Agradecemos al programa de doctorado de biociencias moleculares (MOBI) y el Departamento de biología en Tennessee medio estado Universidad (MTSU) para proporcionar el financiamiento para este estudio. El proyecto también fue financiado en parte por una subvención de proyectos especial concedida al D.E.N. de la Fundación de MTSU.

Nota: C. neoformans es un patógeno de bioseguridad nivel 2 (BSL-2) y los investigadores que trabajan con él deben tomar las precauciones adecuadas. Procedimientos detallados sobre cómo con seguridad trabajo con patógenos de BSL-2 se encuentra en el centro for Disease Control (CDC) sitio web, pero es importante tener en cuenta que todas las personas que entran en contacto con C. neoformans deben ser debidamente entrenadas en el manejo de agentes patógenos y deben usar siempre equipo de protección personal (EPP), generalmente de látex o guantes de nitrilo. Además, los rotores en las centrífugas deben sellarse para evitar aerosolización de muestras y cualquier derrame, limpiada inmediatamente con una solución de cloro 10%28.
1. cápsula inducción
Nota: Todas las medidas deben realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
<ol><li>Cultura de C. neoformans en caldo de levadura peptona dextrosa (YPD) (pH 6.5 +/-0.2) e incube a 37 ° C con agitación hasta que estén en fase logarítmica (aproximadamente 18-36 h).</li>
	<li>Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C y lavar tres veces con tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Utilizar un hemocitómetro o un contador de células automatizado para contar las células y resuspender en 2 x 105 células/2 mL en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>Para inducir la cápsula, incubar a 37 ° C y 5% CO2 para 18 h. Nota: La combinación de la ausencia de nutrientes en los medios de comunicación y la presencia de CO2 estimula el crecimiento de cápsula de C. neoformans .</li>
	<li>La incubación, cosechar las células por centrifugación (como arriba) y quitando todo, pero 5-10 μl de sobrenadante. Al mismo tiempo, recoger una muestra celular no inducida correspondiente para cada cepa que se medirá. Utilizarlos como controles negativos. Nota: Los pellets de células serán muy pequeños y pueden ser difíciles de ver. Tenga cuidado al aspirar el sobrenadante.</li>
	<li>Tinción con tinta china (sección 2.1) o con colorantes fluorescentes (sección 2.2).</li>
</ol>2. coloración
<ol><li>
Tinción con tinta de la India sólo
	<ol>
<li>Para teñir la levadura con la tinta de la India, Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y añadir 4μL (aproximadamente la mitad) de la suspensión celular y 4μL de tinta de la India sobre un portaobjetos de vidrio. Suavemente la mezcla y evitar la formación de espuma.</li>
		<li>Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción con sólo tintes fluorescentes
	<ol>
<li>Para teñir la levadura con un colorante fluorescente, Resuspender el precipitado de células en 50 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
		<li>Incubar el cultivo con un volumen igual de blanco de calcoflúor (CFW) (1 μg/mL) y mAb cápsula 18B7 (véase Tabla de materiales) conjugado con AlexaFluor488 (AF488) (10 μg/mL) durante 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Centrifugar las células a 870 x g durante 5 minutos a 21 ° C la incubación y aspirar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 10 μl PBS con 1% de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
		<li>Pipeta 8 μl de suspensión celular en un portaobjetos de vidrio.</li>
		<li>Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tinción con tinta china y colorantes fluorescentes
	<ol>
<li>Para comparar más directamente la eficacia de la tinta de la India la coloración a la de los tintes fluorescentes, conjuntamente se tiñen de la misma población celular con ambos tipos de manchas. Para ello, primero incubar las células con una cápsula fluorescente y la mancha de la pared celular, según pasos 2.2.1 - 2.2.3.</li>
		<li>A continuación, pipetear volúmenes iguales (4 μL) de la suspensión celular tinción fluorescente y tinta china sobre un portaobjetos de vidrio. Mezclar suavemente.</li>
		<li>Aplica un cubreobjetos de vidrio de 13 mm (#1.5 de espesor) y sellar los bordes con un sellador no tóxico (pulimento de clavo claro) para evitar que la muestra se seque.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. imagen adquisición/microscopía
<ol><li>
Imagen de células teñidas con tinta de la India.
