Wir danken der molekularen Biowissenschaften (MOBI) Doktorat und die Biologie-Abteilung am Middle Tennessee State University (MTSU) für die Bereitstellung der Mittel für diese Studie. Das Projekt wurde auch teilweise durch eine spezielle Projekte Stipendium, D.E.N. die MTSU Foundation finanziert.

Hinweis: C. Neoformans ist ein Biosafety Level 2 (BSL-2) Erreger und Forscher arbeiten müssen angemessene Vorsichtsmaßnahmen ergreifen. Verfahren detailliert auf wie zu sicher Arbeit mit BSL-2 Krankheitserreger auf das Center for Disease Control (CDC) gefunden werden kann Website, aber es ist wichtig zu beachten, dass alle Personen, die Kontakt mit C. Neoformans im Umgang geschult werden sollte Krankheitserreger und sollte immer tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA), in der Regel Latex oder Nitril-Handschuhe. Darüber hinaus sollten Rotoren auf Zentrifugen versiegelt sein, um Aerosolization von Proben und Leckagen sofort mit einem 10 % Bleichmittel-Lösung-28aufgeräumt zu verhindern.
(1) Kapsel Induktion
Hinweis: Alle Schritte sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben.
<ol><li>C. Neoformans in Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Brühe (pH 6,5 +/-0,2) Kultur und Inkubation bei 37 ° C mit schütteln, bis sie im Log-Phase (ca. 18-36 h) sind.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C und waschen Sie dreimal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Verwenden Sie ein Hemocytometer (oder eine automatisierte Zelle-Zähler), um die Zellen zu zählen und bei 2 x 105 Zellen/2 mL in Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) Aufschwemmen.</li>
	<li>Um die Kapsel zu induzieren, Inkubation bei 37 ° C und 5 % CO2 für 18 h. Hinweis: Die Kombination aus fehlender Nährstoffe in den Medien und die Anwesenheit von CO2 stimuliert C. Neoformans Kapsel Wachstum.</li>
	<li>Nach Inkubation der Zellen durch Zentrifugieren (wie oben) und entfernen alle, aber 5-10 µL überstand zu ernten. Zum gleichen Zeitpunkt ernten Sie einen entsprechenden UN-induzierte Zellprobe für jede Belastung gemessen werden. Verwenden Sie diese als Negativkontrollen. Hinweis: Die Zelle-Pellets werden sehr klein sein und möglicherweise schwer zu erkennen. Seien Sie vorsichtig beim Absaugen von überstand.</li>
	<li>Färben Sie mit Tusche (Abschnitt 2.1) oder fluoreszierende Farbstoffe (Abschnitt 2.2).</li>
</ol>2. Färbung
<ol><li>
Färbung mit nur Tusche
	<ol>
<li>Um die Hefe mit Tusche Flecken, Aufschwemmen der Pellets im restlichen überstand und fügen 4μL (etwa die Hälfte) der Zellsuspension und 4μL der Tusche auf einen Glas-Objektträger. Vorsichtig mischen und Schaumbildung zu vermeiden.</li>
		<li>Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung mit Fluoreszenz-Farbstoffen
	<ol>
<li>Um die Hefe mit einem fluoreszierenden Farbstoff Fleck, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 50 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).</li>
		<li>Die Kultur mit ein gleiches Volumen von Calcofluor White (CFW) inkubieren (1 µg/mL) und Kapsel mAb 18B7 (siehe Tabelle der Materialien) konjugiert, AlexaFluor488 (AF488) (10 µg/mL) für 30 min bei 37 ° C.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie Zellen bei 870 X g für 5 min bei 21 ° C nach Inkubation und aspirieren Sie überstand.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie Zelle Pellet in 10 µL PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA).</li>
		<li>Pipette 8 µL Zellsuspension auf einen Glas-Objektträger.</li>
		<li>Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und versiegeln Sie der Kanten mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Färbung mit Tusche und fluoreszierende Farbstoffe
	<ol>
<li>Um die Wirksamkeit der Tusche Färbung mit der Fluoreszenz-Farbstoffen mehr direkt zu vergleichen, Co Flecken der gleichen Zellpopulation mit beiden Arten von Flecken. Dazu zuerst inkubieren Sie Zellen mit einem fluoreszierenden Kapsel und die Zellwand Fleck nach Schritte 2.2.1 - 2.2.3.</li>
		<li>Als nächstes pipette gleiche Volumina (4 µL) der Fluoreszent gefärbt Zellsuspension und Tusche auf einen Objektträger. Mischen Sie vorsichtig.</li>
		<li>Wenden Sie ein 13-mm-Glas-Deckglas (#1.5 Dicke) und seal die Ränder mit einem ungiftigen Dichtstoff (klarer Nagellack) die Probe vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Image Acquisition/Mikroskopie
<ol><li>
Imaging-Zellen befleckt mit Tusche.
