Name: adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
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L'autore ringrazia Susan Whitfield per la preparazione delle figure e Camille Martin e Hillary Samagaio per assistenza con alcuni esperimenti.

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	<li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere:+a+review.">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li><li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+factors+influencing+survival+and+growth+of+human+pathogens+on+raw+fruit+and+vegetables.">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li><li>Berger, C. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens.">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li><li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W., Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attachment+of+Rhizobiaceae+to+plant+cells.">Attachment of Rhizobiaceae to plant cells.</a> The Rhizobiaceae. , 235-249 (1998).</li><li>Matthysse, A. 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L'autore dichiara che non ha nessun concorrenti interessi finanziari.

È importante essere consapevoli di tutte le superfici a cui i batteri possono aderire durante l'esperimento. Così i batteri che sono in grado di legarsi al vetro possono essere sottovalutati se i conteggi delle cellule vitali sono fatte utilizzando provette e pipette. Se le piante sono cresciute in agar o terreno e alcuni dell'agar o terreno rimane sulle piante i batteri possono associare il materiale aderente anziché alle piante. D'altra parte, lavare la superficie della pianta, specialmente nel caso di radici, può rimuovere rivestimenti di superficie naturali come mucose e quindi alterare i risultati delle prove di aderenza.
È importante essere certi che i batteri aggiunti alla miscela di incubazione rimangono vivi durante l'esperimento. Così i conteggi delle cellule vitali dei batteri liberi così come allegati ordinariamente dovrebbero essere fatta. Alcuni trattamenti o mutazioni batteriche possono ridurre il tasso di crescita batterica o effettivamente causare la morte di una frazione della popolazione batterica. Batteri vivi e morti non siano distinguibili nel microscopio a meno che non vengono utilizzati coloranti speciali. C'è un kit di macchia utile per live/dead batteri che dipende l'esclusione di coloranti dai batteri viventi. Tuttavia, se una popolazione mista di specie batteriche è presente quindi i conteggi delle cellule vitali delle specie di interesse rischia di essere il metodo più semplice per determinare se l'incubazione ha provocato la morte batterica.
Composizione media influenzerà la crescita e la sopravvivenza batterica. Radice dell'essudato e materiali rilasciato dalla ferita e tagliare siti fornirà il substrato per supportare la modesta crescita batterica. Fosfato, azoto e ferro tendono ad essere limitante in queste condizioni. Cationi bivalenti come calcio e magnesio possono influenzare l'adesione. In alcuni casi fonte di carbonio possa influenzare adesione. pH è anche importante. In generale il pH della rizosfera è tra 5.5 e 6.5.
È necessario prestare attenzione nell'utilizzo di batteri contrassegnati con resistenza agli antibiotico. Gli antibiotici più spesso utilizzati sono la rifampicina e acido nalidixico. Resistenza a questi antibiotici è in genere dovuta a mutazioni in geni cromosomici (RNA polimerasi e girasi, rispettivamente) e pertanto non possono essere facilmente trasferiti ad un altro ceppo durante l'incubazione. Questo tipo di resistenza anche non provocare la degradazione o la modifica dell'antibiotico. Marcatura di batteri con un plasmide-sopportate gene marcatore non è raccomandato a meno che il plasmide non può essere trasferito a qualsiasi altri batteri. La resistenza agli antibiotici non deve essere dovuto modifica degradazione o chimica dell'antibiotico come antibiotici batteri sensibili sarà quindi in grado di crescere su piastre antibiotici se essi si trovano vicino i batteri resistenti.
I metodi descritti in questa carta sono utili per campioni di piccole dimensioni e/o esperimenti dove i campioni devono essere contenuti (per esempio, esperimenti che coinvolgono agenti patogeni umani). Per campioni di grandi dimensioni (superiori a 100 g di materiale o di più di 50 piante) altri metodi o drastica modificazione di questi metodi sarebbero necessari10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. la presenza di un gran numero di microrganismi diversi le specie oggetto di studio può anche porre problemi significativi. Possibili soluzioni includono l'uso di batteri contrassegnato con una proteina fluorescente o la resistenza agli Antibiotico, come descritto nei passaggi 6.1.2 e 7.3. Tuttavia, quando i batteri di interesse sono rari individui in una grande popolazione di altri microrganismi questi indicatori non siano sufficienti per consentire una valutazione univoca dei numeri dei batteri in fase di studio.
Tutti i metodi descritti qui sono metodi di laboratorio di base. Modifiche minori sarebbero necessari per gli studi di serra. Altre importanti modifiche sono suscettibili di essere necessario per gli studi sul campo dove protozoi, insetti e altri animali predazione e clima variazione complicare la fornitura di condizioni definite per gli esperimenti. In futuro questi metodi possono essere estesa per includere le interazioni di due o più microrganismi sulla superficie della pianta.

