著者は気前よく水槽スペースを提供するためデビッド Langenau を感謝したいです。エリック ・ ストーン、ジョン c. ムーア、秦唐は、ここで使用されるゼブラフィッシュ系統を調達のレナード ・ ゾンのラボからエリオット懸アン ・ ロバートソンと試薬、ゼブラフィッシュ メンテナンスを支援します。彼らはまたオクタビオ ウルタドのフォトリソグラフィー技術に関するアドバイスをありがとうしたいと思います。FE は、子供とアメリカのオーストラリア連合の Shriner の病院からの奨学金で賄われていた。この仕事 NIH によって資金が供給された GM92804 を付与します。

幼虫の研究動物のケアに関するマサチューセッツ総合病院小委員会プロトコル 2011N000127 の下で承認されました。
1. デバイスの作製
注: すべてコンピューター支援図面 (CAD) ファイルここで説明フォトリソグラフィ マスクを設計するために使用 (図 1)、ダウンロード可能。リンクの材料表を参照してください。
<ol><li>標準写真平版の技術7を使用してクラス 1,000 のクリーン ルーム内マスター金型ウェハを作製します。組織アレイとチャンネルは、製造元の指示に従って 3 別のマスクを使用して 3 層の順番にエポキシ系ネガ型フォトレジストをパターン: 浅い機能 100 μ m、200 μ m の機能のため、400 μ m の深層の特徴。イメージング デバイスの 2 つのパターン層の浅い機能および深層の特徴の 600 μ m の 400 μ m を使用します。</li>
	<li>15 cm (図 2) を鋳造用シャーレのベースに完成したウェハーをテープします。</li>
</ol>2. 微細加工表面のアレイ - PDMS の準備
<ol><li>使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いたポリジメチルシロキサン (PDMS) をキャストします。イニシエーターの 5 g と 50 g の PDMS モノマーを組み合わせるし、プラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さで徹底的にミックスします。</li>
	<li>慎重に型に混合物を注ぐ。</li>
	<li>1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。</li>
	<li>PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。</li>
	<li>慎重にメス、メスの先端とウェーハ表面間の接触を維持するために必ずマスター基板上装置の周りカットします。鉗子を使用して、ウェハとクリーンの 10 cm シャーレ (図 3) を機能面への転送から PDMS レプリカの皮をむきます。</li>
	<li>35 プラズマ オーブンを用いた酸素プラズマとデバイスを扱う s 疎水性を削減します。</li>
	<li>エチル 3-aminobenoate メタンスルホン酸 (MS-222、pH 7.5) 168 mg/L を添加したゼブラフィッシュ胚培地 (E3) でカバーします。転送ピペットを使用してデバイスの表面に水の流れることによって深い機能から任意の泡を削除します。</li>
</ol>3. 微細加工表面のアレイ - アガロースの準備
<ol><li>マイナスモールド PDMS をするためには、まず酸素プラズマによる PDMS デバイスを扱います。</li>
	<li>
1H, 1H, 2H, 2H- Perfluorooctyltriethoxysilane (PFDTS) シラン蒸気8不活性表面を作成すると PDMS デバイスを扱います。簡潔に。
	<ol>
<li>ヒューム フード内真空チャンバー内で扱われた機能側アップする PDMS を配置します。</li>
		<li>PDMS、横に小さなオープン ガラスやアルミ皿を置き、慎重に PFDTS の 200 μ L をピペット (98% シラン) 皿に。 注意: PFDTS シラン揮発性の高い水と激しく反応する、可燃性があり、接触皮膚や眼の損傷を引き起こします。使用前に詳細に MSDS を参照。</li>
		<li>真空チャンバーを閉じ、15-30 分または PFDTS シランが完全に蒸発するまで真空を適用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ペトリ皿にデバイスを配置し、新鮮な PDMS、2.1 から 2.3 の手順で説明されている金型として使用します。</li>
	<li>少なくとも 3 時間、65 ° C で焼く治療デバイスから新鮮な PDMS のレイヤー全体の皮をむくし、新鮮なペトリ皿に配置。その後、アガロースをキャストする否定的な金型として使用これができます。</li>
