mosca hasta el extremo de la punta de la pipeta. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar justo debajo del cuerpo de la mosca y 2 longitudes de las cabezas por encima de la mosca. </li><li> Tamp la parte inferior de la punta de la pipeta con la arcilla de modelado, empujando la mosca hacia arriba hasta tanto las antenas y el clypeus están expuestos ( Figura 2B ). Para evitar la muerte de la mosca, agregue sólo suficiente arcilla para exponer las antenas y aristae, ya que esto evita que el abdomen de la mosca de ser aplastado. Además, agregue la arcilla lentamente y suavemente para prevenir cualquier constricción repentina. Confirme que la mosca está viva revisando la antenaO movimiento de probóscide. </li><li> Use fórceps para maniobrar la punta de la pipeta que aloja la mosca. Oriente la cabeza de modo que el clypeus esté mirando a la derecha del observador. Ajustar la preparación a lo largo de la cubreobjetos con una pinza fina hasta que el lado lateral de la antena se apoye contra la superficie tapada de la cubreobjetos ( Figura 2B ). </li><li> Coloque una barra de sujeción en el arista para asegurar la antena a la cinta de doble cara para evitar el movimiento ( Figura 2B ). NOTA: La varilla de sujeción se extrae de un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de pipeta y se mantiene en posición con arcilla de modelado ( Figura 2A ). </li><li> Coloque la preparación en el escenario de la plataforma ( Figura 2C ). Utilizando el microscopio, confirme que los tricoides son visibles a lo largo del borde distal-lateral del tercer segmento de la antena. NOTA: Idealmente, la sensilla debe ser claramente silueta contra el fondo, lo que simplifica su<html> Identificación y facilita el registro ( Figura 3 ). En esta preparación, la mayoría de los accesibles tricino sensilla son del tipo at4. </li><li> Mantenga la preparación bajo flujo de aire humidificado constante (2 L / min) suministrado a través de un tubo de suministro de aire separado a una distancia de aproximadamente 2 cm de la preparación ( Figura 4 ), como se ha descrito anteriormente 2 , 15 . </li></ol> 4. Registro de At4 Sensillum Actividad de Or47b ORNs en los tricoides at4 en respuesta al ácido palmitoleico <ol><li> Inserte el electrodo de referencia en el clypeus ( Figura 3A ). Para evitar daños en los tejidos, asegúrese de que el electrodo se inserta justo debajo de la superficie, donde puede ponerse en contacto con la hemolinfa bajo la cutícula, con un movimiento rápido y suave. </li><li> Baje el electrodo de grabación lentamente hasta que entre en el mismo plano de visión que el objetivo sensillum (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Grabe bajo un objetivo de 50X. NOTA: La cutícula tricoidal resistente requiere insertar el electrodo de registro en la base sensilar, cuya área más amplia proporciona un objetivo mayor que reduce la probabilidad de que el electrodo se desvíe ( figura 3B , inserto). </li><li> Antes de aplicar estímulos de olor a un sensor, observe los siguientes criterios de selección: Cualquier tricero que no cumpla con estos estándares debe ser rechazado y otro sensillum elegido en su lugar. <ol><li> Observe una alta relación señal-ruido (vea la Figura 3C para un ejemplo). </li><li> Observar identificables picos de 4A y 4C neuronas ( Figura 3C ]. NOTA: Es de destacar que la amplitud pico at4B parece muy similar a at4A 10 y no se puede identificar fácilmente sin estimulación olor. </li><li> Obsérvese que la tasa de disparo basal de las neuronas at4A esAlrededor o por debajo de 20 Hz. NOTA: Este criterio es específico para at4A porque la tasa de disparo basal para la neurona es mayor que la de los ORN básicos 2 . Un disparo basal mucho más alto indica que las neuronas pueden haber sido dañadas durante la inserción del electrodo. </li></ol></li><li> Conecte el cartucho al tubo de suministro de olor. Comience con el control de disolventes y después los odorantes, desde concentraciones bajas a altas. Utilice el micromanipulador para maniobrar el cartucho hacia la preparación mientras que apunta el cartucho directamente en la cabeza de la preparación. Confirme visualmente que el cartucho está apuntando directamente a la antena ( Figura 4 ) desde unos pocos milímetros de distancia. NOTA: El objetivo es orientar la apertura del cartucho directamente en la antena y colocarla cerca del tejido objetivo. </li><li> Asegúrese de que el cartucho de olor se separa del electrodo de registro a su derecha de 1 - 2 mm y de la mosca preP deslizarse por debajo de aproximadamente 1 mm. NOTA: En la configuración descrita aquí, el cartucho de olor está estrechamente rodeado por el electrodo de registro, el electrodo de referencia y la corredera de preparación de mosca ( Figura 4 ). NOTA: Preste atención a la distancia entre el cartucho y los electrodos de grabación / referencia. Se recomienda una distancia de alrededor de 4 mm 1 . El contacto involuntario puede terminar la señal y romper la punta del electrodo de grabación, dañando la neurona actual y complicando otras grabaciones. NOTA: Considere la distancia que separa el cartucho y la diapositiva de preparación de la mosca. Tocar el cubreobjetos también puede desalojar el electrodo de grabación para interrumpir la grabación. </li><li> Pulse &quot;Grabar&quot; en el software de adquisición de datos para iniciar la grabación. NOTA: Para cada grabación de 10 s, se suministra un solo impulso de olor de 500 ms directamente a la antena, como se describe en el paso 1.9. </li><li> Después de la aplicación odorante,Cuidadosamente retraer el cartucho antes de reemplazarlo con un cartucho de la siguiente concentración más alta. Continúe hasta que se obtenga el rango de dosificación completo. NOTA: Se recomienda que solo se registre un Or47b ORN de cada mosca para evitar posibles efectos de adaptación. </li><li> Enjuague bien el electrodo de registro con agua destilada después de terminar la grabación para el día. </li><li> Analizar y trazar los datos utilizando software de análisis offline disponible comercialmente. </li></ol>