La misura di associazione batterica per piantare le superfici è diventato importante in tre situazioni disparate. La prima situazione è l'esame della trasmissione di agenti patogeni umani su pianta superfici1,2,3. L'obiettivo è di impedire l'associazione batterica o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi a ridurre la trasmissione della malattia da materiale vegetale. La seconda situazione è l'esame dell'associazione degli agenti patogeni della pianta per pianta superfici4. Ancora una volta l'obiettivo è di impedire l'associazione o di rimuovere o uccidere i batteri associati e quindi per ridurre la malattia. La terza situazione è l'esame dell'associazione di batteri simbiotici o pianta-growth-promoting5,6. L'obiettivo è quello di promuovere batterica vincolante e quindi di aumento di salute delle piante e delle colture produce.
Le tecniche per la misurazione associazione batterica per piantare le superfici descritte in questo articolo sono poco costoso e relativamente facile da realizzare. Gli unici requisiti sono un microscopio e materiali trovati generalmente in un laboratorio di batteriologia. Per alcune tecniche un sonicatore vasca è utile. Le tecniche descritte sono progettate per l'associazione di esperimenti condotti utilizzando campioni di relativamente piccole dimensioni. Misure di associazione sono effettuate in laboratorio, anche se potrebbe essere possibile modificare alcune di queste tecniche per l'utilizzo in serra o in campo.
Queste tecniche sono state usate per misurare l'associazione batterica a radici, germogli, foglie di taglio, taglio frutta e pomodorini intatti nel laboratorio7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Essi sono stati utilizzati anche per misurare la colonizzazione della radice delle piante che crescono nel terreno o sabbia nel laboratorio16. Le tecniche sono state utilizzate con molte specie batteriche come Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas fluorescens. Un'utile descrizione dei metodi per valutare l'interazione di a. tumefaciens con superfici può essere trovata in Morton e Fuqua (2012)17. In tutti i casi le dimensioni del campione coinvolte erano piccole, generalmente meno di 25-50 piante. Le tecniche descritte sono adatte per l'utilizzo con agenti patogeni umani che hanno bisogno di essere tenuto confinato durante gli esperimenti.

<table><tbody><tr><td>light microscope</td><td>any</td><td>N/A</td><td>phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.</td></tr><tr><td>seeds</td><td>any&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>make a note of the seed lot number and the cultivar</td></tr><tr><td>bleach</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>bath sonicator</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>nutrient agar&amp;nbsp;</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>soytone</td><td>Difco&amp;nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Sand</td><td>sea sand Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>sand</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td>conetainers</td><td>Stuewe &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>Ray-Leach cone-tainers</td><td>many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow</td></tr><tr><td>parafilm</td><td>any scientific supply company</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MS salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>parrafin</td><td>any</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>centrigfuge</td><td>any scientific company</td><td>N/A</td><td>to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed</td></tr><tr><td>vortex mixer</td><td>any scientific company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrometer</td><td>ACCU-SCOPE Accessories</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Sedgwick-rafter counting cell</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>probe-clip press-seal incubatin chamber</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>naladixic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead stain</td><td>In Vitrogen Molecular Bioprobes</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

adherence of bacteria to plant surfaces measured in the laboratory

Questo manoscritto descrive un metodo per misurare l'associazione batterica alle superfici axeniche pianta al microscopio ottico e attraverso l'utilizzo di conteggi delle cellule vitali. Materiali vegetali utilizzati includono radici, germogli, foglie e tagliare la frutta. I metodi descritti sono poco costoso, facile e adatto per campioni di piccole dimensioni. Il legame è misurato in laboratorio e una varietà di media di incubazione e condizioni può essere utilizzata. L'effetto degli inibitori può essere determinato. Possono essere valutati anche situazioni che promuovono e inibiscono il grippaggio. In alcuni casi è possibile distinguere se varie condizioni alterano associazione principalmente dovuto i loro effetti sulla pianta o sui batteri.

A. tumefaciens colonizza superfici radicolari. Al fine di determinare se la produzione batterica di cellulosa svolge un ruolo nella colonizzazione della radice, gli effetti delle mutazioni batteriche che impediscono la sintesi di cellulosa sono stati esaminati16. Le tecniche descritte nei passaggi 1.3 e 7.1 sono state usate. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Quando le radici erano lunghi circa 2 cm erano immersi in una sospensione di 105 batteri / mL e piantati nel terreno pastorizzato in contenitori. Le piante sono state coltivate per 14 giorni a 25 ° C su un ciclo di 12 h luce/12 h scuro. Dopo l'indicato volte le piante sono stati rimossi dai contenitori. Le radici sono state lavate e sonicate in un sonicatore vasca per rimuovere i batteri associati. Numeri batterici sono stati determinati utilizzando i conteggi delle cellule vitali. La figura 2 Mostra l'effetto di due mutazioni differenti di cellulosa-meno la capacità dei batteri di colonizzare le radici di pomodoro. Anche se le deviazioni standard di alcune misurazioni erano alti come 0,9 log10 (un problema comune con questo tipo di misura) la riduzione nell'associazione dei mutanti cellulosa-meno è chiaramente evidente e possiamo concludere che la produzione batterica di cellulosa aiuta i batteri nella colonizzazione delle radici di pomodoro.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg"> Figura 2 : Root colonizzazione da wild-type e mutanti di cellulosa-meno di a. tumefaciens. Numero totale di log10 dei batteri per cm lunghezza della radice ha recuperato dalle radici di pomodoro inoculati con wild-type a. tumefaciens strain C58 e mutanti di cellulosa-meno C58:1 e C58:A60. I numeri indicati sono il mezzo da un minimo di quattro esperimenti separati. Le barre indicano le deviazioni standard dei mezzi. Le radici sono state inoculate immergendoli in una sospensione di 105 batteri / mL per un minuto. Le piante sono state coltivate in contenitori e i batteri senza bloccare aderenti sono stati rimossi lavando le radici in buffer in un flaconcino di vetro di lavaggio. Strettamente aderenti batteri sono stati rimossi usando un sonicatore vasca e la sospensione risultante placcato per determinare cellule vitali conta16. Questa figura è stata modificata da Matthysse e McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il ruolo di esopolisaccaridi nell'associazione di e. coli e altri batteri di germogli di erba medica è stato esaminato. Alcuni focolai di malattia diarroica dovuto Escherichia coli O157: H7 sono stati rintracciati a germogli contaminati. Associazione dei batteri wild type e mutanti in grado di fare vari esopolisaccaridi è stata misurata utilizzando i metodi descritti ai punti 1.1, 5.1 e 7.2. Germogli di erba medica sono stati superficie sterilizzato e germinato per un giorno in acqua sterile a 25 ° C al buio. Quattro germogli con annesso tegumenti sono stati collocati in piatti di plastica sterili contenente 5 mL di acqua. I batteri cresciuti in brodo di Luria sono stati aggiunti a una concentrazione finale di circa 5 x 103 millilitri. I germogli inoculati sono stati incubati a 25 ° C al buio per 3 giorni. I germogli sono stati lavati due volte in 5 mL di acqua sterile in un flaconcino di vigorosa inversione e omogeneizzati in buffer utilizzando un omogeneizzatore di vetro Teflon a motore di lavaggio. Precedenti esperimenti utilizzando batteri contrassegnato con un plasmide che trasporta il gene GFP ha mostrato nessun batteri interiorizzato anche batteri dalla superficie facilmente sono stati osservati. I risultati sono mostrati nella tabella 1. Sono stati esaminati due ceppi di e. coli O157: H7. In entrambe le razze la produzione di acid(PGA) Poli-β-1,6-glucuronico è apparso per rendere il più grande contributo all'associazione di patogeni di Escherichia coli per piantare le superfici. Acido colico ha anche svolto un ruolo significativo nell'associazione. Mentre la riduzione nell'associazione in cellulosa-minus mutanti era significativa non era grande come quella per gli altri due polisaccaridi.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="4">Effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sull'associazione di E. coli O157: H7 per germogli e aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Ceppo batterico</td>
			<td rowspan="2">Mutazione o genotipo (fenotipo pertinente)</td>
			<td colspan="2">10 numero di batteri associati al germoglio o tegumento log</td>
		</tr>
<tr>
<td>Germogli di erba medicab
</td>
			<td>Aperti tegumenti</td>
		</tr>
<tr>
<td>86-24</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>4,7 ± 0.6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624N</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c
