הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

זברפיש מתגלה כמודל בעלי חוליות מצוין לחקר אירועי הכרומוזום של מיוזיס כולל זיווג כרומוזום הומולוגי, סינפסיה וקומבציה. פרוטוקול הפצת פני השטח הגרעיניים הזה איפשר לנו לדמיין תכונות מפתח של ארכיטקטורת כרומוזום מיוטית באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציית-על. החוקרים יכולים לצפות למאות גרעינים מפוזרים היטב לכל שקופית עם פחות פסולת מאשר פרוטוקולים אחרים של התפשטות זברה.

החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של הליך זה הוא ניתוח של האשכים zebrafish כפי שהוא בסמיכות לעור והוא מחובר גם לאיברים אחרים. הדמיה של הליך הניתוח תאפשר לחוקרים לדעת למה לצפות כשהם רואים את הקנאד מוטבע ברקמת החיה. לאחר המתת דם של דגי זברה זכרים, ערפו את ראשו של דג אחד בכל פעם במספריים קטנים ולאחר מכן השתמשו במספריים זעירים כדי לחתוך לאורך קו האמצע הגחוני כדי לחשוף את חלל הגוף.

מניחים את הדגים בצלחת פטרי מצופה סיליקון ומכסים על ידי בריכה רדודה של 1X PBS. תחת מיקרוסקופ בהגדלה של פי 1.65, לנתח את האשכים באמצעות מדפים. הסר ככל שומן הרקמה שמסביב מן האשכים ככל האפשר.

הקנאד ייראה שקוף תחת אור היקף הניתוח בעוד השומן שמסביב עשוי להיות מראה מעט כהה יותר. כמות מסוימת של שומן ניתן להשאיר על gonad מבלי לעכב את ההליך. מוסיפים כל אשך נותח ישירות לתוך צינור חמישה מיליליטר עם שני מיליליטר של DMEM ולשמור על קרח.

כדי לנטרל את תאי האשכים, להוסיף 200 microliters של פתרון קולגן לצינור חמישה מיליליטר עם האשכים. מערבבים את הפתרון על ידי היפוך אותו מספר פעמים. לנער בעדינות את האשכים בשייקר אינקובטור אופקית ב 100 סל"ד ב 32 מעלות צלזיוס.

במהירות להפוך את הצינור כל 10 דקות כדי להקל על דיסוציאציה. לאחר שעה, ה- DMEM מעונן והתרכים נמצאים בגושים קטנים. בעוד האשכים הם דגירה קולגנס, לפני המלחמה 100 microliters של 0.1 פתרון סוכרוז טוחנת ל 37 מעלות צלזיוס.

כדי לשטוף את הקולגנס, להוסיף DMEM לנפח סופי של חמישה מיליליטר ולהפוך את הצינור כמה פעמים. גלולה האשכים ב 200 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. הסר שלושה מיליליטר של העל-טבעי כך שנותרו רק שני מיליליטר.

חזור על שטיפה DMEM פעמיים נוספות. לאחר לשטוף DMEM האחרון, להסיר ארבעה מיליליטר של supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של DMEM, 200 microliters של פתרון טריפסין, ו 20 microliters של פתרון DNase I. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב את הפתרון.

לנער אופקית את הצינור ב 32 מעלות צלזיוס ב 100 סל"ד. הפוך במהירות את הצינור כל חמש דקות כדי להקל על דיסוציאציה. לאחר חמש עד 15 דקות, פתרון DMEM מכיל רק כמה גושים.

הוסף 500 מיקרוליטרים של פתרון מעכבי טריפסין ו 50 microliters של פתרון DNase I. להפוך את הצינור כמה פעמים כדי לערבב ואז לסובב בקצרה למטה ב 200 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר נוזלים או גושים שעשויים לדבוק כובע הצינור או בצד של הצינור. מניחים את הצינור על קרח ומעבירים מחדש את מתלי התא על ידי צינורות שוב ושוב למעלה ולמטה עם פיפטה העברת פלסטיק במשך שתי דקות כדי להקל על דיסוציאציה של כל הגושים הנותרים.

ודא כי ההשעיה התא לא להיכנס הנורה של פיפטה העברה. ואז הרטיב מראש מסננת תא 100 מיקרון עם DMEM והמקם אותו על גבי צינור 50 מיליליטר על קרח. מעבירים את ההשעיה התא דרך מסננת טיפה אחת בכל פעם באמצעות פיפטה העברת פלסטיק.