	<li>アガロースを準備するには、agarose が完全に溶解するまで低ゲル化温度の agarose E3 で電子レンジでの 2% 溶液を沸騰します。</li>
	<li>ホット アガロースを注ぐ PDMS マイナスモールドと転送ピペットと機能を流れる熱い agarose によってデバイスをカバー agarose 任意の泡を削除します。</li>
	<li>泡を取り外したら、agarose を設定するのには 4 ° C で冷蔵庫で冷やします。</li>
	<li>下から PDMS を手で変形によって負の PDMS 金型からアガロース ブロックを削除、新しいペトリ皿と MS 222 を含む E3 とウェットにアガロース ブロックを転送します。</li>
</ol>4. PDMS イメージング デバイスの準備
<ol><li>使用可能なデバイスを作る金型としてマスターのウエハーを用いた PDMS をキャストします。(ステップ 2.1 で使用した同じ) イニシエーターとプラスチック製のプラスチック フォークで皿の重さを徹底的にミックスの 5 g と PDMS モノマーの 50 g を組み合わせます。</li>
	<li>慎重に型に混合物を注ぐ。</li>
	<li>1 h の 16-25 inHg (54-85 kPa) で真空デシケータでガスを抜き。</li>
	<li>PDMS を治すためには、少なくとも 3 時間は 65 ° C で焼きます。PDMS を企業が柔軟な固体を治す必要があります。</li>
	<li>マスターのウェハからデバイスを切り取って 1.5 mm パンチを使用してポートをパンチします。</li>
	<li>治療デバイスと 6 ウェルのガラス底も 35 の酸素プラズマを用いたプレート s、2.6 の手順で説明されているようです。</li>
	<li>10 分の 85 ° C のホット プレートにすることで 1 つデバイス機能を 6 ウェル プレートの各ガラス基盤を接着します。 注: 成功した結合を確認するため、鉗子を用いた接合デバイスの 1 つの側面にしっかり圧力を適用されます。デバイスは、ガラス基板に接続されたままする必要があります。</li>
</ol>5. ゼブラフィッシュ文化
<ol><li>3標準的な技術を使用して 2 の dpf に文化ゼブラフィッシュ胚。</li>
	<li>鉗子または 1 mg/mL のプロテアーゼを用いた Dechorionate 胚ミックス (参照材料表)3まっすぐにそれらを許可するようにデバイスにロードする前に、少なくとも 30 〜 60 分。</li>
	<li>そのペトリ皿に、e3 (168 mg/L) MS-222 (pH 7.5) 25 X の 1 つの mL を追加して原液を用いた胚を anaesthetize します。</li>
</ol>6. 微細構造面・ ディボット配列のゼブラフィッシュの向き
<ol><li>それは胚を簡単に操作できるように、E3 の薄い (1-2 mm) 層で覆われているようなそのペトリ皿のステップ 2.7 (図 3 a) から PDMS ブロックを準備します。</li>
	<li>転送ピペットを使用して PDMS ブロックの表面に必要な数 (通常 10-20 1 つの条件) の胚を転送します。</li>
	<li>マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、胚を押し込みます (図 3 a) の微細構造の芝生。芝生の使用、背側と腹側の向きに特に適しています。 注: より厳しいと芝生 (背側と腹側) に合わせて、ディボットに平行にブロックの表面に胚を位置決めし、毛のループを使用して位置にそれらを圧延します。それらを安定した保つを助ける、ディボットに深くそれらを押してします。</li>
</ol>7. 微細表面 - ゼブラフィッシュの方向微細加工チャンネル
<ol><li>E3 を PDMS ブロックで微細加工チャンネル (図 3 b) E3 のレベルを下回ると、ブロックの端は、PDMS の薄層、貯留層およびチャネルでまだ存在まで転送ピペットを使用してパターンを描画します。</li>
	<li>エッジをオーバーフローしないように注意して転送ピペットを用いた貯留層にステップ 5.3 から 10 の胚を転送します。</li>
	<li>毛のループを使用して、適切なチャネルの入り口に漏斗にそれぞれの胚を操作し、よう、胚の頭は、チャネルとチャネルに入ると、胚は適切な方向に回転します。</li>
	<li>場所で保つを助けるチャネル壁の方向づけの microfeatures に到達するまで、毛のループを使用してチャネルをそれぞれの胚をスライドさせます。横方向微細チャンネルの使用が特に推奨されます。 注: 胚マイクロインジェクション中にスライディングを減らすためには、貯水池から E3 を描画することによって表面張力の量を調整してください。</li>
</ol>8. ゼブラフィッシュのマイクロインジェクション
<ol><li>
マイクロインジェクション針を準備します。