<ol>
	<li>Lin, H. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+modulation+of+pheromone+detection+enhances+male+courtship+success.">Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success.</a> Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125 (1), 143-160 (2006).</li><li>Silbering, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complementary+function+and+integrated+wiring+of+the+evolutionarily+distinct+Drosophila+olfactory+subsystems.">Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems.</a> J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).</li><li>Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dedicated+olfactory+neurons+mediating+attraction+behavior+to+ammonia+and+amines+in+Drosophila.">Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).</li><li>Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+class+of+olfactory+neurons+mediates+behavioural+responses+to+a+Drosophila+sex+pheromone.">A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone.</a> Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).</li><li>Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptors+and+neurons+for+fly+odors+in+Drosophila.">Receptors and neurons for fly odors in Drosophila.</a> Curr Biol. 17, 606-612 (2007).</li><li>Schlief, M. L., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+processing+and+behavior+downstream+from+highly+selective+receptor+neurons.">Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).</li><li>Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+Pheromone-sensitive+neurons+is+mediated+by+conformational+activation+of+pheromone-binding+protein.">Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein.</a> Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).</li><li>Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligands+for+pheromone-sensing+neurons+are+not+conformationally+activated+odorant+binding+proteins.">Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins.</a> PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).</li><li>Dweck, H. K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+mediating+copulation+and+attraction+in+Drosophila.">Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila.</a> Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).</li><li>Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaporation+rates+and+vapor+pressures+of+the+even-numbered+C8-C18monocarboxylic+acids.">Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids.</a> J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).</li><li>Kimura, K. -. I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+back+or+front:+the+courtship+position+is+a+matter+of+smell+and+sight+in+Drosophila+melanogaster+males.">From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males.</a> J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).</li><li>Grosjean, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+olfactory+receptor+for+food-derived+odours+promotes+male+courtship+in+Drosophila.">An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila.</a> Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+sensillum+recordings+in+the+insects+Drosophila+melanogaster+and+Anopheles+gambiae.">Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae.</a> J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, se describe un procedimiento por el cual las respuestas de Or47b ORNs a palmitoleic ácido puede ser fuertemente inducida y registrada. Se modificó un método convencional de entrega de olores a larga distancia 2 , 7 , 10 para solucionar el problema de suministro insuficiente de odorante de feromonas. Se abordó la cuestión de la baja volatilidad olorosa mediante la entrega del compuesto a través de cartuchos de olor,...