</td>
			<td>3,5 ± 0.6c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624C</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c
</td>
			<td>2.4 ± 0.5c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>8624P</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,0 ± 1.0c
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4A</td>
			<td>Nessuno (wild type)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6,1 ± 0,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AN</td>
			<td>
yhjN (cellulosa-minus)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
			<td>4,1 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AC</td>
			<td>
wcaD (meno acido colico)</td>
			<td>3,9 ± 0.5c
</td>
			<td>4,8 ± 0,8d
</td>
		</tr>
<tr>
<td>DEC4AP</td>
			<td>
pgaC (PGA-minus)</td>
			<td>< 1.0c
</td>
			<td>1,2 ± 0,7c
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">media ± deviazione standard di un minimo di tre misure del numero (registro10) di batteri associati dopo 3 giorni.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Germogli di b sono stati lavati prima misurazione.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">c significativamente differenti dal wild type: P < 0.01.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">d significativamente differenti dal wild type: P < 0.05.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: effetti delle mutazioni nei geni di produzione di esopolisaccaridi sul legame di Escherichia coli O157: H7 per germogli. Al fine di determinare il ruolo delle varie esopolisaccaridi e lipopolisaccaride nell'associazione di patogeni Escherichia coli O157: H7 ceppi di germogli di erba medica, l'associazione di un insieme di mutanti per i germogli e aperti tegumenti è stato esaminato usando i metodi descritto nel passaggio 6. I risultati hanno mostrato che poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) sembra essere essenziale per l'associazione di germogli e che l'acido sia cellulosa e colanic sono necessari per legame massimo di e. coli O157. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
Al fine di determinare se la produzione di PGA è sufficiente per causare associazione batterica piantare le superfici, un plasmide (pMM11) che trasportano l'operone clonato codifica i geni richiesti per PGA produzione è stato introdotto in due diversi tipi di batteri che non normalmente essere in grado di legarsi al pomodoro radici10. A. tumefaciens A1045 è un mutante del ceppo selvaggio tipo C58 che non riesce a rendere ciclico-β-1,2 glucano e inoltre non riesce ad associare a piantare superfici29. Sinorhizobium meliloti 1021 che forma noduli radice su erba medica non riesce ad associare ai non-legumi tra cui pomodoro12. Le tecniche descritte nei passaggi 1.1, 5.1, 6.3 e 7.1 sono state utilizzate per determinare se la capacità di fare PGA generalmente aumentato associazione batterica a superfici radicolari. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua sterile. Le radici sono state tagliate in segmenti di 1 cm di lunghezza e disposto in acqua sterile e i batteri sono stati inoculati. Come queste due specie di batteri crescono a ritmi diversi, associazione è stata misurata in momenti diversi per consentire all'incirca uguali quantità di crescita batterica. La presenza del plasmide pMM11 causato un simile aumento significativo del numero di batteri associati di entrambi di specie (tabella 2)10. Un aumento significativo nell'associazione è stato anche visto al microscopio ottico, ma l'associazione è stata molto diversa per le due specie (Figura 3). A. tumefaciens A1045 associato come singoli batteri per la superficie della radice. S. meliloti rilegato in cluster di grandi dimensioni in cui solo alcuni dei batteri fossero collegati direttamente alla radice e la maggior parte dei batteri sono stata fissata ad altri batteri. Questo esempio mostra che semplicemente analizzando il numero di batteri associati senza includere le osservazioni al microscopio può dare un'impressione ingannevole dei risultati di un esperimento. Sebbene entrambi i metodi (conta delle cellule vitali e osservazioni al microscopio) mostrano che pMM11 aumentato associazione batterica alle radici di pomodoro, il tipo di associazione causato dalla produzione di PGA era differente per le due specie batteriche10.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">L'effetto del plasmide pMM11 sui Binding dei batteri alle radici di pomodoro</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ceppo batterico</td>
			<td>Plasmide</td>
			<td>Numero di batteri associata a lunghezza della radice mm</td>
		</tr>
<tr>
<td>A. tumefaciens A1045un
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0.25 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td>S. meliloti 1021b
</td>
			<td>nessuno</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pBBR1mcs (vettore)</td>
			<td>nessuno rilevato</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>pMM11 (sintesi di PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103
</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">un'associazione batterica è stata misurata dopo 2 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">b Associazione batterica era misura dopo 18 ore</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: l'effetto di un plasmide portatori di geni per la sintesi di PGA sul legame di A. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 a segmenti di radice di pomodoro. Al fine di esaminare la possibilità di poli-ß-1, 6 -N-acetil-D-glucosamina (PGA) per promuovere l'associazione di batteri per piantare radici, l'effetto di un plasmide che attribuisce la capacità di fare PGA (pMM11) l'associazione di due ceppi di batteri pianta-collegato a radici di pomodoro è stato esaminato. Nessun ceppo di batteri ha mostrato significativa associazione alle radici di pomodoro in assenza del plasmide o in presenza del plasmide senza i geni che codificano la sintesi di PGA (pBBR1mcs). L'aggiunta del plasmide portatori di geni di sintesi PGA aumentato associazione di entrambi i tipi di batteri. Perché a. tumefaciens cresce più velocemente di quanto S. meliloti associazione è stata misurata dopo 2 h di incubazione per a. tumefaciens e dopo 18 h per S. meliloti. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 7. Questa tabella è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg"> Figura 3 : L'effetto del pMM11 di plasmidi che trasportano i geni di biosintesi di PGA sul legame di a. tumefaciens A1045 e S. meliloti 1021 di peli radicali pomodoro. Associazione di pomodoro di peli radicali della A) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 e D) S. meliloti 1021 pMM11. Anche se l'aumento nell'associazione delle due specie batteriche è approssimativamente simile i dettagli dell'associazione come visto al microscopio ottico sono molto diversi. Le tecniche utilizzate sono quelle descritte nel passaggio 6. Questa figura è stata modificata da Matthysse, Deora, Mishra e Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
A volte è possibile utilizzare l'associazione per le superfici non-biologici per aiutare a distinguere il contributo dei batteri e della pianta in un'interazione specifica. Il polysaccharide(UPP) unipolare di a. tumefaciens ha dimostrato di essere in grado di mediare associazione batterica ad una varietà di entrambe le superfici biologiche e non biologiche30. Calcio è stato osservato per inibire il legame di a. tumefaciens piantare superfici mediate dal UPP28. Al fine di determinare se l'inibizione di ioni del calcio di associazione batterica per piantare le superfici è dovuta ad un effetto sui batteri o sulla superficie della pianta, l'associazione dei batteri a fili di nylon è stata esaminata. Le tecniche vengono descritti nel passaggio 8.2 sono stati usati. Semi di pomodoro erano superficie sterilizzato e germinati in acqua come descritto nel passaggio 1. I batteri sono stati coltivati in terreno minimo con saccarosio e aggiunto al pomodoro radici o fili di nylon ad una concentrazione finale di circa 105/ml come descritto al punto 5.1. L'effetto di aggiunta CaCl2 sull'associazione batterica alle radici di pomodoro e fili di nylon è stato esaminato al microscopio. La figura 4 Mostra una simile inibizione di associazione di calcio utilizzando sia superficiale, suggerendo che l'effetto di calcio è principalmente sui batteri10.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg"> Figura 4 : L'effetto di calcio sul legame di a. tumefaciens al pomodoro di peli radicali e fili di nylon. A. tumefaciens è stato incubato con radici di pomodoro (A e B) o fili di nylon (C e D) per 24 h in un 01:10 diluizione di MS sali e un 01:20 diluizione di terreno minimo di AB, 0,4% di saccarosio (A e C) o in un 01:10 diluizione di MS sali e 01:20 diluizione del terreno minimo AB , 0,4% saccarosio contenente 60 mM CaCl2 (B e D)31. L'aggiunta di CaCl2 ha inibito il grippaggio batterica sia radici e fili di nylon, suggerendo che l'inibizione era principalmente a causa di un effetto sui batteri piuttosto che sulla superficie della pianta. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Un metodo semplice per la misurazione e la caratterizzazione di adesione batterica alle piante, in particolare radici e germogli, è descritto in questo articolo.

Aderenza dei batteri per piantare superfici misurate in laboratorio

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

12.6K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. Un metodo semplice per la misurazione e la caratterizzazione di adesione batterica alle piante, in particolare radici e germogli, è descritto in questo articolo.

Video: Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingegneria batteri aderenti mediante la creazione di un unico sintetico curli Operon

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioingegneria

Rilevamento della colonizzazione rizobatterica su Arabidopsis thaliana

Measuring Bacterial Colonization on Arabidopsis thaliana Roots in Hydroponic Condition

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized method for measuring bacterial colonization in the rhizosphere is necessary to improve reproducibility. We first cultured sterile A.thaliana in hydroponic conditions and then inoculated the bacterial cells in the rhizosphere at a final concentration of OD600 of 0.01. At 2 days post-inoculation, the root tissue was harvested and washed three times in sterile water to remove the uncolonized bacterial cells. The roots were then weighed, and the bacterial cells colonized on the root were collected by vortex. The cell suspension was diluted in a gradient with a phosphate-buffered saline (PBS) buffer, followed by plating onto a Luria-Bertani (LB) agar medium. The plates were incubated at 37 &#176;C for 10 h, and then, the single colonies on LB plates were counted and normalized to indicate the bacterial cells colonized on roots. This method is used to detect bacterial colonization in the rhizosphere in mono-interaction conditions, with good reproducibility.

Autore in primo piano: Migliorare la colonizzazione dei rizobatteri sulle radici delle piante per migliorare l'efficienza dei fertilizzanti microbici

Colonization of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in the rhizosphere is essential for its growth-promoting effect. It is necessary to standardize the method of detection of bacterial rhizosphere colonization. Here, we describe a reproducible method for quantifying bacterial colonization on the root surface.

Misurazione della colonizzazione batterica sulle radici di Arabidopsis thaliana in condizioni idroponiche

Measuring bacterial colonization on Arabidopsis thaliana root is one of the most frequent experiments in plant-microbe interaction studies. A standardized ...

Ambiente

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Patosistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Monitoraggio della colonizzazione e della manutenzione batterica sull'Arabidopsis thaliana Radici in un sistema idroponico galleggiante

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

Use of Fimbrial Rod for F18ab Fimbriae+ STEC Colonization to Host Cells

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily composed of multiple copies of the major fimbrial subunit FimA. FimH adhesin, however, is present as a fibrillar tip structure that drive bacteria binding to host cellular mannose containing receptor. Here, we provide protocols to evaluate and compare the function of type 1 fimbrial subunits in F18ab fimbriae+ Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC). We found that both FimA and FimH are required for bacterial adhesion, invasion, and biofilm formation. Deleting fimA gene showed much more reduction in bacterial adhesion and invasion to porcine intestinal columnar epithelial cells IPEC-J2, than that of fimH mutant. Biofilm formation was significantly reduced in both mutants with an equal level. In addition, qPCR demonstrated that either fimA or fimH deletion down-regulated the bacterial flagella and F18 fimbriae genes expression, while up-regulated adhesin was involved in diffuse adherence-I (AIDA-I) gene expression, suggesting the co-regulation of cell surface-localized adhesins in F18ab fimbriae+ STEC.

<meta charset="utf8"></head><body>Uso di bastoncino fimbriale per la colonizzazione F18ab Fimbriae+ STEC alle cellule ospiti

Here we present a protocol to study the function of fimbriae in bacterial colonization.

Uso di bastoncino fimbriale per la colonizzazione F18ab Fimbriae+ STEC alle cellule ospiti

Type 1 fimbriae are important virulence determinants of some Gram-negative pathogens, which promote bacterial colonization. The fimbrial rod is primarily ...

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