Gli autori vorrei ringraziare David Langenau per generosamente offrendo spazio acquario; Eric Stone, John e Qin Tang per aiutare con manutenzione di zebrafish e reagenti e Anne Robertson ed Elliott Hagedorn dal laboratorio di Leonard Zon per procurare il ceppo di zebrafish utilizzato qui. Vorrebbero anche grazie a Octavio Hurtado per consigli sulle tecniche fotolitografiche. FE è stato finanziato da borse di studio dal Hospital di Shriner per bambini e l'American Association australiana. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH concedere GM92804.

Microinjection delle larve è stato approvato dalla Massachusetts General Hospital sottocommissione per ricerca Animal Care sotto protocollo 2011N000127.
1. fabbricazione di dispositivi
Nota: Tutti i assistita da computer (CAD) file di disegno utilizzati per la progettazione di maschere di fotolitografia descritte qui (Figura 1) sono disponibili per il download. Vedi tabella materiali per i collegamenti.
<ol><li>Fabbricare il wafer di stampo master in camera bianca classe 1.000 utilizzando tecniche fotolitografiche standard7. Per le matrici di microstruttura e canali, modello il photoresist negativo a base epossidica in sequenza a 3 strati usando 3 maschere separate, secondo le istruzioni del produttore: 100 µm per le caratteristiche superficiali, 200 µm per le caratteristiche medie e 400 µm per le caratteristiche profonde. Per il dispositivo di imaging, modello due strati utilizzando 400 µm per le caratteristiche superficiali e 600 µm per le caratteristiche profonde.</li>
	<li>Nastro la cialda completata alla base di un 15 cm di Petri per colata (Figura 2).</li>
</ol>2. preparazione di matrici superficie microstrutturate - PDMS
<ol><li>Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast polidimetilsilossano (PDMS), utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.</li>
	<li>Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.</li>
	<li>Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.</li>
	<li>Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.</li>
	<li>Accuratamente tagliato intorno al dispositivo sul wafer master utilizzando un bisturi, assicurandosi di mantenere il contatto tra la punta del bisturi e la superficie del wafer. Usando il forcipe, sbucciare la replica PDMS lontano la cialda e il trasferimento a un pulito 10 cm di Petri, lato di funzionalità (Figura 3).</li>
	<li>Trattare il dispositivo con il plasma di ossigeno utilizzando un forno al plasma per 35 s per ridurre idrofobicità.</li>
	<li>Coprire con il supporto di embrione di zebrafish (E3) che contiene 168 mg/L di etile 3-aminobenoate methanesulfonate (MS-222, pH 7.5). Rimuovi qualsiasi bolle da più profonde caratteristiche di flusso d'acqua sopra la superficie del dispositivo utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
</ol>3. preparazione di matrici superficie microstrutturate - agarosio
<ol><li>Per fare uno stampo negativo di PDMS, in primo luogo trattare un dispositivo PDMS con plasma ad ossigeno.</li>
	<li>
Trattare il dispositivo PDMS con 1H, 1H, 2H, 2Hvapor di silano - Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) per creare una superficie inerte8. Brevemente:
	<ol>
<li>Posto il PDMS essere trattata caratteristica-side-up in una camera a vuoto all'interno di una cappa aspirante.</li>
		<li>Accanto il PDMS, posizionare un piccolo piatto di vetro o alluminio aperto e attentamente Pipettare 200 µ l di PFDTS (98% Silano) nel piatto. Attenzione: Silano PFDTS è altamente volatile, reagisce violentemente con l'acqua, è infiammabile e causa gravi danni della pelle e degli occhi sul contatto. Leggi MSDS in dettaglio prima dell'uso.</li>
		<li>Chiudere la camera a vuoto e applicare il vuoto per 15-30 minuti, o fino a quando il silano PFDTS è completamente evaporato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Collocare il dispositivo in una capsula di Petri e utilizzare come uno stampo per PDMS fresco, preparato come descritto al punto 2.1-2.3.</li>
	<li>Cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore, poi sbucciare l'intero livello di PDMS fresco dal dispositivo trattato e posto in una capsula Petri fresco. Quindi utilizzabile come uno stampo negativo per eseguire il cast dell'agarosi.</li>
	<li>Per preparare dell'agarosi, far bollire una soluzione di 2% di basso gelificante temperatura agarosio in E3 in un forno a microonde finchè l'agarosio sia completamente dissolto.</li>
