Name: microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae
Uploaded: 2017-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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Os autores gostaria de agradecer a David Langenau generosamente oferecendo espaço aquário; Eric Stone, John C. Moore e Qin Tang para ajudarem com a manutenção de zebrafish e reagentes e Anne Robertson e Elliott Hagedorn do laboratório de Leonard Zon para adquirir a zebrafish as estirpes utilizadas aqui. Também gostariam de agradecer conselhos sobre técnicas fotolitográfica Octavio Hurtado. FE foi patrocinada por bolsas do Hospital do Shriner para crianças e a associação americana do australiano. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder GM92804.

Microinjeção de larvas foi aprovada pelo Massachusetts General Hospital Subcomissão de pesquisa cuidado de Animal sob protocolo 2011N000127.
1. dispositivo fabricação
Nota: Todos os computador assistida (CAD) arquivos de desenho utilizados para a concepção de máscaras de fotolitografia descritas aqui (Figura 1) estão disponíveis para download. Consulte tabela de materiais para links.
<ol><li>Fabrica a bolacha de molde mestre em uma sala limpa de classe 1.000 usando técnicas padrão fotolitográfica7. Para os canais e matrizes de microestrutura, padrão o fotorresiste negativa baseada em epóxi sequencialmente em 3 camadas usando 3 máscaras separadas, de acordo com as instruções do fabricante: 100 µm para as características superficiais, 200 µm para as características médias e 400 µm para as características profundas. Para o dispositivo de imagem, padrão de duas camadas usando 400 µm para as características superficiais e 600 µm para os recursos do fundo.</li>
	<li>Fita a bolacha concluída para a base de um prato de Petri para fundição (Figura 2) de 15 cm.</li>
</ol>2. preparação de matrizes de superfície Microstructured - PDMS
<ol><li>Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco polydimethylsiloxane (PDMS), usando a bolacha mestre como um molde. Combine 50 g de monômero PDMS com 5 g de iniciador e misture bem em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.</li>
	<li>Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.</li>
	<li>Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.</li>
	<li>Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.</li>
	<li>Corte cuidadosamente ao redor do dispositivo sobre a bolacha mestre usando um bisturi, certificando-se de manter o contato entre a ponta do bisturi e a superfície da bolacha. Usando fórceps, descasque a réplica PDMS longe da bolacha e a transferência para um limpo cm 10 placa de Petri, lado de recurso para cima (Figura 3).</li>
	<li>Tratar o dispositivo com plasma de oxigênio utilizando um forno de plasma para 35 s para reduzir a hidrofobicidade.</li>
	<li>Cubra com meio de embrião de zebrafish (E3) contendo 168 mg/L de Metanossulfonato de etila 3-aminobenoate (MS-222, pH 7,5). Remover quaisquer bolhas de características mais profundas pelo fluxo de água sobre a superfície do dispositivo usando uma pipeta de transferência.</li>
</ol>3. preparação de matrizes de superfície Microstructured - Agarose
<ol><li>Para fazer um molde negativo de PDMS, primeiro trate um dispositivo PDMS com plasma de oxigênio.</li>
	<li>
Trate o dispositivo PDMS com 1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) vapor de silano para criar uma superfície inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Coloque o PDMS para ser tratada característica-lado-para cima em uma câmara de vácuo dentro de uma coifa.</li>
		<li>Ao lado do PDMS, coloque um pequeno prato de vidro ou alumínio aberto, e cuidadosamente Pipetar 200 µ l de PFDTS (98% silano) no prato. Cuidado: Silano PFDTS é altamente volátil, reage violentamente com a água, é inflamável e provoca graves danos de pele e olho no contato. MSDS de leitura em detalhe antes do uso.</li>
		<li>Fechar a câmara de vácuo e aplicar vácuo durante 15-30 minutos, ou até que o silano PFDTS é completamente evaporado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o dispositivo em um prato de Petri e usar como um molde para PDMS fresco, preparado como descrito no passo 2.1-2.3.</li>
	<li>Asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h, em seguida, descascar toda a camada de PDMS fresco do dispositivo de tratados e coloque em um prato de Petri fresco. Este então pode ser usado como um molde negativo para converter agarose.</li>
