עבודה זו נתמכה על ידי לאומי כללי לרפואה למדעי של מכוני הבריאות הלאומיים דרך מעניקה 5P20GM103636-02 (כולל Flow Cytometry תמיכה הליבה) ו- 1R01GM121703, וכן פרסים מהמרכז אוקלהומה עבור תאי גזע בוגרים מחקר.

<ol>
	<li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing.">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).</li><li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation.">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li><li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells.">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation.">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), e245 (2008).</li><li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dynamics+of+replication+timing+revealed+by+in+vitro+models+of+mouse+embryogenesis.">Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis.</a> Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation.">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li><li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia.">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li><li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+correlations:+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution.">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li><li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research.">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li><li>Link, B. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+Model+for+Development.">Zebrafish as a Model for Development.</a> Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).</li><li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species.">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).</li><li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity.">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li><li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hooked!+Modeling+human+disease+in+zebrafish.">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li><li>Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+timing+during+development+anticipates+transcriptional+programs+and+parallels+enhancer+activation.">DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation.</a> Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).</li><li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing.">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

דג זברה לספק מערכת מודל חדש וייחודי ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA. מתי matings מתוזמן מבוצעות כפי המפורט בעלון זה נסיוני, אלפי עוברי ניתן לאסוף ביום אחד לניסויים. אלה העוברים לפתח באופן סינכרוני באמצעות בדיוק בעיתוי ומתאפיינות במובהק שלבי הפיתוח. דג זברה יכול להיות בקלות ובדייקנות מבוים על ...

עבור תאים לחלק בהצלחה, הם חייבים קודם בדייקנות ובנאמנות לשכפל את הגנום כולו שלהם. שכפול גנום מופיעה תבנית לשחזור, המכונה תוכנית1תזמון שכפול ה-DNA. תזמון שכפול ה-DNA הוא מתואם עם כרומטין הארגון, סימני epigenetic ג'ין ביטוי2,3. שינויים בתזמון שכפול להתרחש במהלך הפיתוח, ויש תוכניות באופן משמעותי הקשורים תעתיק והשינויים סימני כרומטין, ארגון4,5. יתר על כן, שכפול התזמון הוא מתואם עם תדרים mutational, שינויים בתזמון שנצפו בסוגים שונים של סרטן-6,-7,-8. למרות ההבחנות הללו, מנגנונים של גורמים של שכפול עיתוי הקמה ורגולציה ידועות עדיין במידה רבה, התפקיד אותו ממלא בהתפתחות ואת המחלה הוא לא נקבע. בנוסף, עד לאחרונה שכפול הגנום כולו עיתוי השינויים המתרחשים במהלך פיתוח חוליות רק נבדקו במודלים התרבות תאים.
דג זברה, רזבורה rerio, מתאימים היטב לימודים שכפול תזמון ויוו במהלך הפיתוח, כמו זוג ההזדווגות יחיד ניתן תשואות של מאות העוברים המתפתחים במהירות עם קווי דמיון רבים יונקים פיתוח9, 10. יתר על כן, במהלך פיתוח דג זברה, ישנם שינויים מחזור התא, כרומטין הארגון ותוכניות תעתיק החולקות קשרים עם תזמון שכפול הדנ א11. דג זברה הם גם מודל גנטי מעולה, כפי שהם נתונות במיוחד למניפולציות של transgenesis, מוטגנזה מכוונת, מוטציות יישוב, מסכי גנטי זיהו גנים רבים הדרושים עבור פיתוח חוליות12. לכן, דג זברה יכול לשמש לזיהוי גנים המעורבים שכפול עיתוי הקמה, אחזקה, כדי לבחון את ההשפעות של deregulating שכפול תזמון על פיתוח חוליות. קווים הטרנסגניים יכול לשמש גם כדי להעריך את תזמון שכפול של סוגי תאים בודדים מבודדת timepoints התפתחותיים שונים או בתנאים המחלה. חשוב, ישנם מודלים שונים דג זברה של מחלות אנושיות יכול לשמש כדי לחקור את התפקיד של שכפול תזמון המחלה היווצרות והתקדמות9,13,14.
לאחרונה, הפרופילים תזמון שכפול הראשון היו להפיק של דג זברה, ביסוס זה כמערכת מודל ללמוד שכפול עיתוי ויוו15. כדי לעשות זאת, תאים נאספו מעוברים דג זברה-בשלבים רבים של פיתוח, בסוג תא מבודד דג זברה למבוגרים. התאים היו אז לפי FACS (תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון) בהתבסס על תוכן ה-DNA כדי לבודד אוכלוסיות שלב G1 ו- S. באמצעות המדגם G1 כפקד מספר עותק, העתק מספר וריאציות בשלב S אוכלוסיות היו נחושים ומשמש להסיק שכפול היחסי תזמון16. שינויים בתזמון שכפול ניתן לאחר מכן ישירות להשוות בין סוגי תאים ודוגמאות התפתחותיים שונים, זה שימש לקביעת שינויים בתזמון שכפול המתרחשים ויוו במהלך פיתוח חוליות. שיטה זו מציעה כמה יתרונות על פני שיטות אחרות גנומית, בעיקר כי זה לא דורש תיוג עם תחליפי תימידין או immunoprecipitation של ה-DNA4,6.
. זה מפורט הפרוטוקולים של הגנום כולו פרופיל DNA שכפול תזמון-ברזולוציה גבוהה בדג זברה. פרוטוקולים אלה שימשו לקביעת יחסים עם תכונות גנומית של epigenetic הגנום דג זברה, כמו גם יצירת פרופיל שינויים ביחסים אלו שמתרחשות במהלך הפיתוח. פרוטוקולים אלה בקלות גם מותאמים ללמוד שינויים בתזמון שכפול זנים מוטציה של דג זברה, במודלים של המחלה. בנוסף, שיטות אלה מספקים בסיס ניתן להרחיב על ללמוד שכפול תזמון סוגי תאים ספציפיים, על-ידי מיון הראשון החוצה את סוגי תאים בודדים מ דג זברה. דג זברה יכול לשמש כמערכת מעולה ויוו דגם ללמוד שכפול תזמון וכדי לחשוף בסופו של דבר בפונקציות ביולוגיות של תכונה epigenetic חשובה זו.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td>protease solution</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Reagents for fluorescence-based DNA quantification</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>specialized tube for sonication</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>focused ultrasonicator</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>automated electrophoresis machine</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reagents for automated electrophoresis machine</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>multiplex oligos for DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>additional multiplex oligos for DNA library preparation kit</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>quantification kit for library preparation</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>magnetic beads</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&amp;ndash;401&amp;ndash;2501</td><td>next generation DNA sequencing platform</td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m Falcon Nylon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Dnase/Rnase free</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottles</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Low-Density Polyethylene, Wide Mouth</td></tr><tr><td>Strainer</td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6.9 cm, fine mesh</td></tr><tr><td>Corssing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>individual breeding tank</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>large breeding tank</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>cell sorting machine</td></tr><tr><td>Wild M5a steromicroscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>dissecting microscope</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>quantitative fluorescence-based method for determining DNA concentration</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>version 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>version 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>version 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