	<ol>
<li>Bilder mit einem standard Lichtmikroskop (100 X Vergrößerung) zu erwerben.</li>
		<li>Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand. Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf ein Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind. Für diese Experimente wurden Bilder in einer Tiefe von 16 Bits mit Belichtungszeiten um Bildkontrast zu maximieren bei gleichzeitiger Minimierung der Bewegungsunschärfe durch kleine Bewegungen der Zellen optimiert erworben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging-Zellen mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
	<ol>
<li>Um die Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie Bild, öffnen Sie das Mikroskop imaging-Software und wählen Sie die entsprechende Anregung und Emission Wellenlängen für die Fluorophore verwendet (CFW und AF488 sind begeistert mit dem 405nm und 488 nm Lichter bzw.). Abrufen von Bildern mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
		<li>Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Zustand. Hinweis: Die Anzahl der Zellen pro Feld variiert, und dies ist akzeptabel. Wichtig ist jedoch, dass überlappende Zellen auf einem Minimum gehalten werden, da diese schwer zu messen (sowohl manuell als auch mit automatisierten Software) sind.</li>
		<li>Erwerben Sie ein Z-Stapel-Bildserien der Zellen, um sicherzustellen, dass die maximale Kapseldurchmesser für jede Zelle in einem bestimmten Bereich erreicht wird.<ol>
<li>Klicken Sie in der Mikroskop-Steuerungssoftware auf die "Z-Stack", öffnen Sie das Bedienfeld "Z-Stack", dann wählen die Option "Erste/letzte" in der oberen linken Ecke des Fensters.</li>
			<li>Verwenden Sie die Geldbuße Fokuskontrolle am Mikroskop zu konzentrieren, auf einem Niveau, das unter dem breitesten Punkt einer einzigen Hefezelle und die Kapseln für alle in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "First Set".</li>
			<li>Die Geldbuße Fokuskontrolle sich oberhalb der breitesten Stelle der Zellkörper der gleichen Zelle und der Kapsel für alle Zellen in der aktuellen Blickfeld und klicken Sie auf "Letzte gesetzt".</li>
			<li>Klicken Sie "Start-Experiment" im Register "Übernahme" den Z-Stack für die aktuelle Position zu erwerben. Wiederholen Sie den Vorgang an mehreren Positionen bis Z-Stapel Bilder von mindestens 50 Zellen erworben wurden. Hinweis: Für diese Experimente die konfokale Lochblende wurde gegründet um 1.0 AU und eine überlappende Z-Serie von 10-20 Scheiben für 0,7 µM wurden an ausgewählten Positionen übernommen. AU = luftig-Einheit.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Als nächstes wandeln Sie jede Z-Stapel-Serie in höchster Intensität Projektionen (MIP) mit entsprechenden Bildanalyse-Software. Hinweis: MIPs Projekt die größte Intensität auf jeder Ebene der gestapelten Bild29. Erstellen von MIPs ermöglicht eine 2-D-Darstellung der Bilder zu produzieren, die die maximale Zell- und Kapseldurchmesser innerhalb des aufgenommene 3-d-Stapels entsprechen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imaging-Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt
	<ol>
<li>Abrufen von Bildern mit einer Weitfeld (40 X Vergrößerung) oder confocal Mikroskop (63 X oder 100 X Vergrößerung). Für Zellen mit Tusche und Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt die Aufnahmen Sie mit einem Weitfeld-Mikroskop mit computergesteuerten Bühne und Öl eintauchen Ziel ausgestattet. Hinweis: Das Mikroskop im Einsatz sollte über eine imaging-Software CFW gesteuert werden. Fluoreszenz, die freut sich über einen 340-380 nm Anregung Filter und emittiert Licht sollten durch einen 435 485 nm Barriere Filter von 400 nm dichroitischen Spiegel reflektiert erkannt werden. AF488 Fluoreszenz kann durch einen 465-495 nm Anregung Filter begeistert sein, und durch einen 515-555 nm Barriere Filter von 505 nm dichroitischen Spiegel reflektiert abgestrahlten Lichts detektiert werden.</li>
		<li>Bild ein Minimum von 50 Zellen pro Bedingung für jede Färbung Methode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. manuelle Messung der Kapsel
<ol><li>Für Zellen befleckt mit Tusche oder fluoreszierende Flecken, verwenden Sie eine Zelle Messsoftware, manuell Kapsel und Zelle Durchmesser messen (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, gehen Sie auf "Datei" > "Bild öffnen" > "Messen" und Verwendung der Cursor zum Zeichnen einer geraden Linie durch den breitesten Punkt der ganzen Zelle (Durchmesser).</li>