	<li>Para preparar a agarose, ferva uma solução de 2% de baixo coaguladas agarose de temperatura na E3 no microondas até a agarose é totalmente dissolvido.</li>
	<li>Despeje o agarose quente sobre o molde negativo de PDMS e remover quaisquer bolhas no agarose cobrindo o dispositivo por agarose quente fluindo sobre as características de uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Uma vez que as bolhas são removidas, refrigere a 4 ° C, para definir o agarose.</li>
	<li>Retire o molde negativo de PDMS por deformar o PDMS de baixo com a mão o bloco de agarose, transferir o bloco de agarose para uma nova placa de Petri e molhado com E3 contendo MS-222.</li>
</ol>4. preparação de PDMS dispositivos de imagem
<ol><li>Para tornar utilizáveis dispositivos, elenco PDMS, usando a bolacha mestre como um molde. 50 g de monômero PDMS aliam 5g de iniciador (o mesmo que usou na etapa 2.1) e misture cuidadosamente em um plástico, prato de pesagem com um garfo de plástico.</li>
	<li>Despeje a mistura sobre o molde com cuidado.</li>
	<li>Desgaseificar num exsicador de vácuo no 16-25 pol Hg (54-85 kPa) por 1h.</li>
	<li>Para curar o PDMS, asse a 65 ° C, durante pelo menos 3 h. O PDMS deve curar a um sólido, firme, mas flexível.</li>
	<li>Corte os dispositivos a bolacha de mestre e um soco para fora de portas usando um soco de 1,5 mm.</li>
	<li>Tratar os dispositivos e um vidro de 6-poços-fundo bem placa com plasma de oxigênio por 35 s, conforme descrito na etapa 2.6.</li>
	<li>Ligação de um dispositivo característica-lado-para baixo para cada lamela de vidro da placa 6-poços, colocando-o sobre uma chapa de 85 ° C por 10 min. Nota: Para confirmar a ligação bem sucedida, aplique pressão firme ao lado do dispositivo ligado usando fórceps. O dispositivo deve permanecer anexado para a lamela de vidro.</li>
</ol>5. Zebrafish cultura
<ol><li>Embriões de zebrafish cultura para dpf 2 usando técnicas padrão3.</li>
	<li>Dechorionate de embriões utilizando protease fórceps ou 1 mg/mL misturar (veja a tabela dos materiais)3 pelo menos 30 a 60 minutos antes da carga de dispositivo, que permita a endireitar.</li>
	<li>Anestesiar embriões utilizando solução-mãe (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5), adicionando 1 mL de 25 X para a E3 em sua placa de Petri.</li>
</ol>6. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - matrizes do torrão
<ol><li>Prepare o bloco PDMS da etapa 2.7 (Figura 3A) em sua placa de Petri, tal que é coberto por uma camada fina (1-2 mm) da E3, que permite a fácil manipulação de embriões.</li>
	<li>Transferi o número necessário de embriões (geralmente de 10-20 por condição) para a superfície do bloco de PDMS utilizando uma pipeta de transferência.</li>
	<li>Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), empurrar os embriões para os divots microstructured (Figura 3A). Uso de divots é particularmente adequado para orientações dorsais e ventrais. Nota: Para os divots com um apertado caber (dorsal e ventral), tente os embriões de posicionamento na superfície do bloco em paralelo para o guardião e então rolá-los em posição usando um laço de cabelo. A empurrá-los mais profundo para o guardião irá ajudar a mantê-los estáveis.</li>
</ol>7. orientação do Zebrafish na superfície Microstructured - canais Microstructured
<ol><li>Retirar o bloco PDMS estampado com microstructured canais (Figura 3B), utilizando uma pipeta de transferência até que o nível de E3 gotas abaixo da borda do bloco, mas ainda está presente no reservatório e canais e em uma camada fina sobre o PDMS E3.</li>
	<li>Transferi 10 embriões da etapa 5.3 para o reservatório, usando uma pipeta de transferência, tomando cuidado para não transbordar as bordas.</li>
	<li>Usando um laço de cabelo, manipular cada embrião dentro do funil na entrada do canal apropriado e orientar tais que a cabeça do embrião é em direção do canal e o embrião tem a orientação apropriada que entra o canal.</li>
	<li>Deslize cada embrião para baixo o canal usando um laço de cabelo até que ele atinja o orientador microfeatures das paredes do canal que ajudam a mantê-lo no lugar. Utilização de canais microstructured é particularmente recomendada para a orientação lateral. Nota: Para reduzir o embrião durante a microinjeção, tente ajustar a quantidade de tensão superficial por desenho E3 do reservatório.</li>
</ol>8. microinjection de Zebrafish
<ol><li>
Prepare a agulha microinjeção.
	<ol>
<li>Fazer conta de vidro de borosilicato agulhas usando um extrator de micropipeta como descrito anteriormente,4. As agulhas resultantes devem ser estreitadas a um ponto em uma extremidade, com um comprimento do atarraxamento de cerca de 10 mm.</li>