	<ol>
<li>前述4としてマイクロ ピペットの引き手を使用してホウケイ酸ガラス マイクロキャピ ラリー針を作る。結果針は、テーパ長さ約 10 mm の一方の端にポイントにテーパする必要があります。</li>
		<li>この場合 100 nM の走化性因子で注入されるべきソリューションを準備 (N-Formylmethionine-ロイシル-フェニルアラニン (fMLP) やロイコトリエン B4 (LTB4)) と 100 nM の PBS で 70 kDa ローダミン デキストラン トレーサー。</li>
		<li>細かくテーパー ピペットを使用して針にソリューションの 5 μ L を読み込むヒント (材料表を参照してください)。</li>
		<li>マグネット スタンドにマウントされているし、picopump マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに針をマウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>鉗子でテーパーの先端をつまんで 45 ° の角度で針の先端を破る。</li>
	<li>1 ボーラス注入サイズを調整する picopump コント ローラーで射出時間を調整することによって nL。</li>
	<li>マイクロインジェクション針の角度を調整します。針角 45 ° マイクロ コント ローラーには一般的に胚の長さに平行の針の良い出発点です。急な角度マイクロインジェクションの間に胚の横方向の動きを最小限に抑えるためのもの。</li>
	<li>左の手でシャーレと権限を持つ針マニピュレーターを制御する、この場合は耳胞のインジェクションの目的のサイトにできるだけ近くに針をもたらします。 注: 耳胞は 2 つ小さい異なる暗い楕円形の構造 (耳石) を含む目の後方の長方形の器官として識別できます。</li>
	<li>マイクロ コント ローラーを使用すると、針の先端が、小胞内になるように (この場合は耳胞) でターゲット組織を貫通し、picopump フット スイッチを使用してプリセット ボリュームを挿入します。 注意: 組織の浸透に耐える場合、は、マイクロ コント ローラーのノブをやさしくタッピングみてください。</li>
	<li>胚を解放するには、胚が周囲の E3 に解放されるように皿を旋回、上から転送ピペットを使用して下の表面で E3 はフローします。</li>
	<li>MS 222 転送ピペットを使用せず、E3 の回復料理に胚を転送します。</li>
</ol>9. デバイスをイメージング PDMS を用いた胚のスクリーニング
<ol><li>ポートを介して流れる E3 (+ MS 222) ステップ 4.7 からデバイスを首相します。これを行うことができます 1,000 μ L ピペットまたは狭ヒント転送ピペットを使用しています。</li>
	<li>デバイスが覆われるまでは、E3 + MS 222 井戸を埋めます。</li>
	<li>まあ転送ピペットを使用して各ステップ 8.7 から 4 注入された胚を提供します。胚は、E3 + MS 222 (ステップ 5.3) を読み込む前に 1 〜 2 分のために培養が必要な場合事前麻酔することができます。</li>
	<li>マイクロマニピュレーション ツールを使用 (毛のループまたは類似)、(尾最初または使用するデバイスに応じて先頭) 希望する方向の画像チャネルの入り口で胚の向き、デバイス (図 4 a) に部分的にそれらをプッシュします。均等にデバイスにそれらを描画に役立ちます。</li>
	<li>胚はの画像 (図 4 b) の向きが正しいチャンネルに描画されるまで、1,000 μ L ピペットまたは転送ピペットを使用してポートからデバイスを介して E3 を描画します。 注: 過去のトラップ ポイント胚を吸うように注意して、これは胚を損傷し、その向きを変更します。</li>
	<li>(図 4) をイメージングのための顕微鏡にもプレートを転送します。</li>
	<li>
倒立蛍光顕微鏡を使用してイメージ。
	<ol>
<li>適切なレンズを選択することで倍率を調整します。10 X は通常ゼブラフィッシュ好中球移行のイメージングのための有用な倍率です。</li>
		<li>各信号は明確なしかし、飽和していないように、光源強度と各チャンネル用の露光時間を調整します。</li>
		<li>各チャンネルのイメージをキャプチャします。ここで、緑色蛍光タンパク質を使用 (GFP、Ex: 470/22 Em: 525/50)、テキサス赤 (TxRed、Ex: 585/29 Em: 628/32) チャンネルを送信します。ポスト処理中にマルチ チャンネル画像を組み合わせることができます (図 4 b-私)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者は利益相反を宣言しません。