	<li>Als nächstes klicken Sie erneut auf "Messen" und zeichnen Sie eine gerade Linie durch die Zellkörper (Zellkörper Durchmesser). Hinweis: Messungen sind auf die Zellen automatisch gespeichert.</li>
	<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Zellen (mindestens 50/Gruppe).</li>
	<li>Um Bilder zu speichern wenn sie gemessen werden, klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" und benennen Sie die Bilder entsprechend.</li>
	<li>Wählen Sie die neu gemessenen Dateien und exportieren Sie Daten in eine Tabellenkalkulation.</li>
	<li>Die durchschnittliche Kapseldurchmesser mithilfe der Gleichung zu berechnen: ([Durchmesser] - [Zellkörper Durchmesser]).</li>
</ol>5. automatische Messung der Kapsel
Hinweis: Verwenden Sie für erfolgreiche automatisierte Messung, 16-Bit-Bilder mit hohem Kontrast und die sind richtig scharf zusammen mit einer entsprechenden Bildanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien). Beim C. Neoformans für Kapsel Messung abbilden, ist es wichtig, im Mittelpunkt der dunkle Ring an der Grenze zwischen der Zellwand und der Kapsel. Dies ermöglicht die Software, die Zelle und die Kapsel richtig abzugrenzen.
<ol><li>Umkehren und erstellen Sie eine Kopie aller Tusche gefärbten Zelle Bilder mit einem geeigneten Bildbearbeitungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Um dies zu tun, klicken Sie auf "Datei" > "Öffnen" Tusche gefärbten Bilder öffnen und dann "Control" + "I", um das Bild invertieren. Klicken Sie auf "Datei" > "Speichern unter" um das umgekehrte Bild zu speichern.</li>
	<li>Importieren Sie die ursprüngliche und invertierte Bilder in die Software klicken Sie auf "Datei" > "Sequenz importieren" > "Load Image" > "Definieren Sequence (manuell)" > "Dimensionen (Kanal)" > "Importieren" > "Übernehmen". Hinweis: Die C. Neoformans Zellkörpern und Kapseln identifiziert werden können und maskiert, mit speziellen Algorithmen - bezeichnet als "Rezepte" - in der Software enthalten.</li>
	<li>Verwenden Sie das Rezept "Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)" auf das umgekehrte Bild zu erkennen und zu maskieren Zellkörper, dann klicken Sie auf "anwenden". Der dunkle Ring definieren die Grenze der C. Neoformans Zelle wird in das umgekehrte Bild heller als die umgebende Kapsel.</li>
	<li>Verwenden Sie das 'Kolonie Analyzer (Fluoreszenz)' Rezept auf das umgekehrte Bild segmentieren die C. Neoformans Zellkörpern aus ihren Kapseln, dann klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Zellkörper" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske". Hinweis: Das Rezept besteht aus mehreren Verarbeitungsschritten Bild: Hintergrund entfernen, Objekterkennung, Objekt-Trennung und Teilmenge zu filtern.</li>
	<li>Als Nächstes verwenden Sie das Rezept "Zellproliferation" auf das ursprüngliche Bild zu erkennen und die Kapsel zu maskieren, und klicken Sie auf "anwenden". Dadurch entsteht eine Graf-Maske. Benennen Sie diese Anzahl Maske "Kapsel" durch Rechtsklick auf die Karteikarte "Graf Maske".</li>
	<li>Mit dem Rezept "Kapsel Partition", erstellen Sie eine neue Maske auf das Originalbild, angrenzende Kapseln voneinander zu partitionieren. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Kapsel Partition" aus dem Dropdown-Menü Rezept. Wählen Sie im Feld Kapsel Partition die nun umbenannte Graf Maske "Kapsel" (5,5) für Kapsel Region. Wählen Sie die nun umbenannte Graf Maske "Zellkörper" Crypto-Zellen (5.4). Wählen Sie "Original" für den Eingangskanal und "Create Mask für Partitioned Kapsel. Klicken Sie auf "anwenden Hinweis: Das Rezept erzeugt Zelle und Kapseldurchmesser, definiert als der Mittelwert über die längste und kürzesten Achsen über der Mitte der Zelle und Kapsel und Flächenmaße vom Erkennung Masken. Finden Sie die Ausgabe, die unter der Registerkarte "Tabelle" in dieser Software befindet. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Bilder (mindestens 50 Zellen/Gruppe). Das Rezept Parameter konnte optimiert, um die Erkennung einzelner Bilder zu optimieren oder für Batch-Erkennung von mehreren Bildern optimiert. Weitere Messungen können durch das Rezept für umfassende Charakterisierung der Zelle und die Kapsel Morphologie berechnet werden.</li>
	<li>Exportieren Sie Daten in einem Tabellenkalkulations-Software der Wahl für die weitere Analyse.</li>
</ol>