		<li>Preparar a solução a ser injetada, no presente caso 100 nM quimiotático (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) ou o leucotrieno B4 (LTB4)) e 100 nM de 70 kDa tracer de dextrano de rodamina em PBS.</li>
		<li>Carregar 5 µ l de solução para a agulha usando uma pipeta finamente cônico ponta (ver tabela de materiais).</li>
		<li>Monte a agulha em um micromanipulador montado num suporte magnético e conectado a um microinjector de picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quebre a ponta da agulha em um ângulo de 45 ° beliscando a ponta cónica com fórceps.</li>
	<li>Ajustar tamanho de injeção em bolus de 1 nL, ajustando o tempo de injeção no controlador de picopump.</li>
	<li>Ajuste o ângulo da agulha microinjeção. Um ângulo da agulha de 45 ° no controlador de micromanipulação geralmente é um bom ponto de partida, com a agulha paralela ao comprimento do embrião. Um ângulo mais íngreme pode ser usado para minimizar o movimento lateral do embrião durante a microinjeção.</li>
	<li>Controlando a placa de Petri com a mão esquerda e o micromanipulador de agulha com o direito, trazer a agulha tão próximo quanto possível para o local pretendido da microinjeção, neste caso a vesícula ótica. Nota: A vesícula ótica pode ser identificada como o órgão oblongo posterior ao olho contendo dois menores distintas escuras oblongas estruturas (otólitos).</li>
	<li>Usando o controlador de micromanipulação, penetrar o tecido-alvo (no caso da vesícula ótica) tal que a ponta da agulha está dentro da vesícula e injetar o volume predefinido utilizando o interruptor de pé picopump. Nota: Se o tecido resiste à penetração, tente tocar suavemente o botão controlador de micromanipulação.</li>
	<li>Para liberar os embriões, fluxo E3 sobre a superfície de cima para baixo usando uma pipeta de transferência, ou agitando o prato tal que os embriões são libertados para a E3 circundante.</li>
	<li>Transferi os embriões para um prato de recuperação da E3 sem MS-222, usando uma pipeta de transferência.</li>
</ol>9. seleção de embriões utilizando o dispositivo de imagem PDMS
<ol><li>Prime o dispositivo da etapa 4.7 por fluxo E3 (+ MS-222) através da porta. Isso pode ser feito usando uma pipeta de 1.000 µ l ou uma pipeta de transferência de ponta estreita.</li>
	<li>Encha o poço com E3 + MS-222, até que o dispositivo é coberto.</li>
	<li>Entrega 4 embriões injetados da etapa 8,7 em cada poço usando uma pipeta de transferência. Embriões podem ser previamente anestesiados se desejado incubando na E3 + MS-222 por 1-2 min antes de carregar (etapa 5.3).</li>
	<li>Usando uma ferramenta de micromanipulação (laço de cabelo ou similar), orientar os embriões nas entradas dos canais de imagem na orientação desejada (posição invertida ou cabeça primeiro, dependendo do dispositivo utilizado) e empurrá-los parcialmente no dispositivo (Figura 4A). Isso ajudará a atraí-los para o dispositivo uniformemente.</li>
	<li>Desenhe E3 através do dispositivo da porta, utilizando uma pipeta de 1.000 µ l ou pipeta de transferência até que os embriões são atraídos para os canais na orientação correta para a imagem (Figura 4B). Nota: Tenha cuidado para não chupar os embriões além do ponto de interceptação, isto danificará os embriões e alterar sua orientação.</li>
	<li>Transferência placa para microscópio de imagem (Figura 4).</li>
	<li>
Imagem usando um microscópio fluorescente invertido.
	<ol>
<li>Ajuste a ampliação selecionando a lente adequada. 10 X é geralmente uma ampliação útil para imagem latente do zebrafish migração dos neutrófilos.</li>
		<li>Ajuste a intensidade da fonte de luz e tempo de exposição para cada canal para que cada sinal é claro, mas não saturado.</li>
		<li>Capture imagens para cada canal. Aqui, usamos proteína verde fluorescente (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e transmitidos canais. Imagens multicanais podem ser combinadas durante o pós-processamento (Figura 4B-eu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Aqui, descrevemos o uso de dispositivos recentemente desenvolvemos para facilitar 2 dpf zebrafish microinjeção5e introduzir um dispositivo de montagem simples de agarose-livre para a imagem latente conveniente de embriões. Estas ferramentas destacam-se o utilitário de fotolitográfica técnicas para a fabricação de dispositivos úteis para as técnicas de zebrafish.
Encontramos dispositivos MSA particularmente útil para a injeção de células ou partículas prop...