<html> Los ORNs de Drosophila responden a un gran número de odorantes, con longitudes de cadena de carbono ampliamente extendidas y una variedad de grupos funcionales, incluyendo ésteres, alcoholes, cetonas, lactonas, aldehídos, terpenos, ácidos orgánicos, aminas, compuestos de azufre, heterocíclicos y aromáticos 2 , 3 . Odorantes variados en sus características físico-químicas pueden tener volatilidades marcadamente diferentes, indicadas por la presión de vapor del compuesto. En particular, los odorantes biológicamente relevantes para Drosophila melanogaster difieren enormemente en su volatilidad. Por ejemplo, los ORN de Ir92a responden al amoníaco 4 , que es altamente volátil, con una presión de vapor de 6.432 mmHg a 20 ° C. Por el contrario, Or67d ORNs responden a una feromona masculina, acetato de cis- vinceno ( c VA) 5 , 6 , cuya presión de vapor es de 43 mmHg a 20 ° C. El estudio de la respuesta olfativa a los odorantes de baja volatilidad es particularmente difícil con los métodos convencionales de suministro de olores, en los que los odorizantes se suministran a través de una corriente de aire portadora a una distancia relativamente larga ( es decir, varios centímetros) A un determinado odorante de baja volatilidad puede variar en gran medida, dependiendo del diseño del sistema de suministro de olor.Por ejemplo, la respuesta informada de Or67d ORNs a una dosis alta de c VA oscila entre ~ 40 7 -&gt; 200 picos / s 6 . Además, la entrega ineficaz de c VA con métodos convencionales de entrega es probablemente atribuida a falsos resultados negativos, lo que lleva a la interpretación de que c VA por sí mismo no es suficiente para activar Or67d ORNs 8. Esta interpretación fue más tarde impugnada por otro estudio utilizando un Método de distribución de olores a corta distancia.Desarrollar un robusto sistema de suministro de olores para la presentación eficaz de olorantes de baja volatilidad. Recientemente, identificamos varios ácidos grasos cuticulares de cadena larga como ligandos para los ORN de Or47b. Se alojan en el tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Entre los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, encontramos que el ácido palmitoleico funciona como una feromona afrodisíaca que promueve el cortejo masculino mediante la activación de Or47b ORNs 1 . Sin embargo, en otro estudio utilizando un método de suministro de olor convencional, se demostró que el laurato de metilo induce respuestas de los ORN de Or47b, mientras que el ácido palmitoleico no evoca respuesta cuando se presenta a partir de la misma distancia 10 . En comparación con c VA, los ácidos grasos de cadena larga son aún menos volátiles, con presiones de vapor inferiores a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilidad inherentemente baja de los odorantes de ácidos grasos de cadena larga, que impide la presentación eficiente a la antena víaConvencional de los sistemas de suministro de olores, probablemente representaron los resultados falsos negativos [ 10] . Esta incoherencia pone de manifiesto la insuficiencia de los sistemas convencionales de suministro de olores al presentar olorantes de baja volatilidad. Anteriormente se demostró que el suministro efectivo de olores cuticulares de mosca requiere una estrecha proximidad entre la fuente de olor y el tejido diana 6 . Por lo tanto, para caracterizar completamente los efectos de las feromonas biológicamente activas mientras mimetiza la distancia desde la cual son probablemente encontrados por las moscas de la fruta en la naturaleza 12 , 13 , acordamos que la distancia mínima debe ser de alta prioridad en nuestro procedimiento. Nuestro método tiene otras ventajas, incluyendo la compatibilidad con equipos y técnicas de electrofisiología estándar. Las configuraciones de equipos preexistentes requieren una modificación mínima para acomodar este protocolo, y la mayoría de los pasos de SSR requieren solo ajustes menores. EstaHace que nuestra técnica sea fácilmente accesible a los investigadores con experiencia en SSR. Además, nuestra técnica permite la presentación de odorantes de baja volatilidad con inicio y desplazamiento agudos, correlacionando el estímulo con la respuesta neuronal. Finalmente, la disposición del hardware facilita los intercambios rápidos entre los cartuchos de olor, acelerando la recopilación de datos sobre un rango de dosificación deseado. Empezaremos por revisar la preparación de los electrodos de referencia y de registro, la solución de hemolinfa tipo adulto (AHL), los cartuchos de suministro de odorantes y el olfatómetro correspondiente. A continuación se discute la preparación de las soluciones odorantes de ácido palmitoleico, seguido por la preparación de la mosca para su registro. Se procede a considerar los criterios para seleccionar un tricloide sensillum para registrar y examinar más de cerca el posicionamiento del cartucho odorante antes de presentar datos representativos adquiridos usando este método. Finalmente, concluimos explorando aplicaciones útiles de esta técnicaUe, algunos problemas encontrados y sus soluciones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Prep Setup &#38; Miscellaneous Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Puller Instrument&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>P97</td>
			<td>Pipette Puller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments 
			Sarasota FL USA</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>to make holding rods</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminosilicate Glass Capillaries&#160;</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>AF100-64-10</td>