	<li>Versare l'agarosio caldo sopra lo stampo negativo di PDMS e rimuovere tutte le bolle in agarosio che copre il dispositivo di agarosio caldo che scorre oltre le caratteristiche con una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Una volta che bolle vengono rimossi, conservare in frigorifero a 4 ° C per impostare l'agarosio.</li>
	<li>Rimuovere il blocco di agarosio dallo stampo negativo PDMS deformando il PDMS da sotto a mano, trasferimento del blocco di agarosio per una nuova piastra di Petri e bagnarlo con E3 contenente MS-222.</li>
</ol>4. preparazione di PDMS periferiche di Imaging
<ol><li>Per rendere utilizzabile dispositivi, eseguire il cast PDMS, utilizzando il master wafer come uno stampo. 50 g di monomero PDMS si combinano con 5 g di iniziatore (uguale a quello usato nel passaggio 2.1) e mescolare accuratamente in un piatto di pesatura con una forchetta di plastica di plastica.</li>
	<li>Versare il composto con attenzione sopra lo stampo.</li>
	<li>Degas in un essiccatore sotto vuoto a 16-25 inHg (54-85 kPa) per 1 h.</li>
	<li>Per curare il PDMS, cuocere in forno a 65 ° C per almeno 3 ore. Il PDMS dovrebbe curare un solido duro ma flessibile.</li>
	<li>Tagliare i dispositivi da Master Wafer e punch out porte usando un punzone di 1,5 mm.</li>
	<li>Trattare i dispositivi e un 6-pozzetti con fondo di vetro ben piatto con plasma ad ossigeno per 35 s, come descritto al punto 2.6.</li>
	<li>Legame uno dispositivo funzionalità-lato-giù per ogni vetrino coprioggetti della piastra 6 pozzetti inserendolo in una piastra di 85 ° C per 10 min. Nota: Per confermare il successo incollaggio, applicare la pressione costante su un lato del dispositivo incollato usando il forcipe. Il dispositivo dovrebbe rimanere il vetrino coprioggetti.</li>
</ol>5. Zebrafish cultura
<ol><li>Embrioni di zebrafish di cultura a 2 dpf utilizzando tecniche standard3.</li>
	<li>Dechorionate embrioni usando proteasi forcipe o 1 mg/mL mix (Vedi materiali tavolo)3 almeno 30-60 minuti prima di caricarli sul dispositivo, per consentire loro di raddrizzare.</li>
	<li>Anestetizzare embrioni usando la soluzione di riserva (168 mg/L) MS-222 (pH 7,5) aggiungendo 1 mL di 25x per l'E3 in loro di Petri.</li>
</ol>6. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - Divot matrici
<ol><li>Preparare il blocco PDMS da passo 2.7 (Figura 3A) nella sua scatola di Petri tale che è coperto da uno strato sottile (1-2 mm) di E3, che permette una più facile manipolazione degli embrioni.</li>
	<li>Trasferire il numero necessario di embrioni (in genere 10-20 a condizione) sulla superficie del blocco PDMS utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), spingere gli embrioni il divots microstrutturata (Figura 3A). Utilizzo di divots è particolarmente indicato per gli orientamenti dorsali e ventrali. Nota: Per le punte con un più stretto misura (dorsale e ventrale), provare gli embrioni di posizionamento sulla superficie del blocco in parallelo con il divot e poi rotolare nella posizione usando un ciclo dei capelli. Spingendoli più profondo nel divot aiuterà a tenerli stabili.</li>
</ol>7. orientamento di Zebrafish sulla superficie microstrutturata - microstrutturate canali
<ol><li>Disegnare E3 il blocco di PDMS modellato con canali microstrutturate (Figura 3B) usando una pipetta di trasferimento fino a quando il livello di E3 scende di sotto del bordo del blocco, ma è ancora presente nel serbatoio e canali e in uno strato sottile sul PDMS.</li>
	<li>Trasferire 10 embrioni dal punto 5.3 nel serbatoio utilizzando una pipetta di trasferimento, facendo attenzione a non i bordi sfioratori.</li>
	<li>Utilizzando un ciclo di capelli, manipolare ogni embrione nell'imbuto all'ingresso del canale appropriato e orientare tale che la testa dell'embrione è verso il canale e l'embrione ha l'orientamento appropriato come entra nel canale.</li>
	<li>Far scorrere ogni embrione giù il canale utilizzando un ciclo di capelli fino a raggiungere la microfeatures orientante nelle pareti del canale che aiutano a tenerlo in posizione. Uso dei canali microstrutturate è particolarmente indicato per l'orientamento laterale. Nota: Per ridurre l'embrione scorrevole durante la microiniezione, provare a regolare la quantità di tensione superficiale disegnando E3 dal serbatoio.</li>
</ol>8. microiniezione di Zebrafish
<ol><li>
Preparare l'ago per microiniezione.