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo para muitos campos, a partir de estudos de fundamental biologia do desenvolvimento de grande escala genética e química telas1,2. Rotina manipulações genéticas, tais como a superexpressão do gene, nocaute, CRISPR/Cas9 mutagênese e transgênese dependem de microinjeção de material genético para o zigoto unicelular, que levou ao desenvolvimento de simples, fácil de usar, comercialmente ferramentas disponíveis para orientar e estabilizar os ovos para injeção3. Outras abordagens, tais como transplante e infecção, muitas vezes exigem microinjection em posterior fase de embriões e larvas usando maior calibre capilar agulhas4. No entanto, a utilização de agulhas de calibre maiores apresenta desafios técnicos significativos, como é mais difícil de penetrar o tecido-alvo sem empurrar ou rolando o embrião. Nestas condições, obtendo a água adequada a tensão necessária para estabilizar o embrião enquanto evitando a secagem durante o procedimento é difícil e embriões não pode ser idealmente orientado para injeção no tecido-alvo.
Após microinjeção, é frequentemente útil para embriões injetados para selecionar aqueles que foram injetados com êxito e para capturar imagens do ponto inicial tempo de tela. Para enfrentar estes desafios, desenvolvemos uma gama de dispositivos microstructured que ajudam a estabilizar 2 embriões dpf em várias orientações para microinjeção5e para pós-injeção rápida triagem baseada em imagem.
Para obter uma resolução estrutural suficiente nestes dispositivos, utilizamos técnicas fotolitográfica. Comumente utilizado em indústrias de microeletrônicos e mais recentemente extrapolada para fabricação de microfluidic, essas abordagens podem alcançar estruturas verticais que variam de 1-1.000 µm, numa escala adequada para manipulação de zebrafish embriões e larvas. Todos os dispositivos foram fabricados usando polydimethylsiloxane (PDMS), que é mais barato, robusto fisicamente, biologicamente inerte e transparente.
Matrizes de superfície microstructured (MSAs) foram formatados como blocos de PDMS com uma superfície superior padronizada, análogo dos canais simples em blocos de agarose comumente usado para microinjeção de ovo. Para rastreio pós-injeção, 6 dispositivos de imagem podem ser dispostos em uma padrão com fundo de vidro 6 placa de. Estes dispositivos são projetados para facilitar o carregamento de embriões, enquanto o procedimento de descarga convenientemente permite resgate de embriões específicos, facilitando baseada em imagem abordagens de rastreio de uma forma mais amigável do que aqueles dispositivos anteriormente desenvolvido pela Beebe laboratório6.

