Ringraziamo il programma di dottorato di scienze biologiche molecolari (MOBI) e il dipartimento di biologia a Middle Tennessee State University (MTSU) per fornire i finanziamenti per questo studio. Il progetto è stato inoltre finanziato in parte da una sovvenzione di progetti speciali per D.E.N. dalla Fondazione MTSU.

Nota: C. neoformans è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL-2) e i ricercatori che lavorano con esso devono prendere le dovute precauzioni. Procedure dettagliate su come sicuro lavoro con agenti patogeni BSL-2 può essere scoperto sul Center for Disease Control (CDC) sito Web, ma è importante notare che tutte le persone che vengono a contatto con il c. neoformans devono essere adeguatamente addestrate nella gestione gli agenti patogeni e dovrebbe sempre indossare appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE), generalmente in lattice o nitrile guanti. Ulteriormente, rotori su centrifughe devono essere sigillati per evitare la nebulizzazione dei campioni e tutte le cadute ripulite immediatamente utilizzando una soluzione di candeggina al 10%28.
1. capsula induzione
Nota: Se non specificato diversamente, tutti i passaggi dovrebbero essere eseguiti a temperatura ambiente.
<ol><li>Cultura di c. neoformans in brodo di lievito peptone destrosio (YPD) (pH 6,5 + /-0.2) e incubare a 37 ° C con agitazione fino a quando sono in fase di log (circa 18-36 h).</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a 21 ° C e lavare tre volte con tamponato fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Utilizzare un emocitometro (o un contatore di cellule automatizzato) per contare le celle e risospendere a 2 x 105 cellule/2 mL in media essenziali minimi di Dulbecco (DMEM).</li>
	<li>Per indurre la capsula, incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 18 h. Nota: La combinazione di assenza di sostanze nutritive nei media e la presenza di CO2 stimola la crescita capsula c. neoformans .</li>
	<li>Post-incubazione, raccogliere le cellule centrifugazione (come sopra) e rimuovendo tutti, ma 5-10 µ l di supernatante. Allo stesso tempo, raccogliere un campione di ONU-indotta delle cellule corrispondenti per ogni sforzo deve essere misurata. Utilizzare questi come controlli negativi. Nota: Il pellet cellulare sarà molto piccolo e può essere difficile da vedere. Prestare attenzione quando aspirare il surnatante.</li>
	<li>Macchiare con l'inchiostro di India (sezione 2.1) o coloranti fluorescenti (sezione 2.2).</li>
</ol>2. colorazione
<ol><li>
Colorazione con solo inchiostro di India
	<ol>
<li>Per macchiare il lievito con l'inchiostro di India, risospendere il pellet nel surnatante restante e aggiungere 4μL (circa metà) della sospensione cellulare e 4μL di inchiostro di China su un vetrino per microscopio. Delicatamente mescolare ed evitare la formazione di schiuma.</li>
		<li>Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione con solo le tinture fluorescenti
	<ol>
<li>Per macchiare il lievito con un colorante fluorescente, risospendere il pellet cellulare in 50 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).</li>
		<li>Incubare la cultura con un volume uguale di Calcofluor white (CFW) (1 µ g/mL) e capsula mAb 18B7 (Vedi Tabella materiali) coniugato con AlexaFluor488 (AF488) (10 µ g/mL) per 30 min a 37 ° C.</li>
		<li>Centrifugare le cellule a 870 x g per 5 min a post-incubazione 21 ° C e aspirare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 10 µ l PBS con 1% albumina di siero bovino (BSA).</li>
		<li>Pipettare 8 µ l di sospensione cellulare su un vetrino per microscopio.</li>
		<li>Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colorazione con inchiostro di China e tinture fluorescenti
	<ol>
<li>Per confrontare più direttamente l'efficacia di inchiostro di India di colorazione a quella di coloranti fluorescenti, co-macchia stessa popolazione cellulare con entrambi i tipi di macchia. A tale scopo, prima di incubare le cellule con una capsula fluorescente e la macchia di parete cellulare, come da procedura 2.2.1 - 2.2.3.</li>
		<li>Successivamente, Pipettare volumi uguali (4 µ l) della sospensione cellulare fluorescente macchiato e inchiostro di China su una lastra di vetro. Mescolare delicatamente.</li>
		<li>Applicare un vetrino coprioggetti di vetro 13 mm (spessore #1.5) e sigillare i bordi con un sigillante atossico (smalto trasparente) per evitare il campione dall'asciugarsi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. immagine acquisizione/microscopia
<ol><li>
Cellule di imaging colorato con inchiostro.
	<ol>
<li>Acquisire immagini utilizzando un microscopio a luce standard (ingrandimento 100 X).</li>
		<li>Immagine un minimo di 50 cellule per condizione. Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo, come questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato). Per questi esperimenti, le immagini sono state acquisite a una profondità di 16 bit con tempi di esposizione ottimizzati per massimizzare il contrasto dell'immagine riducendo al minimo la sfocatura causata da piccoli movimenti delle cellule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellule di imaging tinto con coloranti fluorescenti
	<ol>
<li>Per realizzare l'immagine delle cellule mediante microscopia a fluorescenza, aprire il software di imaging di microscopio e selezionare l'appropriato eccitazione e emissione lunghezze d'onda per i fluorofori utilizzati (CFW e AF488 sono eccitati utilizzando il 405nm e 488 nm luci, rispettivamente). Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.</li>
		<li>Immagine un minimo di 50 cellule per condizione. Nota: Il numero di cellule per campo variano, e questo è accettabile. È importante, tuttavia, tale sovrapposizione cellule essere ridotto al minimo in quanto questi sono difficili da misurare (sia manualmente che con il software automatizzato).</li>
		<li>Acquisire una serie di immagini dello stack z delle cellule per garantire che si ottiene il massimo diametro capsula per ogni cella all'interno di un determinato campo.<ol>
<li>Del software di controllo del microscopio, fare clic sulla barra "z-stack" per aprire il pannello di controllo "z-stack", quindi selezionare l'opzione "Primo/ultimo" nell'angolo superiore sinistro del pannello.</li>
			<li>Utilizzare il controllo di fine-fuoco il microscopio per mettere a fuoco a un livello che è di sotto del punto più largo di una cellula di lievito singolo e le capsule per tutti entro il campo di vista corrente e fare clic su "Primo Set".</li>
			<li>Utilizzare il controllo di fine-fuoco per mettere a fuoco sopra il punto più largo del corpo cellulare della cellula stessa e della capsula per tutte le celle all'interno del campo di vista corrente e fare clic su "Imposta l'ultimo".</li>
			<li>Quindi, fai clic su "Avviare esperimento" nella scheda "Acquisizione" per acquisire lo z-stack per la posizione corrente. Ripetere il processo in più posizioni fino a quando sono state acquisite immagini dello stack z di un minimo di 50 cellule. Nota: Per questi esperimenti, il foro stenopeico confocale è stato impostato su 1.0 AU e una sovrapposizione z-serie di 10-20 fette che coprono 0,7 µM ogni sono stati acquisiti presso le posizioni selezionate. AU = unità arioso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Successivamente, è possibile convertire ogni serie z-stack in proiezioni di massima intensità (MIP) utilizzando software di analisi di immagine appropriata. Nota: La massima intensità a ogni piano dell' immagine impilata29del progetto MIPs. Creazione di MIPs permette di produrre una rappresentazione 2-D di immagini che corrispondono alla massima della cella e capsula diametro all'interno dello stack 3D acquisito.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cellule di imaging macchiato con l'inchiostro di India e tinture fluorescenti
	<ol>
<li>Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale o widefield (ingrandimento 40x) (63 X o 100 X ingrandimento). Per le cellule colorate con inchiostro di China e tinture fluorescenti, catturare immagini utilizzando un microscopio di widefield equipaggiato con un palco comandato da calcolatore e obiettivo a immersione in olio. Nota: Il microscopio in uso dovrebbe essere controllato utilizzando un software di imaging CFW. la fluorescenza che è eccitato attraverso un filtro di eccitazione di 340-380 nm e la luce emessa deve essere rilevata attraverso un filtro di barriera di 435-485 nm riflettuto da uno specchio dicroico 400 nm. AF488 fluorescenza possa essere eccitato attraverso un filtro di eccitazione 465-495 nm, e la luce emessa può essere rilevato attraverso un filtro di barriera 515-555 nm riflettuto da uno specchio dicroico 505 nm.</li>
		<li>Immagine un minimo di 50 cellule di ogni metodo di macchiatura per patologia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. misura manuale della capsula
<ol><li>Per le cellule colorate con inchiostro di China o macchie fluorescenti, utilizzare un software di misurazione di cella al diametro manualmente di capsula e cella di misura (Vedi Tabella materiali). Per fare questo, andare su "File" > "Apri immagine" > "Misura" e utilizzare il cursore per disegnare una linea retta attraverso il punto più largo della cella intera (diametro totale).</li>