מעבירים את הסינון באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק לצינור חדש של חמישה מיליליטר. הקפד לאסוף את התאים המחוברים לצד התחתון של המסנן. הוסף DMEM לתוך הצינור לנפח סופי של חמישה מיליליטר.

גלולה התאים ב200 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה ולהוסיף חמישה microliters של פתרון DNase אני ישירות לתוך גלולה. ואז לערבב את גלולה עם פתרון DNase אני על ידי גירוד בעדינות את החלק התחתון החיצוני של הצינור ארבע עד חמש פעמים לאורך מתלה צינור microcentrifuge ריק.

הוסף DMEM לנפח סופי של חמישה מיליליטר ומערבבים את הפתרון על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. גלולה ההשעיה התא ב 200 גרם במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. חזור על הטיפול DNase עוד פעם עד שלוש פעמים עד גלולה לשימוש חוזר לא גוש על תוספת של DMEM.

לאחר הספין האחרון, להסיר ככל supernatant ככל האפשר מבלי להפריע גלולה. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של 1X PBS ו resuspend את גלולה על ידי בעדינות מגרד את החלק התחתון החיצוני של הצינור לאורך מתלה צינור ריק. גלולה ההשעיה התא ב 200 גרם במשך חמש דקות ולאחר מכן להסיר על טבעי ככל האפשר מבלי להפריע גלולה.

חותכים שלושה מילימטרים מקצה קצה פיפיאט 200 מיקרוליטר כדי להרחיב את הצמצם. עם קצה פיפטה לחתוך, resuspend את גלולה ב 80 microliters של 0.1 פתרון סוכרוז טוחנת על ידי צינור למעלה ולמטה. תן להשעיית התא לשבת בטמפרטורת החדר במשך שלוש דקות.

לאחר מכן, עם קצה פיפטה, מצפים שקופית אחת עם 100 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד עם 0.15% טריטון X-100. לאחר מכן להוסיף 18 microliters של ההשעיה תא סוכרוז על מרכז השקופית בקו ישר בניצב לקצה הארוך. הטה את השקופית קדימה ואחורה כדי להקל על התפשטות מתלי התא לכל הפינות.

מניחים את השקופיות שטוח למטה בתא לחות פתוח סדוק מעט כדי למנוע את פתרון פורמלדהיד מלהיות ייבוש. מניחים את תא הלחות במגירה כהה בן לילה. בבוקר, מוציאים את המכסה מתא הלחות ומאפשרים לשקופיות להתייבש לחלוטין.

מניחים את המגלשות בצנצנת קופלין ואז ממלאים את צנצנת הקופלין במים מזוקקים. דגירה במשך חמש דקות עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. יוצקים את המים וממלאים את הצנצנת בסוכן הרטבה אחד עד 250.

לשטוף פעמיים במשך חמש דקות כל אחד עם רעידות עדינות בטמפרטורת החדר. אפשרו לשקופיות להתייבש לחלוטין ולאחסן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שהן מוכתמות. פרוטוקול זה התווה שיטה להכין ולדמיין את התפשטות זרע דג הזברה המניבה גרעינים שאינם חופפים היטב.

הלוחות משמאל מציגים שלושה שלבים של פרופאזה מיוטית, לפטוטן, זיגוטן מוקדם ופצ'יטין. הטלומרים היו מגנטה מוכתמים לכל שלב. דוגמה של ממרחים באיכות ירודה בשל טיפולים DNase אני מספיק מוצגים כאן.

כרומוזומים מיוטיים מוכתמים עבור SYCP3 מצביעים על גרעינים חופפים עקב השעיית תא סוכרוז צמיג המונעת מתאים להתפשט כראוי בשקופית. חשוב מאוד להתחיל עם הכמות הנכונה של חומר התחלתי, לטפל אשכי זברה במשך הזמן המתאים טריפסין, ולבצע את המספר הדרוש של טיפולים DNase אני כמו כישלון לעשות זאת יכול להוביל מעט מאוד גרעינים או גרעינים מגושמים. PPE הנכון תמיד צריך להיות משוחק בעת עבודה עם פורמלדהיד.

בעקבות הליך ההתפשטות, כרומוזומים יכולים להיות מוכתמים כדי לדמיין מבנים כרומוזומליים שונים, כמו גם הפסקות גדיל כפול כדי לנתח את התלות בעיתוי לוקליזציה של אירועים meiotic. הטכניקה שלנו סללה את הדרך להראות כי דג זברה עשוי להיות מודל טוב יותר של זרע אנושי מאשר עכבר המבוסס על תכונות כרומוזום זר הטלומר.