In-Nucleus Hi-C בתאי דרוסופילה

פרוטוקולי Nucleus Hi-C מאפשרים לחקור אישור כרומוזומלי ברזולוציה שונה לאפיון לולאות כרומטין, תחומים ותא המארגנים את הגנום. פרוטוקול זה מספק פרופיל ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות גנומיות בקנה מידה שונה, ומעניק כיסוי עקבי יותר על פני הטווח המלא של מרחקים ונתונים גנומיים עם פחות רעש טכני. שילוב פרוטוקול זה עם עריכה גנטית היא אסטרטגיה רבת עוצמה לבדיקת התפקוד המבני של אלמנטים גנטיים.

זה יכול להיות מיושם גם על אפיון של וריאציות מבניות שמובילות למחלות. ניתן ליישם את פרוטוקול Nucleus Hi-C כדי לחקור את ארגון הגנום של כל גנום אאוקריוטי. ביצוע טיפול SDS וטריטון מנטרל את כל הגושים הגרעיניים על ידי צנרת כמו אגרגטים להפריע יעילות התגובה אנזימטית, ולהיות בטוח לבצע את בקרת איכות המתאימה למדוד לפני הרצף.

התחל על ידי הוספת פורמלדהיד ללא מתנול פעם אחת 10 לשבעה תאי קו 2 פלוס של שניידר פלוס Drosophila ב 17.5 מיליליטר של בינוני שניידר בתוספת עם 10% FBS לריכוז סופי של 2% לדגור על התאים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם ערבוב כל 60 שניות או על גלגל מסתובב, ולהוסיף גליצין לריכוז סופי של 0.125 טוחנת עם ערבוב. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר ו -15 דקות על קרח, לאסוף את התאים על ידי centrifugation בזהירות resuspend הכדור ב 25 מיליליטר של PBS קר ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת. בסוף הצנטריפוגה, resuspend התאים במיליליטר אחד של חיץ תמוגה קר קרח לספירה ולהתאים את התאים אחד פעמים 10 עד שישה תאים לריכוז מיליליטר.

לדגור את התאים על הקרח במשך 30 דקות, הפוך את הצינור כל שתי דקות לערבב ולאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת. resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ תמיסת קרח קר טרי. לאחר צנטריפוגה, לשטוף את lysate עם מיליליטר אחד של 1.25X מאגר הגבלה.

צנטריפוגה שוב כדי לאסוף את lysate. resuspend הכדור ב 360 microliters של חוצץ הגבלה טרי ו 11 microliters של 10% SDS עם pipetting זהיר ודגרה במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 7 עד 950 סיבובים לדקה עם צנרת מדי פעם. בסוף הדגירה, לעצור את permeabilization עם 75 microliters של פעילי שטח לא יוני ולהחזיר את הצינור לחממה במשך 45 דקות נוספות עם רועד ב 950 מהפכות לדקה עם pipetting מדי פעם.

לעיכול כרומטין, להוסיף 200 יחידות של Mbo1 לצינור עבור דגירה של ארבע עד 16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם סיבוב. בסוף הדגירה, לנטרל את האנזים עם 20 דקות דגירה ב 60 מעלות צלזיוס. כדי למלא את שבר ההגבלה overhangs ולתייג את ה- DNA מסתיים עם ביוטין, להוסיף 1.5 microliters כל אחד של 10 מילימולר dCTP, dGTP, dTTP, 20 microliters של 0.4 מילימולר ביוטין dATP, 17.5 microliters של חיץ EDTA נמוך tris, ו 10 microliters של חמש יחידות לכל microliter של DNA פולימראז שבר אחד גדול לצינור עם ערבוב זהיר.

לדגור על התגובה במשך 75 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 700 סיבובים לדקה כל 10 שניות במשך 30 שניות. בסוף הדגירה, מוסיפים את תערובת הקשירה לכרומטין ומתאימים אותו לנפח תגובה סופי אחד של מיליליטר עם ערבוב עדין ויסודי ודגרה למשך הלילה ב -16 מעלות צלזיוס. כדי לבזות את חלבוני הדגימה, להוסיף 50 מיקרוליטרים של 10 מיליגרם למיליליטר proteinase K לצינור עבור דגירה של שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להגדיל את הטמפרטורה ל 65 מעלות צלזיוס לילה כדי להפוך crosslink המדגם. למחרת בבוקר, להשפיל את RNA עם 10 microliters של 10 מיליגרם למיליליטר RNAse A.After שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף נפח אחד של פנול כלורופורם לצינור ולערבב ביסודיות על ידי היפוך כדי להשיג שלב לבן הומוגני. לאחר ההאצה של הדנ"א על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, לכמת את ה- DNA באמצעות צבע פלואורוגני שנקשר באופן סלקטיבי ל- DNA ולפלואורומטר בהתאם להוראות היצרן.