	<ol>
<li>Fare vetro borosilicato microcapillary aghi utilizzando un estrattore micropipetta come descritto in precedenza4. Gli aghi risultanti devono essere diminuito gradualmente in un punto ad un'estremità, con una lunghezza conica di circa 10 mm.</li>
		<li>Preparare la soluzione da iniettare, in questo caso 100 nM chemoattractant (N-Formylmethionine-leucyl-fenilalanina (fMLP) o il leucotriene B4 (LTB4)) e 100 nM di 70 kDa tracciante di destrano rodamina in PBS.</li>
		<li>Caricare l'ago usando una pipetta finemente affusolata 5 µ l di soluzione di punta (vedere tabella materiali).</li>
		<li>Montare l'ago in un micromanipolatore montato su un supporto magnetico e collegato ad un microinjector picopump.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rompere la punta dell'ago a un angolo di 45 ° pizzicando la punta conica con il forcipe.</li>
	<li>Regolare la dimensione del bolo iniezione a 1 nL regolando il tempo di iniezione sul controller picopump.</li>
	<li>Regolare l'angolo dell'ago microiniezione. Un angolo di ago di 45 ° sul controller di micromanipolazione è generalmente un buon punto di partenza, con l'ago parallelo alla lunghezza dell'embrione. Un angolo più ripido può essere utilizzato per minimizzare il movimento laterale dell'embrione durante la microiniezione.</li>
	<li>Controllo di Petri con la mano sinistra e il micromanipolatore di ago con la destra, portare l'ago più vicino possibile al sito desiderato di microiniezione, in questo caso la vescicola otica. Nota: La vescicola otica può essere identificata come l'organo oblunga posteriore dell'occhio che contiene due più piccolo scure oblunghe strutture distinte (otoliti).</li>
	<li>Utilizzando il controller di micromanipolazione, penetrare il tessuto bersaglio (in questo caso la vescicola otica) tale che la punta dell'ago è all'interno della vescicola e iniettare il volume preimpostato utilizzando l'interruttore a pedale picopump. Nota: Se il tessuto resiste alla penetrazione, provare picchiettando delicatamente la manopola del regolatore di micromanipolazione.</li>
	<li>Per rilasciare gli embrioni, flusso E3 sopra la superficie da cima a fondo utilizzando una pipetta di trasferimento, o agitando il piatto, tale che gli embrioni vengono rilasciati in E3 circostanti.</li>
	<li>Trasferire gli embrioni per un piatto di recupero di E3 senza MS-222 utilizzando una pipetta di trasferimento.</li>
</ol>9. selezione degli embrioni usando il dispositivo di Imaging di PDMS
<ol><li>Primo il dispositivo da passo 4.7 per fluire E3 (+ MS-222) attraverso la porta. Questo può essere fatto utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o una stretta-punta delle pipette.</li>
	<li>Riempire il pozzetto con E3 + MS-222, fino a quando il dispositivo è coperto.</li>
	<li>Consegnare 4 embrioni iniettati dal passaggio 8,7 in ogni pozzetto usando una pipetta di trasferimento. Gli embrioni possono essere pre-anestetizzati se desiderato incubando in E3 + MS-222 per 1-2 min prima del caricamento (punto 5.3).</li>
	<li>Utilizzando uno strumento di micromanipolazione (ciclo dei capelli o simili), orientare gli embrioni presso gli ingressi dei canali imaging l'orientamento desiderato (coda-primo o testa prima, a seconda del dispositivo utilizzato) e spingerli parzialmente nel dispositivo (Figura 4A). Questo vi aiuterà a disegnarli in modo uniforme nel dispositivo.</li>
	<li>Disegnare E3 attraverso il dispositivo dalla porta utilizzando una pipetta di 1.000 µ l o pipetta fino a quando gli embrioni sono disegnati nei canali con l'orientamento corretto per l'imaging (Figura 4B). Nota: Fare attenzione a non succhiare gli embrioni oltre il punto di cattura, questo danneggerà gli embrioni e alterare il loro orientamento.</li>
	<li>Trasferimento piastra al microscopio per imaging (Figura 4).</li>
	<li>
Immagine utilizzando un microscopio invertito a fluorescenza.