	<ol>
<li>Adquisición de imágenes mediante un microscopio óptico estándar (100 aumentos).</li>
		<li>Imagen de un mínimo de 50 células por condición. Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo, ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado). Para estos experimentos, se adquirieron imágenes a una profundidad de 16 bits con tiempos de exposición optimizados para maximizar el contraste de la imagen al tiempo que minimiza el desenfoque causado por pequeños movimientos de las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagen de células teñidas con colorantes fluorescentes
	<ol>
<li>Para las células de la imagen por microscopía de fluorescencia, abra el software de imágenes de microscopio y seleccione adecuados longitudes de onda de excitación y emisión de los fluoróforos utilizado (CFW y AF488 están entusiasmados con el 405 nm y luces de 488 nm, respectivamente). Adquisición de imágenes mediante un microscopio de fluorescencia.</li>
		<li>Imagen de un mínimo de 50 células por condición. Nota: Puede variar el número de células por campo, y esto es aceptable. Es importante, sin embargo, esa superposición de las células mantenerse a un mínimo ya que son difíciles de medir (manual y con software automatizado).</li>
		<li>Adquirir una serie de imágenes z-stack de las células para asegurar que se obtiene el diámetro máximo de la cápsula para cada celda dentro de un campo determinado.<ol>
<li>En el software de control de microscopio, haga clic en la barra "z-stack" para abrir el panel de control "z-stack", luego seleccione la opción "Primero, último" en la esquina superior izquierda del panel.</li>
			<li>Utilice el control fino de enfoque en el microscopio para enfocar a un nivel que está por debajo del punto más ancho de una célula de levadura sola y las cápsulas para todos dentro del campo de visión actual y haga clic en "Establecer primero".</li>
			<li>Utilice el control fino de enfoque para enfocar sobre el punto más ancho del cuerpo celular de la célula misma y de la cápsula para todas las celdas dentro del campo de visión actual y haga clic en "Set pasado".</li>
			<li>Haga clic en "Iniciar el experimento" en la pestaña de "Adquisición" para adquirir el z-stack para la posición actual. Repita el proceso en varias posiciones hasta que se han adquirido imágenes z-stack de al menos 50 células. Nota: Para estos experimentos, el agujero de alfiler confocal se establece en 1.0 UA y una superposición serie z de 10-20 rebanadas cubriendo 0,7 μm fueron adquiridas en las posiciones elegidas. UA = unidad de Airy.</li>
		</ol>
</li>
		<li>A continuación, convertir cada serie z-stack proyecciones de máxima intensidad (MIP) utilizando el software de análisis de imagen adecuada. Nota: MIPs proyecto la mayor intensidad en cada plano de la imagen apilada29. Creación de MIPs permite producir una representación 2D de imágenes que corresponden a la célula máxima y el diámetro cápsula dentro de la pila 3D capturado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagen de células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes
	<ol>
<li>Adquisición de imágenes con un microscopio confocal o campo amplio (40 aumentos) (63 X o 100 X de ampliación). Para las células teñidas con tinta china y colorantes fluorescentes, capturar imágenes mediante un microscopio de campo amplio equipado con una etapa controlada por ordenador y el objetivo de inmersión de aceite. Nota: El microscopio en uso debe controlarse mediante un software de proyección de imagen CFW. fluorescencia que es excitado a través de un filtro de excitación de 340-380 nm y emite luz debe ser detectada a través de un filtro de barrera 435-485 nm reflejado por un espejo dicroico de 400 nm. AF488 fluorescencia puede ser excitada a través de un filtro de excitación de 465-495 nm y luz emitida puede ser detectada a través de un filtro de barrera de 515-555 nm reflejado por un espejo dicroico de 505 nm.</li>
		<li>Un mínimo de 50 células por condición para cada método de coloración de la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. manual medición de cápsula
<ol><li>Para las células teñidas con tinta de la India o las manchas fluorescentes, utiliza un software de medición célula manualmente medida cápsula y célula de diámetro (véase Tabla de materiales). Para ello, vaya a "Archivo" > "Abrir imagen" > "Medida" y utilice el cursor para trazar una línea recta a través del punto más ancho de la célula entera (diámetro total).</li>