כדי לטהר את הדנ"א מאליקוטות לא מעוכלות ומעוכלות, העמיסו 100 ננוגרם של דגימות לא מעוכלות, מעוכלות וקשירה על ג'ל של 1.5% אגרוז וחפשו מריחה שבמרכזה כ-500 זוגות בסיסים במדגם המעוכל לעומת רצועת משקל מולקולרית גבוהה לדגימה שנקשרה. כדי לאמת את יעילות הסימון והקשירה של Hi-C על-ידי הגברה ועיכול של אינטראקציה ידועה, לאחר PCR, לעכל את המוצרים עם Mbo1, Cla1 או שניהם, ולהפעיל את הדגימות על ג'ל חדש של 1.5 עד 2% כדי לאפשר הערכה של המספר היחסי של צמתים קשירת 3C ו- Hi-C. לאחר sonicating המדגם כדי להשיג 200 עד 500 שברי DNA זוג בסיס, להעביר 130 microliters עם חמישה מיקרוגרם של DNA מכל דגימה לתוך צינורות microcentrifuge חדש המכיל 16 microliters של 10X חיץ קשירה, שני microliters של 10 מילימולר dATP, חמישה microliters של T4 DNA פולימראז, ושבע microliters של מים מזוקקים כפולים עבור דגירה של 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להוסיף חמישה microliters של 10 מילימולר dNTPs, ארבעה microliters של 10X חיץ קשירה, חמישה microliters של T4 polynucleotide קינאז, microliter אחד של DNA פולימראז שבר אחד גדול, ו 25 microliters של מים מזוקקים כפולים לצינורות עבור דגירה שנייה 30 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. כדי לבחור שברים בעיקר בטווח הגודל של זוג הבסיסים 250 עד 550, בצעו את הבחירה ההפוכה של פאזה מוצקה רציפה וגודל הגיוס עם פי 0.6, ואז פי 0.9 בהתאם להוראות היצרן ולחמוק מה- DNA עם 100 מיקרוליטרים של טריס נמוך EDTA. עבור ביוטין משיכה למטה עבור כל ספריה, לשטוף 150 microliters של חרוזים מגנטיים הקשורים סטרפטאבידין פעמיים עם 400 microliters של חוצץ 1X Tween ולסובב את הדגימות במשך שלוש דקות על גלגל מסתובב.

בסוף הדגירה, יש להדק את החרוזים ב-300 מיקרוליטרים של פי 2 ללא חיץ טווין ולערבב עם 300 מיקרוליטרים של חומר Hi-C לסיבוב של 30 דקות על גלגל מסתובב. בסוף הדגירה, לשטוף את החרוזים עם 400 microliters של 0.5X Tween חוצץ עבור שלוש דקות דגירה ב 55 מעלות צלזיוס ו 750 סיבובים לדקה, ואחריו שתי שטיפות ב 200 microliters של חוצץ הגבלה 1X לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, resuspend החרוזים ב 100 microliters של תערובת זנב dATP עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, יש לחבר מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטרים של חיץ קשירה פי 1 והעבירו את המתלים לצינור חדש המכיל ארבעה מיקרוליטרים מראש של מתאמי קצה מזווגים ושני מיקרוליטרים של קשירת T4. לאחר שעתיים בטמפרטורת החדר, הסר את supernatant ולשטוף את החרוזים פעמיים עם 400 microliters של חוצץ Tween, ולאחר מכן לשטוף את החרוזים פעם אחת עם 200 microliters של חיץ Tween ללא חיץ Tween ופעם אחת עם 100 microliters של חוצץ הגבלה לפני השעיית החרוזים ב 40 microliters של חוצץ הגבלה 1X. מריחה של 200 עד 1, 000 זוגות בסיסים נצפתה כאשר הגבלה עם Mbo1 מצליחה.

אם קשירה מוצלחת, רצועת משקל מולקולרית גבוהה נצפתה בחלק העליון של הג'ל. יעילות העיכול יכולה גם להיות מאושרת על ידי PCR כמותי. יעילות עיכול מקובלת היא 80% ומעלה.

כפי שניתן להמחיש, ניתן להעריך את ההגברה של אינטראקציה ידועה בטווח בינוני במוצרי קשירה Hi-C על ידי עיכול של מוצר PCR התאושש בהגברה. יעילות עיכול של יותר מ -70%מומלץ להימנע משיעור גדול של קריאות לא שימושיות עבור הספריות לאחר הרצף. מספר מחזורי PCR עבור ההגברה הסופית צריך להיות מחזור אחד פחות ממספר המחזורים שעבורם ההכפשה גלויה.

רמת העיכול של הספרייה מציינת את השפע של זוגות Hi-C תקפים ומשקפת את שיעור הקריאות השימושיות שיתקבלו מהספרייה. באמצעות זוגות Hi-C חוקיים ייחודיים, ניתן לבצע ניתוח בסיסי של התפלגות הזוג. כפי שניתן לראות בדוגמה מייצגת זו, לוקוס גן NOTCH ניתן לראות יחד עם חלבונים אדריכליים, תחומים אחד ושתיים, ושינויי histone לאורך הלוקוס.

עם מחיקת האזור המכיל הן את אתרי כריכת ה- DNA של CTCF והן את אתרי כריכת ה- DNA של M1BP, ניתן לראות שינוי דרמטי באנשי הקשר הכרומטין. לאחר ניסוי Hi-C, ניתן לבצע כדי להגיע קבוצה ספציפית של אנשי קשר, למשל, מאזורי מקדם. זה שימושי במיוחד בעת הערכת גנומים גדולים.

כפי שהוכח, שילוב פרוטוקול Hi-C עם תוספת גנטית יכול לשמש להערכת התפקוד המבני והרגולטורי של אלמנטים גנומיים.