ここに述べる使用デバイスの最近行った dpf ゼブラフィッシュ マイクロインジェクション52 を容易にし胚の便利な画像の単純な agarose フリー実装デバイスを導入します。これらのツールは、ゼブラフィッシュのテクニックの有用なデバイスの作製に写真平版の技術の有用性を強調表示します。
我々 MSA デバイス特に有用な発見した細胞や粒子の射出用マ...

ゼブラフィッシュ遺伝子を大規模の根本的な発生生物学の研究から多くの分野で強力なモデルとして浮上しているし、化学スクリーン1,2。単一細胞の受精卵は、商業的、簡単・使いやすいの開発につながっているに遺伝物質のマイクロインジェクションに依存して遺伝子の過剰発現、ノックダウン、CRISPR/Cas9 変異、遺伝子導入などのルーチンの遺伝子操作定位と注入3卵の安定化に使用できるツール。移植と感染症などの他のアプローチは、後の段階の胚およびより大きいゲージ キャピラリー針4を使用して幼虫にマイクロインジェクションを必要があります。但しより大きいゲージの針を使用は、押すか、または胚を圧延することがなく標的組織に浸透するより困難だと重要な技術的な課題を示します。これらの条件の下でプロシージャの間に乾燥を避けることは難しい、胎児を安定させるために必要な適切な水分張力と胚を取得できない場合があります理想的な標的組織への注入を指向。
次の顕微注入、注入された胚初期時点の画像をキャプチャして選択する正常に挿入されていることを画面に便利です。これらの課題に対応するマイクロインジェクション5とイメージ ベースの迅速なスクリーニング後注入の両方のさまざまな方向に 2 の dpf 胚を安定させるのに役立ちます微細構造デバイスの範囲を開発しました。
これらのデバイスに十分な構造の解像度を得るためには、我々 は写真平版の技術を活用しました。よく最近マイクロ加工に外挿するマイクロ エレクトロニクス産業で使用される、これらのアプローチは 1 1,000 μ m、ゼブラフィッシュの胚・仔魚の操作に最適なスケールに至る垂直構造を実現できます。安く、物理的に堅牢な生物学的に不活性で透明なポリジメチルシロキサン (PDMS) を使用してすべてのデバイスを作製しました。
微細加工表面のアレイ (MSAs) PDMS のパターン表面でのブロックとしてフォーマットされた、卵マイクロインジェクションをアガロース ブロックで簡単なチャンネルに似ています一般的に使用します。投与後検診 6 イメージング デバイスに標準ガラス底 6 ウェル プレートに配置できます。これらのデバイスは、胚のイージーローディング向け、アンロード ・ プロシージャは、便利なイメージ ベースの促進、特定胚の救助を可能にする間これらのデバイスよりもより使いやすい方法でスクリーニングのアプローチで作られた、ビービ研究室6。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dow Corning Sylgard 184&#160; Polydimethylsiloxane (PDMS)&#160;</td>
			<td>Ellsworth Adhsives</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>For casting the devices. Kit includes PDMS monomer and Initiator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low gelling temperature agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9414-10G</td>
			<td>For casting agarose devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFDTS silane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>448931-10G</td>
			<td>For casting of negative PDMS molds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To anesthetize&#160; zebrafish&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Dextran 70,000 Da</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1818</td>
			<td>To trace microinjections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4 (LTB4)</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>20110</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLP)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F3506-50MG</td>
			<td>Neutrophil chemoattractant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm Petri dish</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>08-757-148</td>
			<td>For Casting from the master wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 6-well plates</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P06G-0-20-F</td>
			<td>For imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass microcapillaries</td>
			<td>World Scientific Instruments</td>
			<td>TW-100-4</td>
			<td>For microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z350796</td>
			<td>For transferring zebrafish embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader tips</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>E5242956003</td>
			<td>For loading the microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Uni-Core 1.5 mm punch</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>15111-15</td>
			<td>To punch ports in PDMS imaging devices</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No.&#160;11 Scalpel</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10011-00</td>
			<td>For cutting PDMS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-10</td>
			<td>For dechorionating embryos and breaking microinjection needle tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marzhauser Micromanipulator</td>
			<td>ASI&#160;</td>
			<td>MM33-R</td>
			<td>For manipulating microinjection needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>MSC</td>
			<td>SPI - 87242624</td>
			<td>For mounting micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPPI-3 Picopump controller</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MPPI-3</td>
			<td>To control microinjection volume and timing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS inverted fluorescent microscope</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EVOS FL</td>
			<td>To image injected embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>For visualizing microinjecion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td>Download AutoCAD files from: https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.4282853 and on the ZFIN community protocols wiki page: https://wiki.zfin.org/display/prot/ZFIN+ Protocol+Wiki &#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae

ゼブラフィッシュは、大規模な遺伝的・化学的画面を通じて基本的な発生生物学にまたがるさまざまな疾患や実験的研究の増加の範囲のための便利なツールの強力なモデルとして浮上しています。しかし、多くの実験、特にこれらの感染症と異種移植モデルに関連はマイクロインジェクションや胚とスキルと専門知識を必要とする困難な技術である幼虫の画像に依存します。精度と現在のマイクロインジェクション技術のスループットを向上させるため前、腹側、背側、または横方向に向き、2 日間ポスト受精 (dpf) でゼブラフィッシュ胚を安定させる微細構造デバイスのシリーズを開発、プロシージャ。胚のイメージングを支援、またオリエントのガラス製カバー スリップに対して平行に横方向に 4 ゼブラフィッシュ チャンネル付きシンプルなデバイスを設計しました。一緒に、ここで紹介するツールは、ゼブラフィッシュ技術の最適化のための有用なデバイスを生成するフォトリソグラフィー アプローチの有効性を示しています。

ここで説明している方法は、デザイン (図 1) および 2 dpf ゼブラフィッシュ、フォトリソグラフィー (図 2) とソフト平版 (図 3) の技術を使用して使用デバイスの作製を示します。このメソッドを使用する多くの設計イテレーションおよび変更の迅速検査、変更および開発の他の段階でゼブラフィッシュ...

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Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

microstructured-devices-for-optimized-microinjection-imaging

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.5K ビュー.  Massachusetts General Hospital–Harvard Medical School–Shriners Burns Hospital. Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ ツールの範囲とインジェクションとイメージングのゼブラフィッシュの方向を提案します。

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Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at 2 days post fertilization. Consisting of only two nephrons, the pronephros serves as the sole kidney during larval life until more renal function is required due to the increasing body mass. To cope with this higher demand, the mesonephros (adult kidney) begins to form during metamorphosis. The new primary nephrons fuse to the pronephros and form connected lumens. Then, secondary nephrons fuse to primary ones (and so on) to create a branching network in the mesonephros. The vast majority of research is focused on the pronephros due to the ease of using embryos. Thus, there is a need to develop techniques to study older and larger larvae and juvenile fish to better understand mesonephros development. Here, an in situ hybridization protocol for gene expression analysis is optimized for probe penetration, washing of probes and antibodies, and bleaching of pigments to better visualize the mesonephros. The Tg(lhx1a-EGFP) transgenic line is used to label progenitor cells and the distal tubules of nascent nephrons. This protocol fills a gap in mesonephros research. It is a crucial model for understanding how new kidney tissues form and integrate with existing nephrons and provide insights into regenerative therapies.