	<li>Successivamente, fare nuovamente clic su "Misura" e disegnare una linea retta attraverso il corpo cellulare (diametro corpo cellulare). Nota: Le misure sono salvati automaticamente sulle celle.</li>
	<li>Ripetere questo processo per tutte le celle (minimo 50/gruppo).</li>
	<li>Per salvare le immagini una volta che sono misurati, fare clic su "File" > "Salva come" e il nome le immagini in modo appropriato.</li>
	<li>Selezionare i file appena misurati ed esportare dati in un software di foglio di calcolo.</li>
	<li>Calcolare il diametro medio capsula utilizzando l'equazione: ([diametro totale] - [Diametro corpo cellulare]).</li>
</ol>5. automatici di misurazione della capsula
Nota: Per il successo di misura automatici, utilizzare immagini a 16 bit con un elevato livello di contrasto e che sono correttamente a fuoco insieme a un software di analisi di immagine appropriata (Vedi Tabella materiali). Quando imaging c. neoformans per capsula misurazione, è importante concentrarsi sull'anello scuro al confine tra la parete delle cellule e la capsula. Questo permette al software di delineare correttamente la cella e la capsula.
<ol><li>Inverti e creare una copia di tutti i India inchiostro macchiato immagini cellulare utilizzando un appropriato software di fotoritocco (Vedi Tabella materiali). Per effettuare questa operazione, fare clic su "File" > "Apri" per aprire India inchiostro macchiato immagini e quindi su "controllo" + "I" per invertire l'immagine. Fare clic su "File" > "Salva con nome" per salvare l'immagine invertita.</li>
	<li>Per importare l'originale e invertito immagini nel software, fare clic su "File" > "Importa sequenza" > "Carica immagine" > "Definisci sequenza (manualmente)" > "Dimensioni (canale)" > "Importare" > "Applica". Nota: I corpi delle cellule di c. neoformans e capsule possono essere identificati e mascherato utilizzando algoritmi specifici - indicati come 'ricette' - inclusi nel software.</li>
	<li>Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' l'immagine invertita per rilevare e mascherare il corpo della cella, quindi fare clic su "applica". Nell'immagine invertita, l'anello scuro che definiscono i margini della cella c. neoformans diventa più luminoso della capsula circostante.</li>
	<li>Utilizzare la ricetta 'Colonia Analyzer (fluorescenza)' sull'immagine invertita per segmentare i corpi delle cellule di c. neoformans dalle loro capsule, quindi fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Corpo cellulare" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio". Nota: La ricetta è costituito da più passaggi di elaborazione: sfondo rimozione, rilevamento di oggetti, separazione di oggetto e il filtro di sottoinsieme.</li>
	<li>Successivamente, utilizzare la ricetta 'Proliferazione' sull'immagine originale per rilevare e mascherare la capsula e fare clic su "applica". Questo crea una maschera di conteggio. Rinominare questa maschera di conteggio "Capsula" cliccando col tasto destro la scheda denominata "maschera di conteggio".</li>
	<li>Utilizzando la ricetta, 'Capsula partizione', creare una nuova maschera sull'immagine originale per partizionare capsule adiacente uno da altro. Per effettuare questa operazione, fare clic su "Capsula partizione" dal menu a discesa di ricetta. Nella finestra di partizione capsula, scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Capsula" (5,5) per capsula regione. Scegliere la maschera di conteggio ora ribattezzato "Corpo cellulare" per le celle Crypto (5,4). Scegliete "Originale" per il canale di ingresso e "Crea maschera per capsula partizionate. Fare clic su "applica Nota: La ricetta crea delle cellule e diametro capsula, definita come la media degli assi più lungo e più breve attraversando il centro della cellula e capsula e misure di zona da maschere di rilevamento. Trovare l'uscita che si trova sotto la scheda di foglio di calcolo in questo software. Ripetere questo processo per tutte le immagini (minimo 50 cellule/gruppo). Parametri di ricetta potrebbero essere sintonizzati per ottimizzare la rilevazione di singole immagini o ottimizzati per il rilevamento di batch di immagini multiple. Ulteriori misurazioni è calcolabile con la ricetta per la completa caratterizzazione della cella e morfologia della capsula.</li>
	<li>Esportare dati in un software di foglio di calcolo di scelta per ulteriori analisi.</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