	<li>A continuación, haga clic en "Medida" otra vez y trazar una línea recta a través del cuerpo de la célula (diámetro del cuerpo de la célula). Nota: Las mediciones son almacenados automáticamente en las células.</li>
	<li>Repita este proceso para todas las celdas (mínimo 50/grupo).</li>
	<li>Para guardar las imágenes una vez que se midieron, haga clic en "Archivo" > "Guardar como" y nombrar las imágenes adecuadamente.</li>
	<li>Seleccione los archivos recién medidos y exportar datos a un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Calcular el diámetro medio de la cápsula mediante la ecuación: ([diámetro total] - [cuerpo de la célula diámetro]).</li>
</ol>5. automáticos de medición de la cápsula
Nota: Para éxito automáticos de medición, utilice imágenes de 16 bits con un alto nivel de contraste y que están correctamente enfocados junto con un software de análisis de imagen apropiado (véase Tabla de materiales). Cuando proyección de imagen C. neoformans para la medición de la cápsula, es importante centrarse en el anillo oscuro en el límite entre la pared celular y cápsula. Esto permite que el software delinear correctamente el celular y la cápsula.
<ol><li>Invertir y crear una copia de toda la tinta India manchados imágenes de celular utilizando un software de edición de imágenes adecuado (véase Tabla de materiales). Para ello, haga clic en "Archivo" > "Abrir" para abrir tinta India teñida de imágenes y luego de "Control" + "I" para invertir la imagen. Haga clic en "Archivo" > "Guardar como" para guardar la imagen invertida.</li>
	<li>Importar tanto el original como invertida imágenes en el software haga clic en "Archivo" > "Importar secuencia" > "Carga de imagen" > "Definir secuencia (manualmente)" > "Dimensiones (canal)" > "Importar" > "Aplicar". Nota: Los cuerpos celulares de C. neoformans y cápsulas pueden identificarse y enmascararon utilizando algoritmos específicos - contempladas como 'recetas' - incluidos en el software.</li>
	<li>Utilice la receta de la 'Colonia analizador (fluorescencia)' la imagen invertida para detectar y enmascaran el cuerpo de la célula, y haga clic en "aplicar". En la imagen invertida, el anillo oscuro de definir el límite de la célula de C. neoformans se convierte en más brillante que la cápsula circundante.</li>
	<li>Use la receta del 'Analizador (fluorescencia) de la Colonia' en la imagen invertida a los cuerpos celulares de C. neoformans de sus cápsulas del segmento, a continuación, haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cuerpo celular" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta". Nota: La receta consiste en múltiples pasos de procesamiento de la imagen: fondo de retiro, detección de objetos, separación de objeto y subconjunto filtrado.</li>
	<li>A continuación, utilice la receta de 'Proliferación celular' en la imagen original para detectar y enmascaran el cápsula y haga clic en "aplicar". Esto crea una máscara de cuenta. Cambiar el nombre de esta máscara de cuenta "Cápsula" pulsando la pestaña con la etiqueta "máscara de cuenta".</li>
	<li>La receta, 'Cápsula de partición', crear una nueva máscara a la imagen original para particionar cápsulas adyacentes uno del otro. Para ello, haga clic en "Partición de cápsula" en el menú desplegable de receta. En el cuadro de la partición de la cápsula, elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cápsula" (5.5) para la región de la cápsula. Elegir la máscara de cuenta ahora se llama "Cuerpo celular" para las células Crypto (5.4). Elegir "Original" para el canal de entrada y "crear máscara de cápsula de particionado. Haga clic en "aplicar Nota: La receta genera células y diámetro de la cápsula, definido como el promedio de los ejes más largo y más cortos atravesando el centro de la célula y la cápsula y las mediciones de área de máscaras de detección. Encontrar la salida que se encuentra en la pestaña de la hoja de cálculo de este software. Repita este proceso para todas las imágenes (mínimo de 50 células/grupo). Parámetros de la receta podrían ajustados para optimizar la detección de imágenes individuales u optimizados para la detección de lotes de varias imágenes. Medidas adicionales pueden calcularse por la receta para la caracterización completa de la célula y morfología de la cápsula.</li>
	<li>Exportar datos a un software de hoja de cálculo de elección para su posterior análisis.</li>
</ol>

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

El autor, Hoyin Lai, es el Gerente de producto en DRVision que publica el software de análisis de imagen automatizado, Aivia.

Durante décadas, la cápsula ha sido un importante foco de investigación para micólogos y médicos interesados en C. neoformans y criptococosis debido a su papel como factor de virulencia importante para el patógeno. Mediante microscopía para medir diferencias en el tamaño de la cápsula entre cepas y bajo crecimiento diferentes condiciones pueden proporcionar información importante sobre el patógeno y sus respuestas a varios estímulos(es decir, diferentes condiciones ambientales, posibles trat...

Afectando a un cuarto de millón de personas cada año y resultando en más de 180.000 muertes al año, Cryptococcus neoformans es una levadura patógena, intracelular y el agente causante de la criptococosis1,2, 3. más afectados son los pacientes VIH-positivos en los países pobres que no tienen acceso a tratamiento antirretroviral, lo que los hace muy susceptibles a la enfermedad4,5,6. Datos de los CDC indican que en el África subsahariana, C. neoformans mata más personas que la tuberculosis anualmente más cada mes y que cualquier brote de Ébola en el registro1. La vía más común de exposición ocurre por inhalación de esporas desecadas que son comunes en el medio ambiente7. Al entrar en los pulmones, hay varios factores de virulencia que contribuyen al éxito de C. neoformans en los individuos infectados. La cápsula de polisacárido se considera factor de virulencia principal del microbio, como acapsular cepas no virulentas8.
La cápsula de Cryptococcus se compone de tres componentes del principio: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) y manoproteínas (MPs)9. Mientras que los diputados son un componente relativamente de menor importancia asociada a la pared celular de la cápsula, son inmunogénicos y pueden promover una respuesta sobre todo pro-inflamatoria9,10. Por el contrario, GXM y GalXM conforman la mayor parte de la cápsula (> 90% en peso) y tienen efectos inmunosupresores11. Además de sus efectos inmunomoduladores, la ampliación rápida de la cápsula en vivo crea una barrera mecánica a la ingestión por las células fagocíticas (es decir, neutrófilos y macrófagos) del anfitrión12. La cápsula de C. neoformans y la síntesis son complejas, pero en general, mayor diámetro cápsula se correlaciona con mayor virulencia6,13,14. Ante esto, es importante para los investigadores de C. neoformans ser capaces de forma rápida y precisa cuantificar las mediciones de la cápsulas.
Las células de C. neoformans y su cápsula de polisacáridos son estructuras dinámicas y muestran cambios en tiempo15. La cápsula puede cambiar en densidad, tamaño y montaje en respuesta a cambios en el entorno de host16,17,18. Hierro bajo o los niveles de nutrientes, exposición al suero, el pH fisiológico humano y aumento de CO2 se saben que iniciar crecimiento cápsula16,18,19,20. Además, los investigadores han demostrado cambios estructurales dando como resultado diferencias significativas en el immunoreactivity durante una infección, una ventaja a C. neoformans sobre su huésped los préstamos21,22. Esto se conoce porque la arquitectura de la cápsula de C. neoformans ha sido analizada en una variedad de maneras. Por ejemplo, microscopía electrónica, ha revelado que la cápsula tiene una matriz heterogénea con una capa interna de electrón-densos debajo de una capa externa, más permeable23. Dispersión de la luz y el uso de pinzas ópticas han permitido a los investigadores aclarar más lejos sus características macromoleculares24. Analizar los resultados de ambas mediciones de la dispersión ligera estática y dinámica, sabemos que la cápsula de polisacárido tiene una compleja ramificación de la estructura23. Pinza óptica se han utilizado para probar la rigidez de la estructura así como evaluar su reactividad anticuerpo del24. Sin embargo, el más frecuentemente empleado análisis de la cápsula de C. neoformans es la medida de su tamaño.
Para cuantificar el tamaño de la cápsula, los investigadores utilizan lo que debería ser una medida simple: el diámetro lineal de la cápsula. Microscopios digitales se utilizan para capturar imágenes de múltiples células de C. neoformans (generalmente cientos) teñidos con tinta china o con colorantes fluorescentes. Se mide el tamaño de cada cuerpo celular y la cápsula circundante. Los datos son compilados, y el diámetro medio de la cápsula se calcula restando el diámetro del cuerpo de la célula del diámetro entero de la célula (célula corporal + cápsulas). Hasta este punto, estas mediciones se han realizado manualmente. Mientras que generalmente precisa, este método tiene inconvenientes para los investigadores. Conjuntos de datos grandes puede tomar días o incluso semanas para analizar con la mano. Y ya que estas mediciones se hacen manualmente, subjetividad y el error humano pueden afectar el resultado.
Análisis de imagen Computacional automatizado se ha convertido en una herramienta indispensable para los investigadores en muchas áreas de la biología molecular de la célula, lo que posibilita un análisis más rápido y más fiable de imágenes biológicas 25,26,27. Técnicas de análisis de imágenes precisos son necesarias para extraer información cuantitativa de lo que a menudo son complejos e inmensos conjuntos de datos. Sin embargo, algunas medidas, especialmente la medición de la cápsula de C. neoformans , han sido difíciles de automatizar. Identificar con precisión la interfaz entre la pared celular y cápsula, que generalmente aparece como un anillo oscuro cuando imágenes por microscopia de contraste de fase, puede ser problemática a resolver mediante un simple umbral. Además, las células de C. neoformans en cultivo tienden a agruparse y precisa segmentación de las células es necesario para las medidas exactas.
El objetivo de este proyecto fue para (i) ilustrar uno de los protocolos estándar para la inducción de cápsula de C. neoformans, (ii) Comparar y contrastar la tinta India y tinción de fluorescencia relativas para mediciones del diámetro de la cápsula (iii) desarrollar simple, métodos computacionales para medir diámetro cápsula utilizando imágenes de tinta de la India manchadas las células usando un software de análisis de imagen y, (iv) evaluación los beneficios y limitaciones de diámetro de la cápsula de medición manualmente y utilizando la automatización del software. Encontramos que de los dos métodos de tinción, fluorescentes de la pared celular y cápsula, mientras más desperdiciadores de tiempo, proporciona los resultados más consistentes entre experimentos. Sin embargo, ambos métodos nos permitieron distinguir correctamente entre laboratorio y clínica C. neoformans exhibe diferentes cepas cápsula tamaños. Además, fuimos capaces de automatizar la medición de diámetro cápsula de tinta manchada imágenes y encontró que ésta era una alternativa viable para medición manual de la cápsula.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