	<ol>
<li>Regolare ingrandimento selezionando la lente appropriata. 10 X è di solito un ingrandimento utile per l'imaging di migrazione del neutrofilo zebrafish.</li>
		<li>Regolare la sorgente luminosa intensità e tempo di esposizione per ogni canale affinché ogni segnale è chiaro, ma non saturo.</li>
		<li>Catturare immagini per ogni canale. Qui, abbiamo usato la proteina fluorescente verde (GFP, Ex: 470/22, Em: 525/50), Texas Red (TxRed, Ex: 585/29, Em: 628/32) e canali di trasmissione. Immagini multicanale possono essere combinati in fase di elaborazione (Figura 4B-io).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Dang, M., Fogley, R., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+Novel+Cancer+Therapies+Using+Chemical+Genetics+and+Zebrafish.">Identifying Novel Cancer Therapies Using Chemical Genetics and Zebrafish.</a> Adv Exp Med Biol. 916, 103-124 (2016).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li><li>Ellett, F., Irimia, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microstructured+Surface+Arrays+for+Injection+of+Zebrafish+Larvae.">Microstructured Surface Arrays for Injection of Zebrafish Larvae.</a> Zebrafish. 14 (2), 140-145 (2017).</li><li>Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+Entrapment+By+Restriction+Array+(ZEBRA)+device:+a+low-cost,+agarose-free+zebrafish+mounting+technique+for+automated+imaging.">Zebrafish Entrapment By Restriction Array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging.</a> Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).</li><li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices.">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li><li>Shao, G., Wu, J., Cai, Z., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+elastomeric+high-aspect-ratio+microstructures+using+polydimethylsiloxane+(PDMS)+double+casting+technique.">Fabrication of elastomeric high-aspect-ratio microstructures using polydimethylsiloxane (PDMS) double casting technique.</a> Sens Actuators A Phys. 178, 230-236 (2012).</li><li>Bhuiyan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acinetobacter+baumannii+phenylacetic+acid+metabolism+influences+infection+outcome+through+a+direct+effect+on+neutrophil+chemotaxis.">Acinetobacter baumannii phenylacetic acid metabolism influences infection outcome through a direct effect on neutrophil chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), 9599-9604 (2016).</li><li>Henry, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhagoSight:+an+open-source+MATLAB&#174;+package+for+the+analysis+of+fluorescent+neutrophil+and+macrophage+migration+in+a+zebrafish+model.">PhagoSight: an open-source MATLAB&#174; package for the analysis of fluorescent neutrophil and macrophage migration in a zebrafish model.</a> PloS one. 8 (8), e72636 (2013).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynam. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Hemmil&#228;, S., Cauich-Rodr&#237;guez, J. V., Kreutzer, J., Kallio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+simple,+and+cost-effective+treatments+to+achieve+long-term+hydrophilic+PDMS+surfaces.">Rapid, simple, and cost-effective treatments to achieve long-term hydrophilic PDMS surfaces.</a> Applied Surface Science. 258 (24), 9864-9875 (2012).</li><li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae.">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li><li>Yang, F., Gao, C., Wang, P., Zhang, G. J., Chen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish-on-a-chip:+microfluidics+for+zebrafish+research.">Fish-on-a-chip: microfluidics for zebrafish research.</a> Lab Chip. 16 (7), 1106-1125 (2016).</li><li>Wielhouwer, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+development+in+a+microfluidic+flow-through+system.">Zebrafish embryo development in a microfluidic flow-through system.</a> Lab Chip. 11 (10), 1815-1824 (2011).</li><li>Shen, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+student+team+in+a+University+of+Michigan+biomedical+engineering+design+course+constructs+a+microfluidic+bioreactor+for+studies+of+zebrafish+development.">A student team in a University of Michigan biomedical engineering design course constructs a microfluidic bioreactor for studies of zebrafish development.</a> Zebrafish. 6 (2), 201-213 (2009).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+on+a+chip:+a+novel+platform+for+real-time+monitoring+of+drug-induced+developmental+toxicity.">Zebrafish on a chip: a novel platform for real-time monitoring of drug-induced developmental toxicity.</a> PLoS One. 9 (4), e94792 (2014).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+embryo+array+for+automated+trapping,+immobilization+and+microperfusion+of+zebrafish+embryos.">Miniaturized embryo array for automated trapping, immobilization and microperfusion of zebrafish embryos.</a> PLoS One. 7 (5), e36630 (2012).</li><li>Akagi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fish+on+chips:+Microfluidic+living+embryo+array+for+accelerated+in+vivo+angiogenesis+assays.">Fish on chips: Microfluidic living embryo array for accelerated in vivo angiogenesis assays.</a> Sens Actuators B Chem. 189, 11-20 (2013).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+brain-wide+activity+in+awake+and+drug-responsive+vertebrates.">High-throughput mapping of brain-wide activity in awake and drug-responsive vertebrates.</a> Lab Chip. 15 (3), 680-689 (2015).</li><li>Noori, A., Selvaganapathy, P. R., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+in+a+microfluidic+format+using+flexible+and+compliant+channels+and+electroosmotic+dosage+control.">Microinjection in a microfluidic format using flexible and compliant channels and electroosmotic dosage control.</a> Lab Chip. 9 (22), 3202-3211 (2009).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Qui, descriviamo l'uso di dispositivi abbiamo recentemente sviluppato per facilitare 2 dpf zebrafish microiniezione5e introdurre un dispositivo semplice montaggio privo di agarosio per imaging conveniente degli embrioni. Questi strumenti evidenziano l'utilità delle tecniche fotolitografiche per la fabbricazione di dispositivi utili per le tecniche di zebrafish.