L'autore, Hoyin Lai, è il product manager di DRVision che pubblica il software di analisi di immagine automatizzato, Aivia.

Per decenni, la capsula è stata degli obiettivi principali della ricerca per micologi e clinici interessati a c. neoformans e dermatosi da criptococco dovuto il relativo ruolo come fattore di virulenza principali per l'agente patogeno. Usando la microscopia per misurare differenze di dimensioni capsula tra ceppi e in crescita differente condizioni possono fornire informazioni importanti per l'agente patogeno e le sue risposte ai vari stimoli (cioè, diverse condizioni ambientali, possibili trattamenti ...

Colpendo un quarto di milione di persone ogni anno e conseguente più di 180.000 morti ogni anno, Cryptococcus neoformans è un lievito patogeno, intracellulare e l'agente causativo di dermatosi da criptococco1,2, 3. più colpiti sono i pazienti HIV-positivi nei paesi poveri che non hanno accesso alla terapia antiretrovirale, che li rende acutamente suscettibili alla malattia4,5,6. I dati del CDC indicano che in Africa sub-sahariana, c. neoformans uccide più persone di tubercolosi ogni anno e più ogni mese rispetto a qualsiasi epidemia di Ebola su record1. La via più comune di esposizione si verifica da inalazione di spore essiccate che sono molto comuni in ambiente7. Entrando i polmoni, ci sono diversi fattori di virulenza che contribuiscono al successo di c. neoformans in individui infettati. Capsula del polisaccaride è considerata fattore di virulenza primaria di microbo, come acapsular ceppi non sono virulenti8.
Capsula da criptococco si compone di tre componenti principali: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM) e mannoproteine (MPs)9. Mentre i parlamentari sono una componente relativamente minore parete cellulare-collegata della capsula, sono immunogenici e può favorire una risposta pro-infiammatoria principalmente9,10. Al contrario, GXM e GalXM compongono la massa della capsula (> 90% in peso) e hanno effetti immunosopressivi11. Oltre ai suoi effetti immunomodulatori, l'ingrandimento veloce della capsula in vivo crea una barriera meccanica ad ingestione di host cellule fagocitiche (cioè, neutrofili e macrofagi)12. La capsula di c. neoformans e sua sintesi sono complessi, ma nel complesso, aumentato diametro capsula è correlato con una maggiore virulenza6,13,14. Detto questo, è importante per i ricercatori di c. neoformans essere in grado di quantificare rapidamente e con precisione misurazioni capsule.
Sia la cella di c. neoformans e sua capsula polisaccaridica sono strutture dinamiche e mostrano cambiamenti nel tempo di15. La capsula può cambiare in Assemblea in risposta ai cambiamenti nell'host ambiente16,17,18, dimensioni e densità. Basso contenuto di ferro o livelli di nutrienti, l'esposizione del siero, il pH fisiologico umano e aumentata di CO2 sono noti per avviare la crescita capsula16,18,19,20. Ulteriormente, i ricercatori hanno dimostrato cambiamenti strutturali con conseguente differenze significative in immunoreactivity durante un'infezione, un vantaggio di c. neoformans rispetto suo ospite di prestito21,22. Questo è noto perché l'architettura della capsula c. neoformans è stato analizzato in una varietà di modi. La microscopia elettronica, ad esempio, ha rivelato che la capsula ha una matrice eterogenea con uno strato interno di elettrone-densi sotto un strato esterno, più permeabile23. Dispersione della luce e l'uso di pinzette ottiche hanno permesso che i ricercatori più ulteriormente per delucidare sue strutture macromolecolari24. Analizzando i risultati da entrambe misure di dispersione della luce statica e dinamica, sappiamo che la capsula del polisaccaride ha una complessa struttura ramificazione23. Pinzette ottiche sono state utilizzate per testare la rigidità della struttura, nonché a valutare la reattività dell'anticorpo24. Tuttavia, di gran lunga il più delle volte autonomo analisi della capsula c. neoformans è la misurazione delle sue dimensioni.
