Os autores gostaria de agradecer a David Langenau generosamente oferecendo espaço aquário; Eric Stone, John C. Moore e Qin Tang para ajudarem com a manutenção de zebrafish e reagentes e Anne Robertson e Elliott Hagedorn do laboratório de Leonard Zon para adquirir a zebrafish as estirpes utilizadas aqui. Também gostariam de agradecer conselhos sobre técnicas fotolitográfica Octavio Hurtado. FE foi patrocinada por bolsas do Hospital do Shriner para crianças e a associação americana do australiano. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM92804.

Microinjeção de larvas foi aprovada pelo Massachusetts General Hospital Subcomissão de pesquisa cuidado de Animal sob protocolo 2011N000127.
1. dispositivo fabricação
Nota: Todos os computador assistida (CAD) arquivos de desenho utilizados para a concepção de máscaras de fotolitografia descritas aqui (Figura 1) estão disponíveis para download. Consulte tabela de materiais para links.
<ol><li>Fabrica a bolacha de molde mestre em uma sala limpa de classe 1.000 usando técnicas padrão fotolitográfica7. Para os canais e matrizes de microestrutura, padrão o fotorresiste negativa baseada em epóxi sequencialmente em 3 camadas usando 3 máscaras separadas, de acordo com as instruções do fabricante: 100 µm para as características superficiais, 200 µm para as características médias e 400 µm para as características profundas. Para o dispositivo de imagem, padrão de duas camadas usando 400 µm para as características superficiais e 600 µm para os recursos do fundo.</li>
	<li>Fita a bolacha concluída para a base de um prato de Petri para fundição (Figura 2) de 15 cm.</li>
</ol>2. preparação de matrizes de superfície Microstructured - PDMS
<ol><li>Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco polydimethylsiloxane (PDMS), usando a bolacha mestre como um molde. Combine 50 g de monômero PDMS com 5 g de iniciador e misture bem em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.</li>
	<li>Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.</li>
	<li>Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.</li>
	<li>Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.</li>
	<li>Corte cuidadosamente ao redor do dispositivo sobre a bolacha mestre usando um bisturi, certificando-se de manter o contato entre a ponta do bisturi e a superfície da bolacha. Usando fórceps, descasque a réplica PDMS longe da bolacha e a transferência para um limpo cm 10 placa de Petri, lado de recurso para cima (Figura 3).</li>
	<li>Tratar o dispositivo com plasma de oxigênio utilizando um forno de plasma para 35 s para reduzir a hidrofobicidade.</li>
	<li>Cubra com meio de embrião de zebrafish (E3) contendo 168 mg/L de Metanossulfonato de etila 3-aminobenoate (MS-222, pH 7,5). Remover quaisquer bolhas de características mais profundas pelo fluxo de água sobre a superfície do dispositivo usando uma pipeta de transferência.</li>
</ol>3. preparação de matrizes de superfície Microstructured - Agarose
<ol><li>Para fazer um molde negativo de PDMS, primeiro trate um dispositivo PDMS com plasma de oxigênio.</li>
	<li>
Trate o dispositivo PDMS com 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para criar uma superfície inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Coloque o PDMS para ser tratada característica-lado-para cima em uma câmara de vácuo dentro de uma coifa.</li>
		<li>Ao lado do PDMS, coloque um pequeno prato de vidro ou alumínio aberto, e cuidadosamente Pipetar 200 µ l de PFDTS (98% silano) no prato. Cuidado: Silano PFDTS é altamente volátil, reage violentamente com a água, é inflamável e provoca graves danos de pele e olho no contato. MSDS de leitura em detalhe antes do uso.</li>
		<li>Fechar a câmara de vácuo e aplicar vácuo durante 15-30 minutos, ou até que o silano PFDTS é completamente evaporado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o dispositivo em um prato de Petri e usar como um molde para PDMS fresco, preparado como descrito no passo 2.1-2.3.</li>
	<li>Asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h, em seguida, descascar toda a camada de PDMS fresco do dispositivo de tratados e coloque em um prato de Petri fresco. Este então pode ser usado como um molde negativo para converter agarose.</li>
	<li>Para preparar a agarose, ferva uma solução de 2% de baixo coaguladas agarose de temperatura na E3 no microondas até a agarose é totalmente dissolvido.</li>
	<li>Despeje o agarose quente sobre o molde negativo de PDMS e remover quaisquer bolhas no agarose cobrindo o dispositivo por agarose quente fluindo sobre as características de uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Uma vez que as bolhas são removidas, refrigere a 4 ° C, para definir o agarose.</li>
	<li>Retire o molde negativo de PDMS por deformar o PDMS de baixo com a mão o bloco de agarose, transferir o bloco de agarose para uma nova placa de Petri e molhado com E3 contendo MS-222.</li>
</ol>4. preparação de PDMS dispositivos de imagem
<ol><li>Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco PDMS, usando a bolacha mestre como um molde. 50 g de monômero PDMS aliam 5g de iniciador (o mesmo que usou na etapa 2.1) e misture cuidadosamente em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.</li>
	<li>Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.</li>
	<li>Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.</li>
	<li>Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.</li>
	<li>Corte os dispositivos a bolacha de mestre e um soco para fora de portas usando um soco de 1,5 mm.</li>
	<li>Tratar os dispositivos e um vidro de 6-poços-fundo bem placa com plasma de oxigênio por 35 s, conforme descrito na etapa 2.6.</li>
	<li>Ligação de um dispositivo característica-lado-para baixo para cada lamela de vidro da placa 6-poços, colocando-o sobre uma chapa de 85 ° C por 10 min. Nota: Para confirmar a ligação bem sucedida, aplique pressão firme ao lado do dispositivo ligado usando fórceps. O dispositivo deve permanecer anexado para a lamela de vidro.</li>
</ol>5. Zebrafish cultura
<ol><li>Embriões de zebrafish cultura para dpf 2 usando técnicas padrão3.</li>
	<li>Dechorionate de embriões utilizando protease fórceps ou 1 mg/mL misturar (veja a tabela dos materiais)3 pelo menos 30 a 60 minutos antes da carga de dispositivo, que permita a endireitar.</li>
	<li>Anestesiar embriões utilizando solução-mãe (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5), adicionando 1 mL de 25 X para a E3 em sua placa de Petri.</li>
</ol>6. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - matrizes do torrão
<ol><li>Prepare o bloco PDMS da etapa 2.7 (Figura 3A) em sua placa de Petri, tal que é coberto por uma camada fina (1-2 mm) da E3, que permite a fácil manipulação de embriões.</li>
	<li>Transferi o número necessário de embriões (geralmente de 10-20 por condição) para a superfície do bloco de PDMS utilizando uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), empurrar os embriões para os divots microstructured (Figura 3A). Uso de divots é particularmente adequado para orientações dorsais e ventrais. Nota: Para os divots com um apertado caber (dorsal e ventral), tente os embriões de posicionamento na superfície do bloco em paralelo para o guardião e então rolá-los em posição usando um laço de cabelo. A empurrá-los mais profundo para o guardião irá ajudar a mantê-los estáveis.</li>
</ol>7. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - canais Microstructured
<ol><li>Retirar o bloco PDMS estampado com microstructured canais (Figura 3B), utilizando uma pipeta de transferência até que o nível de E3 gotas abaixo da borda do bloco, mas ainda está presente no reservatório e canais e em uma camada fina sobre o PDMS E3.</li>
	<li>Transferi 10 embriões da etapa 5.3 para o reservatório, usando uma pipeta de transferência, tomando cuidado para não transbordar as bordas.</li>
	<li>Usando um laço de cabelo, manipular cada embrião dentro do funil na entrada do canal apropriado e orientar tais que a cabeça do embrião é em direção do canal e o embrião tem a orientação apropriada que entra o canal.</li>
	<li>Deslize cada embrião para baixo o canal usando um laço de cabelo até que ele atinja o orientador microfeatures das paredes do canal que ajudam a mantê-lo no lugar. Utilização de canais microstructured é particularmente recomendada para a orientação lateral. Nota: Para reduzir o embrião durante a microinjeção, tente ajustar a quantidade de tensão superficial por desenho E3 do reservatório.</li>
</ol>8. microinjection de Zebrafish
<ol><li>
Prepare a agulha microinjeção.
	<ol>
<li>Fazer conta de vidro de borosilicato agulhas usando um extrator de micropipeta como descrito anteriormente,4. As agulhas resultantes devem ser estreitadas a um ponto em uma extremidade, com um comprimento do atarraxamento de cerca de 10 mm.</li>
		<li>Preparar a solução a ser injetada, no presente caso 100 nM quimiotático (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) ou o leucotrieno B4 (LTB4)) e 100 nM de 70 kDa tracer de dextrano de rodamina em PBS.</li>
		<li>Carregar 5 µ l de solução para a agulha usando uma pipeta finamente cônico ponta (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Monte a agulha em um micromanipulador montado num suporte magnético e conectado a um microinjector de picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quebre a ponta da agulha em um ângulo de 45 ° beliscando a ponta cónica com fórceps.</li>
	<li>Ajustar tamanho de injeção em bolus de 1 nL, ajustando o tempo de injeção no controlador de picopump.</li>
	<li>Ajuste o ângulo da agulha microinjeção. Um ângulo da agulha de 45 ° no controlador de micromanipulação geralmente é um bom ponto de partida, com a agulha paralela ao comprimento do embrião. Um ângulo mais íngreme pode ser usado para minimizar o movimento lateral do embrião durante a microinjeção.</li>
	<li>Controlando a placa de Petri com a mão esquerda e o micromanipulador de agulha com o direito, trazer a agulha tão próximo quanto possível para o local pretendido da microinjeção, neste caso a vesícula ótica. Nota: A vesícula ótica pode ser identificada como o órgão oblongo posterior ao olho contendo dois menores distintas escuras oblongas estruturas (otólitos).</li>
	<li>Usando o controlador de micromanipulação, penetrar o tecido-alvo (no caso da vesícula ótica) tal que a ponta da agulha está dentro da vesícula e injetar o volume predefinido utilizando o interruptor de pé picopump. Nota: Se o tecido resiste à penetração, tente tocar suavemente o botão controlador de micromanipulação.</li>
	<li>Para liberar os embriões, fluxo E3 sobre a superfície de cima para baixo usando uma pipeta de transferência, ou agitando o prato tal que os embriões são libertados para a E3 circundante.</li>
	<li>Transferi os embriões para um prato de recuperação da E3 sem MS-222, usando uma pipeta de transferência.</li>
</ol>9. seleção de embriões utilizando o dispositivo de imagem PDMS
<ol><li>Prime o dispositivo da etapa 4.7 por fluxo E3 (+ MS-222) através da porta. Isso pode ser feito usando uma pipeta de 1.000 µ l ou uma pipeta de transferência de ponta estreita.</li>
	<li>Encha o poço com E3 + MS-222, até que o dispositivo é coberto.</li>
	<li>Entrega 4 embriões injetados da etapa 8,7 em cada poço usando uma pipeta de transferência. Embriões podem ser previamente anestesiados se desejado incubando na E3 + MS-222 por 1-2 min antes de carregar (etapa 5.3).</li>
	<li>Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), orientar os embriões nas entradas dos canais de imagem na orientação desejada (posição invertida ou cabeça primeiro, dependendo do dispositivo utilizado) e empurrá-los parcialmente no dispositivo (Figura 4A). Isso ajudará a atraí-los para o dispositivo uniformemente.</li>
	<li>Desenhe E3 através do dispositivo da porta, utilizando uma pipeta de 1.000 µ l ou pipeta de transferência até que os embriões são atraídos para os canais na orientação correta para a imagem (Figura 4B). Nota: Tenha cuidado para não chupar os embriões além do ponto de interceptação, isto danificará os embriões e alterar sua orientação.</li>
	<li>Transferência placa para microscópio de imagem (Figura 4).</li>
	<li>
Imagem usando um microscópio fluorescente invertido.
	<ol>
<li>Ajuste a ampliação selecionando a lente adequada. 10 X é geralmente uma ampliação útil para imagem latente do zebrafish migração dos neutrófilos.</li>
		<li>Ajuste a intensidade da fonte de luz e tempo de exposição para cada canal para que cada sinal é claro, mas não saturado.</li>
		<li>Capture imagens para cada canal. Aqui, usamos proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e transmitidos canais. Imagens multicanais podem ser combinadas durante o pós-processamento (Figura 4B-eu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Aqui, descrevemos o uso de dispositivos recentemente desenvolvemos para facilitar 2 dpf zebrafish microinjeção5e introduzir um dispositivo de montagem simples de agarose-livre para a imagem latente conveniente de embriões. Estas ferramentas destacam-se o utilitário de fotolitográfica técnicas para a fabricação de dispositivos úteis para as técnicas de zebrafish.
Encontramos dispositivos MSA particularmente útil para a injeção de células ou partículas prop...