<table><tbody><tr><td>Dow Corning Sylgard 184 Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhsives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td></tr><tr><td>Low gelling temperature agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-10G</td><td>For casting agarose devices</td></tr><tr><td>PFDTS silane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931-10G</td><td>For casting of negative PDMS molds</td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>To anesthetize zebrafish</td></tr><tr><td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td><td>ThermoFisher</td><td>D1818</td><td>To trace microinjections</td></tr><tr><td>Leukotriene B4 (LTB4)</td><td>Cayman Chemicals</td><td>20110</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3506-50MG</td><td>Neutrophil chemoattractant</td></tr><tr><td>15 cm Petri dish</td><td>Fisher scientific</td><td>08-757-148</td><td>For Casting from the master wafer</td></tr><tr><td>Glass-bottom 6-well plates</td><td>MatTek</td><td>P06G-0-20-F</td><td>For imaging devices</td></tr><tr><td>Borosilicate glass microcapillaries</td><td>World Scientific Instruments</td><td>TW-100-4</td><td>For microinjection needles</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z350796</td><td>For transferring zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Fisher scientific</td><td>E5242956003</td><td>For loading the microinjection needles</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15111-15</td><td>To punch ports in PDMS imaging devices</td></tr><tr><td>No. 11 Scalpel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td>For cutting PDMS</td></tr><tr><td>Dumont No. 5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-10</td><td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td></tr><tr><td>Marzhauser Micromanipulator</td><td>ASI</td><td>MM33-R</td><td>For manipulating microinjection needle</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>MSC</td><td>SPI - 87242624</td><td>For mounting micromanipulator</td></tr><tr><td>MPPI-3 Picopump controller</td><td>ASI</td><td>MPPI-3</td><td>To control microinjection volume and timing</td></tr><tr><td>EVOS inverted fluorescent microscope</td><td>ThermoFisher</td><td>EVOS FL</td><td>To image injected embryos</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>For visualizing microinjecion</td></tr><tr><td>AutoCAD software</td><td>Autodesk</td><td></td><td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish emergiram como um poderoso modelo de várias doenças humanas e uma ferramenta útil para uma gama crescente de estudos experimentais, abrangendo fundamentais da biologia do desenvolvimento através de telas em grande escala de genéticas e químicas. No entanto, muitas experiências, especialmente aqueles relacionados à infecção e modelos de enxerto heterólogo, dependem de microinjeção e imagem latente de embriões e larvas, que são técnicas laboriosas que exigem habilidade e experiência. Para melhorar a precisão e a taxa de transferência de técnicas de microinjeção atuais, desenvolvemos uma série de dispositivos microstructured orientar e estabilizar o zebrafish embriões na fertilização de post 2 dias (dpf) em orientação lateral, ventral ou dorsal, antes do procedimento. Para ajudar à imagem de embriões, criamos um dispositivo simples com canais que orientar 4 zebrafish lateralmente em paralelo contra uma lamela de vidro. Juntos, as ferramentas que apresentamos aqui demonstram a eficácia das abordagens fotolitográfica para gerar dispositivos úteis para a otimização das técnicas de zebrafish.