Per quantificare la capsula dimensione, i ricercatori usano quello che dovrebbe essere una semplice misurazione: il diametro lineare della capsula. Microscopi digitali vengono utilizzati per catturare immagini di celle multiple di c. neoformans (generalmente centinaia) macchiati con l'inchiostro di India o tinture fluorescenti. La dimensione di ogni corpo cellulare e capsula circostante è misurata. I dati vengono compilati e il diametro medio della capsula è calcolato sottraendo il diametro del corpo cellulare dal diametro a cellula intera (corpo cellulare + capsule). Fino a questo punto, queste misurazioni sono state fatte manualmente. Mentre in genere preciso, questo metodo ha svantaggi per i ricercatori. Grandi insiemi di dati può richiedere giorni o anche settimane per analizzare a mano. E poiché queste misurazioni vengono effettuate manualmente, soggettività e l'errore umano può influenzare il risultato.
Analisi automatizzata delle immagini computazionale sono diventato uno strumento indispensabile per i ricercatori in molti settori della biologia cellulare molecolare, consentendo l'analisi più veloce e più affidabile del biologico immagini 25,26,27. Tecniche di analisi di immagine precisa sono necessari per estrarre informazioni quantitative dalle quali spesso sono insiemi di dati complessi e immensi. Tuttavia, alcune misure, soprattutto la misura della capsula di c. neoformans , sono stati difficili da automatizzare. Identificare con precisione l'interfaccia tra la parete delle cellule e la capsula, che generalmente appare come un anello scuro quando immaginata da microscopia di contrasto di fase, può essere fastidioso per risolvere utilizzando una semplice soglia. Ulteriormente, le cellule di c. neoformans nella cultura tendono ad ammassarsi e segmentazione accurata delle cellule è necessaria per misurazioni accurate.
Lo scopo di questo progetto era di (i) illustrare uno dei protocolli standard per induzione capsula in c. neoformans, (ii) confronto e contrasto dell'inchiostro di India e fluorescenza colorazione come si riferiscono a capsula misure di diametro, (iii) sviluppare semplice, metodi computazionali per misurare diametro capsula utilizzando immagini di inchiostro macchiato celle utilizzando un software di analisi di immagine e, (iv) valutano i vantaggi ei limiti di misurazione diametro capsula manualmente e utilizzando il software di automazione. Troviamo che i due metodi di colorazione fluorescenti etichettatura della parete cellulare e capsula, mentre richiede più tempo, fornito i risultati più coerenti tra esperimenti. Tuttavia, entrambi i metodi ci ha permesso di distinguere correttamente tra laboratorio e clinica c. neoformans ceppi che esibiscono diverse capsule dimensioni. Inoltre, siamo stati in grado di automatizzare la misura del diametro capsula da India inchiostro macchiato immagini e scoperto che questo era una valida alternativa alla misurazione manuale della capsula.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