<ol>
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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

Der Autor, Hoyin Lai, ist der Produktmanager bei DRVision, die die automatisierte Bildanalyse-Software Aivia veröffentlicht.

Die Kapsel ist seit Jahrzehnten ein wichtiger Schwerpunkt der Forschung für Mykologen und Kliniker C. Neoformans und Kryptokokkose wegen seiner Rolle als Virulenzfaktor der großen der Erreger interessiert. Mit Mikroskopie zu können messen Kapsel Größenunterschiede zwischen den Stämmen und unter verschiedenen Wachstum Bedingungen wichtigen Informationen über den Erreger und seine Reaktionen auf verschiedene Reize (z.B. unterschiedliche Umweltbedingungen mögliche medikamentöse Behandlungen, e...

Jedes Jahr eine Viertel Million Menschen betroffen, und was mehr als 180.000 Todesfälle jährlich, ist Cryptococcus Neoformans , Pathogene, intrazelluläre Hefe und dem Erreger der Kryptokokkose1,2, 3. am stärksten betroffen sind HIV-infizierte Patienten in armen Ländern, die nicht Zugang zu antiretroviralen Therapie, so dass sie sehr anfällig für die Krankheit4,5,6. Daten aus der CDC zeigen, dass in Subsahara-Afrika, C. Neoformans mehr Menschen als durch Tuberkulose jährlich und mehr pro Monat als jede Ebola-Ausbruch auf Rekord1tötet. Der häufigste Weg der Exposition erfolgt durch das Einatmen von ausgetrockneten Sporen, die in der Umwelt7Gang und gäbe sind. Beim Betreten der Lunge, gibt es mehrere Virulenzfaktoren, die zum Erfolg von C. Neoformans innerhalb von infizierten Personen beitragen. Die Polysaccharid-Kapsel ist die Mikrobe primäre Virulenzfaktor, als Acapsular Stämme nicht virulente8sind.
Die Cryptococcus Kapsel besteht der drei Hauptkomponenten: Glucuronoxylomannan (GXM), Galactoxylomannan (GalXM) und Mannoproteins (MPs)9. Während MPs eine relativ geringe Zellwand-assoziierte Komponente der Kapsel sind, sie sind immunogen und vor allem Pro-inflammatorische Reaktion9,10fördern können. Im Gegensatz dazu GXM und GalXM machen den größten Teil der Kapsel (> 90 % nach Gewicht) und immunsuppressive Effekte11haben. Neben seiner immunmodulatorische Effekte schafft die rasche Erweiterung der Kapsel in Vivo eine mechanische Barriere zur Einnahme von Host phagocytic Zellen (d.h., neutrophilen Granulozyten und Makrophagen)12. C. Neoformans Kapsel und seine Synthese sind komplex, aber insgesamt, erhöhte Kapseldurchmesser korreliert mit erhöhter Virulenz6,13,14. Angesichts dieser Tatsache ist es wichtig für C. Neoformans Forscher in der Lage sein, schnell und präzise Kapsel Messungen zu quantifizieren.
C. Neoformans Zelle und seine Polysaccharid-Kapsel sind dynamische Strukturen und Veränderungen über Zeit15zeigen. Die Kapsel kann in Dichte, Größe und Montage als Reaktion auf Änderungen in der Host-Umgebung16,17,18ändern. Eisenarme oder Nährstoffgehalt, Exposition gegenüber Serum, die menschlichen physiologischen pH-Wert und erhöhte CO2 sind bekannt, Kapsel Wachstum16,18,19,20zu initiieren. Darüber hinaus haben Forscher gezeigt, strukturelle Veränderungen zu erheblichen Unterschieden bei der Immunoreactivity während einer Infektion, Kreditvergabe einen Vorteil zu C. Neoformans gegenüber seinen Wirt21,22. Dies ist bekannt, weil die Architektur der C. Neoformans Kapsel in eine Vielzahl von Möglichkeiten analysiert wurde. Elektronenmikroskopie, hat beispielsweise ergeben, dass die Kapsel eine heterogene Matrix mit einer inneren Elektron-dichte