In Situ Hybridization in Zebrafish Larvae and Juveniles during Mesonephros Development

The zebrafish is an important model for understanding kidney development. Here, an in situ hybridization protocol is optimized to detect gene expression in zebrafish larvae and juveniles during mesonephros development.

イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

The zebrafish forms two kidney structures in its lifetime. The pronephros (embryonic kidney) forms during embryonic development and begins to function at ...

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the specific effects and mechanisms in zebrafish remain unclear. Alizarin red has a high affinity for calcium ions and can help visualize the bone and illustrate skeletal mineral mass. In this study, we aimed to detect lead acetate (PbAc)-induced bone loss in zebrafish larvae by using alizarin red staining. Zebrafish embryos were treated with a series of PbAc concentrations (0, 5, 10, 20 mg/L) between 2 and 120 h post fertilization. Whole-mount skeletal staining was conducted on larvae at 9 days post fertilization, and the total stained area was quantified using ImageJ software. The results indicated that the mineralized tissues were stained in red, and the stained area decreased significantly in the PbAc-exposure group, with a dose-dependent change in bone mineralization. This paper presents a staining protocol for investigating skeletal changes in PbAc-induced bone defects. The method can also be used in zebrafish larvae for the detection of bone loss induced by other chemicals.

Here, we have used alizarin red staining to show that lead acetate exposure causes a bone mass change in zebrafish larvae. This staining method can be adapted to the investigation of bone loss in zebrafish larvae loss induced by other hazardous toxicants.

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

霊長類の脳オルガノイドの遺伝子改変

Targeted Microinjection and Electroporation of Primate Cerebral Organoids for Genetic Modification

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of higher-order cognitive abilities in mammals, in particular, primates. Studying gene functions in primate brains is challenging due to technical and ethical reasons, but the establishment of the brain organoid technology has enabled the study of brain development in traditional primate models (e.g., rhesus macaque and common marmoset), as well as in previously experimentally inaccessible primate species (e.g., great apes), in an ethically justifiable and less technically demanding system. Moreover, human brain organoids allow the advanced investigation of neurodevelopmental and neurological disorders.
As brain organoids recapitulate many processes of brain development, they also represent a powerful tool to identify differences in, and to functionally compare, the genetic determinants underlying the brain development of various species in an evolutionary context. A great advantage of using organoids is the possibility to introduce genetic modifications, which permits the testing of gene functions. However, the introduction of such modifications is laborious and expensive. This paper describes a fast and cost-efficient approach to genetically modify cell populations within the ventricle-like structures of primate cerebral organoids, a subtype of brain organoids. This method combines a modified protocol for the reliable generation of cerebral organoids from human-, chimpanzee-, rhesus macaque-, and common marmoset-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) with a microinjection and electroporation approach. This provides an effective tool for the study of neurodevelopmental and evolutionary processes that can also be applied for disease modeling.

著者スポットライト:遺伝子組換えのための霊長類脳オルガノイドの標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション  

The electroporation of primate cerebral organoids provides a precise and efficient approach to introduce transient genetic modification(s) into different progenitor types and neurons in a model system close to primate (patho)physiological neocortex development. This allows the study of neurodevelopmental and evolutionary processes and can also be applied for disease modeling.

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

The cerebral cortex is the outermost brain structure and is responsible for the processing of sensory input and motor output; it is seen as the seat of ...

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

要約

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この動画の章

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

イン・シトゥメサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

要約

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タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

Threespineトゲウオにおける遺伝子導入およびゲノム編集のためのマイクロインジェクション

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

イン・シトゥ メサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

霊長類脳オルガノイドの遺伝子改変のための標的マイクロインジェクションとエレクトロポレーション

イン・シトゥメサネフォロス発生時のゼブラフィッシュ幼虫と若年期のハイブリダイゼーション