Abbiamo trovato questo dispositivi MSA particolarmente utile per l'iniezione di cellule o particelle incline all'aggregazione entro l'ago per microiniezione, quali conidi fungine o cellule tumorali umane, che richiedono l'uso di un ago di calibro più grande per la consegna. Iniezione nella vescicola otica (Figura 4) presenta una sfida particolare, come embrioni rotolo spesso a contatto con l'ago. Troviamo che l'uso di canali microstrutturati che orientare e stabilizzare il danio zebrato in una laterale orientamento notevolmente migliorato la produttività e la precisione di questa tecnica nelle nostre mani.
Per rappresentazione rapida di zebrafish lateralmente orientato a tempi diversi, quali la valutazione del reclutamento dei neutrofili o metastasi dello xenotrapianto, evitando di agarosio aumentata consistenza di montaggio tra embrioni e ridotta probabilità di danni durante il Post-formazione immagine rescue. Questi dispositivi inoltre mostrano la promessa per l'imaging del lasso di tempo prolungato e sono stati utilizzati per riuscire a catturare immagini multicanale, del multiplane con movimento di pesce minimo oltre 12 h. Perché non sono costretti di agarosio, allungamento attivo delle larve durante questo periodo (~ 300 µm da 54-78 hpf)11 è illimitato e può procedere normalmente.
I passaggi più critici nella preparazione e nell'uso di questi strumenti sono comuni per l'uso della maggior parte dei dispositivi microfluidici PDMS basato: i dispositivi devono essere accuratamente bagnati e bolle evitato. Per evitare tali problemi, bagnare i dispositivi in E3 immediatamente dopo che essi sono fabbricati, mentre la superficie idrofilia conferito dal trattamento al plasma di ossigeno è ancora presente. Ri-trattamento con plasma ad ossigeno è utilizzabile anche per ripristinare transitoriamente idrofilia invecchiato PDMS dispositivi.
Le geometrie precise utilizzate qui sfruttare l'alta risoluzione delle tecniche fotolitografiche, ma l'attuale uso di limite di disegni di zebrafish durante il secondo post-fertilizzazione di giorno. Ri-progettazione di geometrie basato sulla piattaforma attuale consentirebbe successo orientamento del 1 dpf e 3 dpf per il microinjection. Orientamento della più vivace 4 dpf larve con vesciche natatorie gonfiati sarebbe probabilmente più impegnativo e richiedono aderente geometrie in combinazione con una maggiore tensione della acqua. Dispositivi complessi, integrando il flusso o vuoto potrebbero fornire un approccio alternativo applicabile a una vasta gamma di stadi di sviluppo, ma richiederebbero anche uso di pompe e tubi, aumentando i costi e i rischi di guasto del dispositivo.
PDMS è un materiale economico, utile per la realizzazione di dispositivi come quelli descritti qui, fornendo la biocompatibilità, la trasparenza e la riusabilità. Uno svantaggio dell'utilizzo di dispositivi PDMS per zebrafish è idrofobicità, che può rendere difficile manutenzione degli strati superficiali della E3 sulla superficie del dispositivo. Questo problema può essere evitato eseguendo il cast i dispositivi di microiniezione in agarosio, anche se questo limita la riusabilità e aumenta la fragilità dei dispositivi. Un'alternativa preferita sarebbe identificazione di un trattamento di superficie biocompatibile che aumenta l'idrofilia di PDMS12, o l'uso di un substrato di plastica appropriato.
Metodi attuali per il microinjection di zebrafish al dpf 2 utilizzano acqua tensione4 o semplici canali cast in agarosio utilizzando stampi commerciali per immobilizzare e posizionare le larve. Questi approcci offrono un controllo limitato su orientamento e possono essere complicati dalla rapida asciugatura degli embrioni. Le microstrutture integrate con le zolle e canali utilizzati qui sono progettati per orientare e immobilizzare le larve senza dipendere interamente da tensione dell'acqua, riducendo così il rischio di essiccazione. Divots realizzati con stampi stampati 3D sono state precedentemente utilizzate per l'orientamento degli embrioni per scopi imaging13, anche se la profondità di questi divots loro resi inaccessibili per il microinjection.
Uso di sistemi microfluidici per l'imaging di zebrafish sta diventando sempre più comune14. Sistemi di flusso-attraverso multipli sono stati sviluppati per permettere l'osservazione dello sviluppo di zebrafish nel tempo con la capacità di introdurre composti su richiesta15,16,17. Dispositivi più complessi sono stati progettati per gli embrioni di matrice mentre ancora all'interno di loro corion, che fornisce una semplice geometria sferica che può essere facilmente manipolata con relativamente elevato throughput in questi sistemi18,19. Parecchi gruppi hanno sviluppato piattaforme per arraying e imaging zebrafish stadio larvale in vari orientamenti6,20, il più user-friendly è la micropompa passiva guidata "ZEBRA" sistema sviluppato dal laboratorio Beebe6 . A differenza del sistema ZEBRA, il dispositivo che descriviamo qui usa aspirazione, generato utilizzando una pipetta di trasferimento standard, per disegnare le larve nei canali, durante il caricamento parallelo piuttosto che sequenza delle larve permette il salvataggio delle larve singole post-imaging l'applicazione di flusso positivo attraverso la stessa porta. Inoltre, il nostro approccio richiede una più piccola orma, quindi dispositivi PDMS possono essere legati a piastre da 6 pozzetti convenzionale con fondo di vetro per l'imaging.
Il disegno sperimentale corrente utilizza dispositivi separati per microiniezione e principalmente in modo che possono essere utilizzati con strumentazione di microinjection convenzionali e standard di imaging Microscopi rovesciati. Esistono approcci microfluidici per il microinjection automatizzato di zebrafish uova già21, e in combinazione con metodi di tipo "pesce-trappola" per arraying altamente accurate e l'orientamento delle larve20, è prevedibile che integra i dispositivi Imaging e automatizzato iniezione larvale può anche un giorno diventare una realtà.

Zebrafish sono emerse come un potente modello per molti campi, dagli studi di biologia dello sviluppo fondamentale a larga scala genetica e chimica schermi1,2. Sistematiche manipolazioni genetiche, come la sovraespressione genica, atterramento, CRISPR/Cas9 mutagenesi e transgenesi si basano su microiniezione di materiale genetico in singola cellula zigote, che ha portato allo sviluppo di semplice, facile da usare, nel commercio strumenti disponibili per orientare e stabilizzare le uova per iniezione3. Altri approcci, come il trapianto e l'infezione, spesso richiedono microiniezione in embrioni in fase successivi e larve utilizzando più grande calibro capillare aghi4. Tuttavia, uso di aghi di calibro più grandi presenta significative sfide tecniche, come è più difficile penetrare il tessuto dell'obiettivo senza spingere o l'embrione di rotolamento. In queste condizioni, ottenendo la tensione adatta dell'acqua necessaria per stabilizzare l'embrione, mentre è difficile evitare essiccazione durante la procedura e gli embrioni non può non essere idealmente orientato per l'iniezione nel tessuto bersaglio.
A seguito di microiniezione, è spesso utile paravento embrioni iniettati per selezionare quelli che sono stati iniettati con successo e per catturare le immagini del punto di tempo iniziale. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato una gamma di dispositivi microstrutturati che aiutano a stabilizzare 2 dpf embrioni in vari orientamenti microiniezione5sia per post-iniezione screening rapido basato sulle immagini.
Per ottenere una risoluzione sufficiente strutturale in questi dispositivi, abbiamo utilizzato le tecniche fotolitografiche. Comunemente impiegati nell'industria microelettronica e più recentemente estrapolato a microfluidic fabrication, questi approcci possono realizzare strutture verticali che vanno da 1-1.000 µm, una scala adatta alla manipolazione di embrioni di zebrafish e larve. Tutti i dispositivi sono stati fabbricati con polidimetilsilossano (PDMS), che è a buon mercato, fisicamente robusto, biologicamente inerte e trasparente.
Matrici di superficie microstrutturate (MSAs) sono state formattate come blocchi di PDMS con una superficie superiore a motivi, analoga ai canali semplici in agarosio blocchi comunemente usati per il microinjection di uovo. Per post-iniezione screening, 6 dispositivi di imaging possono essere schierati in una piastra 6-pozzetti con fondo di vetro standard. Questi dispositivi sono progettati per un facile caricamento di embrioni, mentre la procedura di scarico permette comodamente di salvataggio degli embrioni specifici, facilitando basata su immagine approcci di screening in modo più user-friendly rispetto quei dispositivi precedentemente sviluppato dalla Beebe laboratorio6.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

Zebrafish sono emerso come un potente modello di varie malattie umane e uno strumento utile per una gamma crescente di studi sperimentali, che abbracciano fondamentale biologia inerente allo sviluppo attraverso agli schermi di genetici e chimici su larga scala. Tuttavia, molti esperimenti, soprattutto quelli legati alla infezione e modelli dello xenotrapianto, si basano su microiniezione e l'imaging di embrioni e le larve, che sono laboriose tecniche che richiedono abilità e competenze. Per migliorare la precisione e la velocità di trasmissione di corrente microiniezione, abbiamo sviluppato una serie di dispositivi microstrutturati per orientare e stabilizzare gli embrioni di zebrafish 2 giorni post fertilizzazione (dpf) nell'orientamento ventrale, dorsale o laterale prima dei procedura. Per facilitare l'imaging di embrioni, abbiamo anche disegnato un semplice dispositivo con canali che orientano 4 zebrafish lateralmente in parallelo contro un vetro vetrino coprioggetti. Insieme, gli strumenti che vi presentiamo qui dimostrano l'efficacia di approcci fotolitografica per generare dispositivi utili per l'ottimizzazione delle tecniche di zebrafish.

L'approccio descritto qui di seguito viene illustrato il disegno (Figura 1) e la fabbricazione di dispositivi per l'utilizzo con 2 dpf zebrafish, utilizzando fotolitografica (Figura 2) e tecniche di soft-litografiche (Figura 3). Questo metodo consente di testare rapidamente molte iterazioni di progetto e modifiche, e le alterazioni e l'ottimizzazione delle dimensioni di microstruttura per l'uso con il danio zebrato in altre fasi di sviluppo possono estendere la loro applicazione.
Dimostriamo di utilizzo di questi dispositivi per microiniezione impegnativo e conveniente imaging. La vescicola otica (Figura 4, bianco contorno tratteggiato) fornisce un sito utile, immunitario privilegiato e isolato per i test di reclutamento dei neutrofili in zebrafish9. Per verificare la capacità dei neutrofili di zebrafish per rispondere agli standard chemioattrattanti, 100 nM di fMLP e LTB4 sono stati microiniettati in vescicole otic 2 embrioni di zebrafish dpf (Figura 4F, J), utilizzando il dispositivo di canale microstrutturata ( Figura 1) per stabilizzare gli embrioni con l'orientamento laterale. Iniezioni erano tracciate con alto peso molecolare del dextrano rodamina ed eseguite in embrioni di Tg(mpx:EGFP) per facilitare la visualizzazione del reclutamento dei neutrofili. Uninjected embrioni (Figura 4, H) ed embrioni iniettati con rodamina da solo (Figura 4E, io) sono stati utilizzati come controlli negativi. A seguito di microiniezione, gli embrioni sono stati trasferiti al dispositivo di imaging channel (Figura 1A, B) e imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza EVOS (Figura 4) a 30 min e 5 h post iniezione (Figura 4- G e Figura 4 H-K, rispettivamente). Come previsto, un piccolo numero di neutrofili fluorescenti sono stato reclutato per la vescicola otica mock-iniettato al timepoint iniziale (Figura 4I), probabilmente a causa di danni-mediata assunzione. È interessante notare che, il tracciante di destrano rodamina è stato osservato ad accumularsi nella otoliti durante l'esperimento. Per entrambi chemioattrattanti (Figura 4F, J), i neutrofili sono stati reclutati in numeri più alti, soprattutto in risposta alla LTB4 (Figura 4F).