La cápsula de polisacárido de Cryptococcus neoformans es el factor de virulencia principal y uno de los más comúnmente estudiados aspectos de esta levadura patógena. Tamaño de la cápsula puede variar ampliamente entre cepas, tiene la capacidad de crecer rápidamente cuando introdujo a estrés o bajo condiciones de nutrientes y se ha correlacionado positivamente con la virulencia de la cepa. Por estas razones, el tamaño de la cápsula es de gran interés para los investigadores de C. neoformans . El crecimiento de la cápsula de C. neoformans es inducido durante la prueba fenotípica para ayudar a comprender los efectos de diferentes tratamientos sobre las diferencias entre cepas de levadura o el tamaño. Aquí describimos uno de los métodos estándar de cápsula inducción y comparar dos métodos aceptados de coloración y diámetro de la cápsula de medición: tinta de la India (i), una tinción negativa, utilizado conjuntamente con microscopía óptica convencional y (ii) Co la coloración con tintes fluorescentes de la pared celular y cápsula seguido por microscopia confocal. Por último, os mostramos cómo medida de diámetro cápsula de muestras manchadas de tinta de la India puede ser automatizado usando análisis de imagen Computacional.

Para ilustrar la cápsula inducción celular tinción, proyección de imagen y técnicas de medición, se utilizaron tres cepas de neoformans de la C.: colar el laboratorio común, bien caracterizado, H99S30y dos cepas clínicamente aisladas de previamente diámetro cápsula desconocido, B18 y B5231.
El flujo de trabajo de inducción cápsula, tinción y adquisición de la...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K vistas.  Middle Tennessee State University. La cápsula de polisacárido es el factor primario de virulencia Cryptococcus neoformans, y su tamaño se correlaciona con la virulencia de la cepa. Medidas diámetro cápsula se utilizan en las pruebas fenotípicas y medir eficacia terapéutica. Aquí se presenta un método estándar de inducción cápsula, y se comparan dos métodos de tinción y medición de diámetro.

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Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Separación de bacterias por cápsulas cantidad usando un gradiente de densidad discontinuo

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Investigación

Genética

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

El uso de citometría de imagen para la cuantificación de hongos patógenos en asociación con las células huésped

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Inmunología e Infección

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

La visualización no lítico exocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Medición automatizada de la cápsula de polisacárido de Cryptococcus especies y cuerpo de la célula

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioingeniería

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Microdilución en Vitro proyección de caldo: un método fácil y rápido para detectar nuevos compuestos antimicóticos

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biología

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

Evaluación de las propiedades anticriptocócicas putativas de extractos crudos y clarificados de moluscos

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

Resumen

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