Schicht unter einer äußeren, durchlässiger Schicht23 hat. Lichtstreuung und die Verwendung von optischen Pinzette konnten Forscher der makromolekularen Eigenschaften24weiter aufzuklären. Analyse der Ergebnisse aus beiden Messungen statische und dynamische Lichtstreuung, wissen wir, dass die Polysaccharid-Kapsel einen komplexen verzweigten Struktur23 hat. Optische Pinzette wurden zur Testen der Steifigkeit der Struktur sowie die Bewertung ihrer Antikörper Reaktivität24. Allerdings ist bei weitem die am häufigsten eingesetzten Analyse der C. Neoformans Kapsel die Messung seiner Größe.
Quantifizierung der Kapsel Größe Forscher nutzen, was eine einfache Messung sein sollte: die lineare Durchmesser der Kapsel. Digitale Mikroskope werden verwendet, um Bilder von mehreren Zellen in C. Neoformans (in der Regel Hunderte) mit Tusche oder Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt zu erfassen. Die Größe der einzelnen Zelle Körper und umgebenden Kapsel wird gemessen. Die Daten werden zusammengestellt, und der mittlere Durchmesser der Kapsel wird durch Subtrahieren des Zellkörper Durchmesser aus der ganzen Zelle Durchmesser (Zellkörper + Kapsel) berechnet. Bis zu diesem Zeitpunkt wurden diese Messungen manuell durchgeführt. Obwohl in der Regel genau, hat diese Methode Nachteile für Forscher. Großer Datenmengen können Tage oder sogar Wochen, von hand zu analysieren. Und da diese Messungen manuell erfolgen, Subjektivität und menschliches Versagen das Ergebnis beeinflussen können.
Automatisierte, computergestützte Bildanalyse ist ein unverzichtbares Werkzeug für Wissenschaftler in vielen Bereichen der molekularen Zellbiologie, ermöglicht schnellere und zuverlässigere Analyse von biologischen Bilder 25,26,27geworden. Genaues Bild-Analyse-Techniken sind notwendig, um quantitative Informationen aus was oft komplex und immense Datenmengen sind von mir. Allerdings wurden einige Messungen, insbesondere die Messung der C. Neoformans Kapsel, schwer zu automatisieren. Genaue Identifizierung der Schnittstelle zwischen der Zellwand und der Kapsel, die in der Regel als einen dunklen Ring, wenn Phasenkontrast-Mikroskopie abgebildet angezeigt wird, kann zur Lösung mit einem einfachen Schwellenwert lästig sein. Weitere, C. Neoformans Zellen in Kultur tendenziell verklumpen und genaue Segmentierung der Zellen ist notwendig für genaue Messungen.
Das Ziel dieses Projektes war es, (i) eines der Standardprotokolle für Kapsel Induktion in C. Neoformans (Ii) vergleichen und Tusche zu veranschaulichen und Fluoreszenz Färbung wie sie betreffen um Durchmesser Messungen, Kapsel (Iii) entwickeln einfache, Berechnungsmethoden Kapseldurchmesser mit Bildern von Tusche gefärbten Zellen mit einer Bildanalyse-Software und (iv) messen bewerten die vor- und Nachteile Kapseldurchmesser manuell messen und mithilfe der Automatisierung von Software. Wir finden, dass die beiden Färbung Methoden, fluoreszierende Kennzeichnung der Zellwand und Kapsel, während mehr Zeit in Anspruch, die konstantesten Ergebnisse zwischen Experimente. Aber beide Methoden konnten wir erfolgreich zu unterscheiden zwischen Labor und klinische C. Neoformans Kapsel Stämme mit verschiedenen Größen. Darüber hinaus konnten wir die Messung der Kapseldurchmesser von Tusche gefärbten Bilder zu automatisieren und fand, dass dies eine echte Alternative zur manuellen Messung der Kapsel.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