A abordagem descrita aqui demonstra o projeto (Figura 1) e fabricação de dispositivos para uso com 2 dpf zebrafish, usando fotolitográfica (Figura 2) e técnicas de macio-litografia (Figura 3). Este método permite testes rápidos de muitas iterações de projeto e as modificações e alterações e otimização de dimensões de microestrutura para uso com zebrafish em outras fases do desenvolvime...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

Microstructured dispositivos para Microinjection otimizado e imagem latente de larvas de Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K visualizações.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microinjeção de zebrafish embriões e larvas é uma técnica crucial mas desafiador, usada em muitos modelos de zebrafish. Aqui, apresentamos uma gama de ferramentas de microescala para auxiliar na estabilização e orientação do zebrafish para microinjeção e a imagem latente.

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Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengenharia

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Biologia do Desenvolvimento

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced in vivo throughout the rapid developmental period. Multiple processes can be studied including cell proliferation, gene expression, cell migration and morphogenesis. Importantly, the generation of chimeras through transplantations can be easily performed, allowing mosaic labeling and tracking of individual cells under the influence of the host environment. For example, by combining functional gene manipulations of the host embryo (e.g., through morpholino microinjection) and live imaging, the effects of extrinsic, cell nonautonomous signals (provided by the genetically modified environment) on individual transplanted donor cells can be assessed. Here we demonstrate how this approach is used to compare the onset of fluorescent transgene expression as a proxy for the timing of cell fate determination in different genetic host environments.
In this article, we provide the protocol for microinjecting zebrafish embryos to mark donor cells and to cause gene knockdown in host embryos, a description of the transplantation technique used to generate chimeric embryos, and the protocol for preparing and running in vivo time-lapse confocal imaging of multiple embryos. In particular, performing multiposition imaging is crucial when comparing timing of events such as the onset of gene expression. This requires data collection from multiple control and experimental embryos processed simultaneously. Such an approach can easily be extended for studies of extrinsic influences in any organ or tissue of choice accessible to live imaging, provided that transplantations can be targeted easily according to established embryonic fate maps.

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Live tracking of individual WT retinal progenitors in distinct genetic backgrounds allows for the assessment of the contribution of cell non-autonomous signaling during neurogenesis. Here, a combination of gene knockdown, chimera generation via embryo transplantation and in vivo time-lapse confocal imaging was utilized for this purpose.

In vivo de imagens de Gene Transgenic Expressão em Individual Retinal Progenitores em embriões Zebrafish Quimérico para estudar celular Influências não-autônomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Vivem de imagem do cérebro Zebrafish embrionárias por microscopia confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neurociência

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Low-cost Polyethylene Terephthalate Lamination Microfluidics Designs for Multiplexed Zebrafish Imaging

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune cell migration. Microfluidic devices are used for entrapment to support long-term imaging of multicellular organisms, including zebrafish. However, the fabrication of these devices using soft lithography requires specialized facilities and competency in 3D printing, which may not be accessible to every lab. Our adaptation of a previously developed low-cost polyethylene terephthalate lamination method for constructing microfluidic devices increases accessibility by enabling design fabrication and iteration for a fraction of the technical investment of conventional techniques. We use a device made with this method, the Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing (RADISH), to accommodate drug treatment, manual wounding, and long-term imaging of up to four embryos in the same field of view. With this new design, we successfully capture gross morphological characteristics of the calcium&#160;signal around laser ablation and manual transection wounds for multiple embryos in the 2 h immediately following injury, as well as neutrophil recruitment to the wound edge for 24 h.

An innovative method for fabricating microfluidic devices using polyethylene terephthalate (PET) lamination significantly reduces the cost and complexity of entrapping and imaging multiple live zebrafish embryos.

Zebrafish embryos are transparent and thus uniquely suited for noninvasive intravital imaging of fundamental processes, such as wound healing and immune ...