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo para muitos campos, a partir de estudos de fundamental biologia do desenvolvimento de grande escala genética e química telas1,2. Rotina manipulações genéticas, tais como a superexpressão do gene, nocaute, CRISPR/Cas9 mutagênese e transgênese dependem de microinjeção de material genético para o zigoto unicelular, que levou ao desenvolvimento de simples, fácil de usar, comercialmente ferramentas disponíveis para orientar e estabilizar os ovos para injeção3. Outras abordagens, tais como transplante e infecção, muitas vezes exigem microinjection em posterior fase de embriões e larvas usando maior calibre capilar agulhas4. No entanto, a utilização de agulhas de calibre maiores apresenta desafios técnicos significativos, como é mais difícil de penetrar o tecido-alvo sem empurrar ou rolando o embrião. Nestas condições, obtendo a água adequada a tensão necessária para estabilizar o embrião enquanto evitando a secagem durante o procedimento é difícil e embriões não pode ser idealmente orientado para injeção no tecido-alvo.
Após microinjeção, é frequentemente útil para embriões injetados para selecionar aqueles que foram injetados com êxito e para capturar imagens do ponto inicial tempo de tela. Para enfrentar estes desafios, desenvolvemos uma gama de dispositivos microstructured que ajudam a estabilizar 2 embriões dpf em várias orientações para microinjeção5e para pós-injeção rápida triagem baseada em imagem.
Para obter uma resolução estrutural suficiente nestes dispositivos, utilizamos técnicas fotolitográfica. Comumente utilizado em indústrias de microeletrônicos e mais recentemente extrapolada para fabricação de microfluidic, essas abordagens podem alcançar estruturas verticais que variam de 1-1.000 µm, numa escala adequada para manipulação de zebrafish embriões e larvas. Todos os dispositivos foram fabricados usando polydimethylsiloxane (PDMS), que é mais barato, robusto fisicamente, biologicamente inerte e transparente.
Matrizes de superfície microstructured (MSAs) foram formatados como blocos de PDMS com uma superfície superior padronizada, análogo dos canais simples em blocos de agarose comumente usado para microinjeção de ovo. Para rastreio pós-injeção, 6 dispositivos de imagem podem ser dispostos em uma padrão com fundo de vidro 6 placa de. Estes dispositivos são projetados para facilitar o carregamento de embriões, enquanto o procedimento de descarga convenientemente permite resgate de embriões específicos, facilitando baseada em imagem abordagens de rastreio de uma forma mais amigável do que aqueles dispositivos anteriormente desenvolvido pela Beebe laboratório6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo de várias doenças humanas e uma ferramenta útil para uma gama crescente de estudos experimentais, abrangendo fundamentais da biologia do desenvolvimento através de telas em grande escala de genéticas e químicas. No entanto, muitas experiências, especialmente aqueles relacionados à infecção e modelos de enxerto heterólogo, dependem de microinjeção e imagem latente de embriões e larvas, que são técnicas laboriosas que exigem habilidade e experiência. Para melhorar a precisão e a taxa de transferência de técnicas de microinjeção atuais, desenvolvemos uma série de dispositivos microstructured orientar e estabilizar o zebrafish embriões na fertilização de post 2 dias (dpf) em orientação lateral, ventral ou dorsal, antes do procedimento. Para ajudar à imagem de embriões, criamos um dispositivo simples com canais que orientar 4 zebrafish lateralmente em paralelo contra uma lamela de vidro. Juntos, as ferramentas que apresentamos aqui demonstram a eficácia das abordagens fotolitográfica para gerar dispositivos úteis para a otimização das técnicas de zebrafish.

A abordagem descrita aqui demonstra o projeto (Figura 1) e fabricação de dispositivos para uso com 2 dpf zebrafish, usando fotolitográfica (Figura 2) e técnicas de macio-litografia (Figura 3). Este método permite testes rápidos de muitas iterações de projeto e as modificações e alterações e otimização de dimensões de microestrutura para uso com zebrafish em outras fases do desenvolvime...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K visualizações.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microinjeção para Transgénese e Genoma Edição na Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Imunohistoquímica do Monte Inteiro em Embriões e Larvas de Zebrafish

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

In situ Hibridização em Larvas de Zebrafish e Juvenis durante o Desenvolvimento de Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Usando coloração vermelha de alizarina para detectar perda óssea quimicamente induzida em larvas de peixe-zebra

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Modificação genética de organoides cerebrais de primatas

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Autor em destaque: Microinjeção direcionada e eletroporação de organoides cerebrais de primatas para modificação genética  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...