Die Polysaccharid-Kapsel von Cryptococcus Neoformans ist die primäre Virulenzfaktor und eines der wichtigsten Aspekte dieser Pathogene Hefe allgemein untersucht. Kapsel Größe kann sehr unterschiedlich zwischen den Stämmen, hat die Fähigkeit, schnell zu wachsen, wenn Stress oder niedrigen Nährstoffverhältnisse eingeführt und wurde positiv korreliert mit Stamm Virulenz. Aus diesen Gründen ist die Größe der Kapsel von großem Interesse für C. Neoformans Forscher. Das Wachstum der C. Neoformans Kapsel induziert wird während der phänotypischen Tests, um die Auswirkungen der verschiedenen Behandlungen auf der Hefe oder Größe Unterschiede zwischen Stämmen zu verstehen. Hier beschreiben wir eine der Standardmethoden der Kapsel Induktion und vergleichen zwei anerkannten Methoden der Färbung und Messung Kapseldurchmesser: (i) Tusche, einen negativen Fleck, verwendet in Verbindung mit konventionellen Lichtmikroskopie und Färbung (Ii) zusammen mit fluoreszierende Farbstoffe der Zellwand und Kapsel gefolgt von konfokalen Mikroskopie. Endlich, wir zeigen, wie Messung der Kapseldurchmesser aus Indien blau gefärbten Proben mittels computergestützten Bildanalyse automatisiert.

Zur Veranschaulichung der Kapsel Induktion, Zelle Färbung, Bildverarbeitung und Messtechnik verwendet wir drei Stämme von C. Neoformans: das gemeinsame, gut charakterisierte Labor Stamm, H99S30und zwei klinisch isolierten Stämme der zuvor unbekannte Kapseldurchmesser, B18 und B5231.
Abbildung 1Azeigt der Workflow der Kapsel Induktion, Färb...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.5K Aufrufe.  Middle Tennessee State University. Die Polysaccharid-Kapsel ist die primäre Virulenzfaktor in Cryptococcus Neoformans, und seine Größe korreliert mit Stamm Virulenz. Kapseldurchmesser Messungen dienen phänotypische Tests und therapeutische Wirksamkeit abzuschätzen. Hier ist eine Standardmethode zur Kapsel Induktion vorgestellt, und zwei Methoden der Färbung und Messung Durchmesser verglichen.

Serie: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Forschung

Genetik

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Immunologie und Infektion

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Biotechnik

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

Brühe Microdilution In Vitro Screening: eine einfache und schnelle Methode, um neue Antimykotika Verbindungen erkennen

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Biologie

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

Beurteilung der mutmaßlichen Antikryptokokken-Eigenschaften von rohen und geklärten Extrakten aus Mollusken

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Zusammenfassung

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