Capsula del polisaccaride di Cryptococcus neoformans è il fattore di virulenza primario e uno dei più comunemente studiato gli aspetti di questo lievito patogeno. Capsula dimensione può variare ampiamente tra i ceppi, ha la capacità di crescere rapidamente quando presentare a condizioni stressanti o basse nutriente ed è stata correlata positivamente con virulenza del ceppo. Per questi motivi, la dimensione della capsula è di grande interesse per i ricercatori di c. neoformans . La crescita della capsula c. neoformans è indotta durante le prove fenotipiche per comprendere gli effetti dei diversi trattamenti sulle differenze tra ceppi di lievito o dimensione. Qui descriviamo uno dei metodi standard di capsula induzione e confrontare due metodi accettati di colorazione e diametro capsula di misura: (i) inchiostro di India, un mordente negativo, usato in congiunzione con microscopia chiara convenzionale e (ii) Co-colorazione con coloranti fluorescenti della parete cellulare e capsula seguita da microscopia confocal. Infine, vi mostriamo come misura di diametro capsula da campioni di inchiostro di India-macchiato può essere automatizzato utilizzando analisi computazionale delle immagini.

Per illustrare la capsula induzione, macchiatura delle cellule, imaging e tecniche di misurazione, abbiamo utilizzato tre ceppi di c. neoformans: ceppo il laboratorio comune, ben caratterizzato, H99S30e due ceppi clinicamente isolati di precedentemente diametro capsula sconosciuto, B18 e B5231.
Il flusso di lavoro di induzione capsula, colorazione e acquisizione di immagin...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K Views.  Middle Tennessee State University. Capsula del polisaccaride è il fattore di virulenza primaria in Cryptococcus neoformans, e sue dimensioni correla con virulenza del ceppo. Misure di diametro capsula vengono utilizzate in fase di test fenotipici e per valutare l'efficacia terapeutica. Qui è presentato un metodo standard di induzione capsula, e due metodi di colorazione e diametro di misurazione vengono confrontati.

Video: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Separando i batteri di capsula quantità utilizzando un gradiente di densità discontinua

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Ricerca

Genetica

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

L&#39;uso di Citometria immagine per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Immunologia e infezioni

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualizzazione non-litica Esocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Dai macrofagi utilizzando la luce Microscopia Digitale

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Macrofagi Colesterolo Depletion e il suo effetto sulla fagocitosi di<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Misurazione automatica delle criptococcica capsula polisaccaridica di specie e corpo cellulare

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automazione delle misurazioni del microscopio a forza bio-atomica su centinaia di cellule C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Bioingegneria

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Microdilution del brodo In Vitro Screening: un metodo facile e veloce per rilevare nuovi composti Antifungini

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biologia

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Analisi quantitativa del tasso di crescita di Aspergillus nidulans utilizzando la microscopia dal vivo e il software open source

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

Valutazione delle presunte proprietà anticriptococco degli estratti grezzi e chiarificati dai molluschi

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Size Matters: Misurare il diametro di capsula in Cryptococcus neoformans

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