			<td>to make electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific 
			Pittsburgh PA USA</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch 
			St. Paul MN USA</td>
			<td>NA</td>
			<td>for fly-prep station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscope</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>BX51</td>
			<td>for recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastalina modeling clay</td>
			<td>Van Aken 
			North Charleston SC USA</td>
			<td>B0019QZMQQ</td>
			<td>for prep station and to stablize the holding rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td>
			<td>Nalgene 
			Rochester NY USA</td>
			<td>#156-4045</td>
			<td>to sterilize AHL solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cartridge Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette tip&#160;</td>
			<td>VWR 
			Radnor PA USA</td>
			<td>53508-810</td>
			<td>to make odor cartridges and fly prep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Whatman 
			Maidstone Kent UK</td>
			<td>740-E</td>
			<td>to make odor cartridges&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer 
			Vernon Hills IL USA</td>
			<td>VX-06514-30</td>
			<td>to vaporize ethanol solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cis-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trans-palmitoleic acid</td>
			<td>Cayman Chemical 
			Ann Arbor MI USA</td>
			<td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td>
			<td>Or47b odorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Spectrum Chemical MFG.&#160; 
			New Brunswick NJ USA</td>
			<td>E1028-500MLGL</td>
			<td>to dilute palmitoleic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rig Setup Materials</td>
			<td>&#160;&#160;&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td>
			<td>Siskiyou 
			Grants Pass OR USA</td>
			<td>MX130R</td>
			<td>to position the olfactometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Vision software&#160;</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>FLOWVISIONSC</td>
			<td>software to control flow rate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-2SLPM-D</td>
			<td>to control the flow rate for humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Controller</td>
			<td>Alicat 
			Tuscon AZ USA</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td>to control the flow rate for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>Data acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air delivery tube</td>
			<td>Ace Glass 
			Vineland NJ USA</td>
			<td>8802-936&#160;</td>
			<td>to deliver humidified air</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x objective lens&#160;</td>
			<td>Olympus 
			Shinjuku Tokyo Japan</td>
			<td>LMPLFL50X</td>
			<td>recording rig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 10</td>
			<td>Molecular Devices 
			Sunnyvale CA USA</td>
			<td>Ver. 10.4</td>
			<td>software for spike analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro 6</td>
			<td>WaveMetrics 
			Lake Oswego OR USA</td>
			<td>Ver. 6.37</td>
			<td>software for data analysis&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Audio Monitor</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXB-AUDIS-08B</td>
			<td>Aurally reports individual spikes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>NPIEXT-02F</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controller</td>
			<td>Warner Instruments&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>VC-8</td>
			<td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording Electrode Micromanipulator</td>
			<td>Sutter Instruments 
			Novato CA USA</td>
			<td>MP-285</td>
			<td>to position recording electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Headstage Amplifier</td>
			<td>ALA Scientific Instruments 
			Farmingdale NY USA</td>
			<td>EQ-16.0008</td>
			<td>to increase the amplitude of electrical signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix 
			Beaverton OR USA</td>
			<td>TDS2000C</td>
			<td>Visual report of individual spikes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Los insectos dependen de su sentido del olfato para guiar una amplia gama de comportamientos que son críticos para su supervivencia, tales como la búsqueda de alimentos, la evitación de depredadores, la oviposición y el apareamiento. Se han identificado innumerables sustancias químicas de diferentes volatilidades como olores naturales que activan las Neuronas de Receptor Olfativas de Insectos (ORN). Sin embargo, el estudio de las respuestas olfativas a los odorizantes de baja volatilidad se ha visto obstaculizado por la incapacidad de presentar eficazmente tales estímulos usando métodos convencionales de suministro de olor. En este sentido, describimos un procedimiento que permite la presentación eficaz de los odorantes de baja volatilidad para la grabación de Sensillum único (SSR) in vivo . Al minimizar la distancia entre la fuente de olor y el tejido diana, este método permite la aplicación de los odorantes biológicamente sobresalientes pero hasta ahora inaccesibles, incluyendo el ácido palmitoleico, una feromona de estimulación con un efecto demostrado sobre ORNs implicados en cortejo y apareamiento comportamiento 1.Nuestro procedimiento proporciona así una nueva vía para analizar una serie de odorantes de baja volatilidad para el estudio de olfato de insectos y la comunicación de feromonas.

Nuestra técnica se aplicó con éxito para determinar la eficacia relativa de los isómeros trans ( Figura 5A ) versus isómeros cis ( Figura 5B ) del ácido palmitoleico. Nuestros datos representativos demuestra que el ácido trans- palmitoléico es un ligando más eficaz para Or47b ORNs en comparación con la cis isoforma ( Figura 5C ]. Se registró una única ...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares.

Registro electrofisiológico de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tricoide Sensilla en Respuesta a Odorantes de Baja Volatilidad

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K vistas.  University of California San Diego.  El objetivo general de este protocolo es demostrar cómo presentar olorosos de baja volatilidad para el registro de un solo sensor de Drosophila neuronas receptoras olfativas que responden a la cadena larga de feromonas cuticulares. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) pacemakers or clocks. Malfunctions in the human circadian system are associated with numerous diseases or disorders. Much progress towards our understanding of the mechanisms underlying circadian rhythms has emerged from genetic screens whereby an easily measured behavioral rhythm is used as a read-out of clock function. Studies using Drosophila have made seminal contributions to our understanding of the cellular and biochemical bases underlying circadian rhythms. The standard circadian behavioral read-out measured in Drosophila is locomotor activity. In general, the monitoring system involves specially designed devices that can measure the locomotor movement of Drosophila. These devices are housed in environmentally controlled incubators located in a darkroom and are based on using the interruption of a beam of infrared light to record the locomotor activity of individual flies contained inside small tubes. When measured over many days, Drosophila exhibit daily cycles of activity and inactivity, a behavioral rhythm that is governed by the animal's endogenous circadian system. The overall procedure has been simplified with the advent of commercially available locomotor activity monitoring devices and the development of software programs for data analysis. We use the system from Trikinetics Inc., which is the procedure described here and is currently the most popular system used worldwide. More recently, the same monitoring devices have been used to study sleep behavior in Drosophila. Because the daily wake-sleep cycles of many flies can be measured simultaneously and only 1 to 2 weeks worth of continuous locomotor activity data is usually sufficient, this system is ideal for large-scale screens to identify Drosophila manifesting altered circadian or sleep properties.

Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila

We describe procedures for recording daily locomotor activity rhythms of Drosophila and subsequent data analysis. Locomotor activity rhythms are a reliable behavioral output of animal circadian clocks and are used as the standard readout of clock function when studying circadian mutants or examining how the environment regulates the circadian system.

Ensayo Actividad locomotora para el Estudio de los ritmos circadianos y del sueño en los parámetros Drosophila</em

Most life forms exhibit daily rhythms in cellular, physiological and behavioral phenomena that are driven by endogenous circadian (&equiv;24 hr) ...

Investigación

Neurociencias

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

La grabación simultánea de señales de calcio en neuronas identificadas y comportamiento de alimentación de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

Prosencéfalo electrofisiológico de grabación en larvas de pez cebra

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Vertical T-laberinto Choice Ensayo para la respuesta a los olores artrópodos

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultánea pre-y post-sináptica de registro electrofisiológico<em&gt; Xenopus</em&gt; Músculo Nervio-Co-culturas

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Electrofisiológico Grabación desde<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Micro-injections of Inhibitory Agents in the Rodent Brain

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing system was developed that allows for the injection of a drug while recording electrophysiological signals from the affected neuronal population. This method provides a simple and economical alternative to commercial solutions. A glass pipette was modified by combining it with a hypodermic needle and a silver filament. The injectrode is attached to commercial microsyringe pump for drug delivery. This results in a technique that provides real-time pharmacodynamics feedback through multi-unit extracellular signals originating from the site of drug delivery. As a proof of concept, we recorded neuronal activity from the superior colliculus elicited by flashes of light in rats, concomitantly with delivery of drugs through the injectrode. The injectrode recording capacity permits the functional characterization of the injection site favoring precise control over the localization of drug delivery. Application of this method also extends far beyond what is demonstrated here, as the choice of chemical substance loaded into the injectrode is vast, including tracing markers for anatomic experiments.

Here, we craft a glass pipette with dual functions: inhibition of deep brain structures by microinjections of drugs and real-time monitoring of their effects through simultaneous electrophysiological recordings.

Grabación simultánea electrofisiológico y micro-inyecciones de agentes inhibitorios en el cerebro de roedores

Here we describe a method for the construction of a single-use &#8220;injectrode&#8221; using commercially accessible and affordable parts. A probing ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.