I risultati rappresentativi mostrati qui dimostrano il riuscito uso di questo metodo per il microinjection e formazione immagine di zebrafish. Nel contesto dell'analisi di reclutamento dei neutrofili di zebrafish, applicazione di questi strumenti in combinazione con dettagliate dal vivo tecniche di imaging e migrazione cellulare sofisticate analisi10 può fornire una piattaforma utile per futuri esperimenti in questo campo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig1.jpg"> Figura 1: Computer assistita disegno disegno (CAD) delle maschere di fotolitografia. (A-C) Disegno CAD per superficie microstrutturata divots per posizionamento dorsale (C) orientamenti, ventrale (B) e laterale (A). Diverse linee colorate rappresentano CAD disegni di maschera per caratteristiche diverse, con verde 100 µm, blu 200 µm e rosso 400 µm caratteristica altezze. Barra della scala = 500 µm. (D-F) CAD design per microstrutturata canali per posizionamento dorsale (F) orientamenti, ventrale (E) e laterale (D). Diverse linee colorate rappresentano disegni maschera per caratteristiche diverse, con verde 100 µm, blu 200 µm e rosso 400 µm caratteristica altezze. Barra della scala: 500 µm. (G-io) disegno CAD per l'imaging di dispositivi progettati per caricamento a capofitto (G) o coda-primo (H e I). Linee blu rappresentano 400 µm caratteristiche, mentre linee rosse rappresentano 600 µm caratteristiche. Le frecce indicano la direzione in cui le larve vengono caricate. Barra della scala = 200 µm. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig2.jpg"> Figura 2: wafer master Silicone. (A) sezione superiore della cialda master caratteristiche di spettacoli per l'orientamento individuale larve in divots. (B) sezione di master wafer con disegno per canali microstrutturate di fondo. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig3.jpg"> Figura 3: dispositivi microstrutturati PDMS. (A) PDMS blocco il cast da master wafer risultati divots per orientare le larve individuali. (B) PDMS bloccare cast da master wafer risultati microstrutturate canali. Questa figura è stata modificata da Ellett et al. 5 <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56498/56498fig4.jpg"> Figura 4: risultati rappresentativi: Imaging reclutamento dei neutrofili di zebrafish dopo consegna di microiniezione di chemioattrattanti nella vescicola otica. (A-B) Caricamento e gli embrioni per l'imaging di montaggio. (A), il capo-primo dispositivo con embrioni pronti per il caricamento, con la porta indicata (freccia nera). (B) il caricato embrioni dopo che sono state tratte in posizione (freccia gialla). (C) piastra 6-pozzetti con fondo di vetro con periferiche sul microscopio. Questo formato consente di imaging di 4 lateralmente orientato embrioni per pozzetto (in totale 24 embrioni), usando un microscopio invertito standard. (D-G) Neutrofili (verde-EGFP) in un uninjected (D) embrione e seguenti vescicola otica microinjection di destrano rodamina (punta rossa, aperto bianco) da solo (E), 100 nM LTB4 (F) e 100 nM fMLP (G) 30 min dopo l'iniezione (mpi). (H-K) Neutrofili (verde-EGFP) in un embrione (H) uninjected e 5 h dopo vescicola otica microinjection di destrano rodamina (punta rossa, aperto bianco) da solo (ho), 100 nM LTB4 (J) e 100 nM fMLP (K) 5 h post iniezione ( HPI). Barra della scala = 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56498/56498fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae at JoVE.com

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K Views.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Microiniezione di zebrafish embrioni e le larve è una tecnica fondamentale ma impegnativa usata in molti modelli di zebrafish. Qui, presentiamo una gamma di strumenti di Microscala per aiutare nella stabilizzazione e orientamento di zebrafish per microiniezione e di imaging.

Video: Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Catturare Tissue Repair in Zebrafish Larve con Time-lapse Brightfield stereomicroscopia

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Monitoraggio celle in Zebrafish GFP-transgenico Utilizzo del sistema fotoconvertibile PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un metodo di montaggio versatile per il lungo termine Imaging di sviluppo Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

Sul posto Ibridazione in larve di zebrafish e giovani durante lo sviluppo di Mesonephros

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Modificazione genetica degli organoidi cerebrali dei primati

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

Autore in primo piano: Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

Microiniezione mirata ed elettroporazione di organoidi cerebrali di primati per la modificazione genetica

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...