אלקטרופורזה הדנ א באמצעות Thiazole תפוז במקום אתידיום ברומיד או צבע חלופי

פרוטוקול זה הוא חלופה קלה וזולה לשימוש באתידיום ברומיד לגילוי DNA במהלך אלקטרופורזה. על ידי הסרת אתידיום ברומיד, אור UV או אור כחול יכול לשמש לגילוי. אור כחול אינו מזיק לדנ"א, מה שמגדיל את הסיכוי להצלחה בניסויים במורד הזרם.

זה ממש קל לנסות את זה. אתה רק צריך להחליף את האתידיום ברומיד בג'ל שלך עם תפוז תיאזולה. ראשית, הכינו 1%mini-gels על ידי ערבוב של כ-0.7 גרם אגרוז ב-70 מיליליטר של מאגרי טריס-אצטט-אדטה או טריס-בוראט.

לאחר מכן, להמיס כתום thiazole ב DMSO כדי להפוך את פתרון 10, 000X מניות. אמנם לא רגיש לאור במיוחד, לאחסן כתום thiazole בחושך כאשר לא בשימוש. לאחסון לטווח ארוך, הכינו אליקוטים מתערובת התיאזול הכתום-DMSO והקפיאו אותם.

לאחר מכן, מוסיפים כתום תיאזול לריכוז סופי של 1.3 מיקרוגרם למיליליטר, ומכניסים במיקרוגל את התערובת של חיץ אגרוז ותפוז תיאזולה כדי להמיס אגרוז במשך כ -60 שניות. יוצקים את תערובת אגרוז לתוך מנגנון יציקת ג'ל המכיל מסרק מתאים, ולאפשר את הפתרון agarose להתגבש לתוך ג'ל. כדי לטעון את הג'ל, ראשית למקם את הג'ל במנגנוני אלקטרופורזה, אם לא כבר נוכח.

לאחר מכן הוסיפו את מאגר הריצה TAE או TBE לכיסוי פני השטח של הג'ל. לאחר מכן, באמצעות צבע טעינה, לטעון 10 microliters של דגימת DNA. כלול סולם שינוי גודל DNA לעיון.

חבר את הכיסוי ואת האלקטרודות, ולהפעיל את מיני ג'ל ב 100 וולט עד צבע הטעינה נע כארבעה עד שבעה סנטימטרים עבור מיני ג'ל. אם תפוז תיאזולה לא הוחל לפני יציקת ג'ל, הכתם את הג'ל על ידי טבילתו במאגר המכיל תפוז תיאזולה עם תסיסה עדינה במשך כ -20 דקות או עד שהרצועות מזוהות במלואן. כדי לדמיין את הג'ל באמצעות טרנסילומינטור UV, הסר את הג'ל ממנגנוני האלקטרופורזה והצב אותו על טרנסילומינטור UV.

כדי לדמיין את הג'ל באמצעות transilluminator אור כחול או פנס, מניחים את הג'ל על transilluminator אור כחול או לכוון את פנס LED כחול על הג'ל מלמעלה או מתחת. השתמש במסנן פליטת ענבר כדי לסנן את האור הכחול, המאפשר הדמיה של פלואורסצנטיות מתסביך כתום תיזול DNA ולהגן על צבעים. לעיכול נוסף או קשירה, לגזור רצועות DNA הרצוי מן הג'ל ולהמשיך לחלץ DNA באמצעות ערכה זמינה או פרוטוקול.

בחר את הגדרות העירור וההפלה המתאימות במנגנוני הדמיית הג'ל. בהיעדר מערכת הדמיה עם מסננים מתאימים, מקם מסנן ענבר בין המצלמה למקור העירור של האור הכחול. מגבלות הגילוי דומות בין אתידיום ברומיד, תפוז תיאזול וצבע דנ"א מסחרי נפוץ לגילוי אור כחול, כאשר מגבלת הגילוי של כל שלושת הצבעים היא ננוגרם אחד עד שניים לכל נתיב במיני ג'ל.

ג'ל אגרוז מוכתם בכתום של תקציר הגבלה ניתן לגילוי כאשר הוא מתרגש עם UV או טרנסילומינטור אור כחול או עם פנס אור כחול. בעוד כתום thiazole נראה פחות מסוכן מאשר ברומיד אתידיום, ציוד מגן אישי סטנדרטי כגון כפפות ומ המשקפיים עדיין צריך להיות משוחק.