profiling dna replication timing using zebrafish as an in vivo model system

תזמון שכפול ה-DNA הוא מאפיין חשוב הסלולר, מפגין יחסים משמעותיים עם הכרומטין, שעתוק DNA מוטציה המחירים. מתרחשים שינויים בתזמון שכפול במהלך התפתחות של סרטן, אבל העיתוי שכפול תפקיד ממלא בהתפתחות, המחלה לא ידוע. דג זברה הוקמו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד שכפול תזמון. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש של דג זברה כדי לקבוע תזמון שכפול ה-DNA. לאחר מיון תאי העוברים, דג זברה למבוגרים, ניתן לבנות דפוסי תזמון שכפול DNA הגנום כולו ברזולוציה גבוהה על-ידי קביעת שינויים מספר עותק DNA בעזרת ניתוח של נתונים רצף ' הדור הבא '. דג זברה מודל המערכת מאפשרת הערכה של השינויים תזמון שכפול להתרחש ויוו במהלך ההתפתחות, והוא יכול לשמש גם כדי להעריך שינויים סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה או הקווים המוטנטים. שיטות אלה יאפשרו מחקרים חוקרת את מנגנוני ואת גורמים של שכפול עיתוי הקמה, אחזקה במהלך הפיתוח, העיתוי שכפול תפקיד ממלא מוטציות tumorigenesis, ואת ההשפעות של perturbing תזמון שכפול על פיתוח ומחלות.

באמצעות נתוני תזמון שכפול שפורסמו, שכפול נציג תזמון פרופילים אמצעי בקרה הינם מסופקים15. השלבים הראשונים של עיבוד לערב יישור הנתונים רצף הגנום, חישוב אורך הקריאה סטטיסטיקות כיסוי של הגנום וסינון באיכות נמוכה, אינטראקצית, ו- PCR קריאות כפולים. קריאה סטטיסטיקה עב...

Watch this Scientific Journal Video about Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System at JoVE.com

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

7.8K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation. דג זברה שימשו לאחרונה מערכת מודל ויוו ללמוד תזמון שכפול ה-DNA במהלך הפיתוח. . זה מפורט הפרוטוקולים עבור שימוש דג זברה העוברים של פרופיל שכפול תזמון. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות ללמוד שכפול תזמון מוטציות, סוגי תאים בודדים, מודלים המחלה ו מינים אחרים.

Video: Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Developmental Biology

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג חלבון פלואורסצנטי בזחלי דג זברה באמצעות CRISPR/Cas9 Knock-In

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

פרופיל תזמון שכפול ה-DNA באמצעות דג זברה כמערכת מודל In Vivo

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

מיצוי DNA תפוקה גבוהה, Genotyping של הזחלים דג זברה 3dpf על-ידי המסיכה פין

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

דג הזברה שלמים הר ברזולוציה גבוהה פעמיים פלורסנט באתרו הכלאה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

תיוג פלואורסצנטי להמחשת חלבונים בעלי ביטוי נמוך בדג הזברה

בחינת התחדשות שרירים במודלים של דגי זברה של מחלת שרירים

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio