우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 항상 착용 해야 합니다. 또한, 샘플 및 어떤 유출2810% 표 백제 솔루션 사용 하 여 즉시 정리의 aerosolization를 방지 하기 위해 원심 분리기에로 터를 봉인 한다.
1. 캡슐 유도
참고: 모든 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>C. neoformans 효 모 펩 포도 당 (YPD) 국물 (pH 6.5 ± 0.2)에서 문화 그리고 로그 단계 (약 18-36 h) 때까지 떨고와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>870 x g 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 세 번 세척.</li>
	<li>사용 하 여 셀을 계산 하 여 Dulbecco의 최소한의 필수 미디어 (DMEM)에서 2 × 105 셀/2 mL에 resuspend는 hemocytometer (또는 자동화 된 셀 카운터).</li>
	<li>캡슐을 유도를 37 ° C, 5% CO2 18 h에서 품 어. 참고: 미디어에 영양소의 부재와 CO2 의 존재의 조합 C. neoformans 캡슐 성장을 자극.</li>
	<li>후 보육 (위에서) centrifuging 표면에 뜨는 모든 하지만 5-10 µ L을 제거 하 여 세포를 수확. 동시에 각 스트레인 측정에 대 한 해당 취소 유발된 셀 샘플을 수확. 이러한 부정적인 컨트롤을 사용 합니다. 참고: 셀 펠 릿 아주 작은 되며 볼 하기 어려울 수 있습니다. 상쾌한 발음 할 때 주의 해야 합니다.</li>
	<li>인도 잉크 (섹션 2.1) 또는 형광 염료 (섹션 2.2) 얼룩.</li>
</ol>2. 얼룩
<ol><li>
만 인도 잉크 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크와 누 룩 얼룩, 나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend와 4μL를 추가 (약 절반) 세포 현 탁 액 및 유리 현미경 슬라이드에 인도 잉크의 4μL의. 부드럽게 혼합 하 고 거품을 방지.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 염색
	<ol>
<li>형광 염료와 누 룩 얼룩, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 50 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>Calcofluor 화이트 (CFW)의 동등한 양으로 문화를 품 어 (1 µ g/mL) 및 캡슐 mAb 18B7 AlexaFluor488을 활용 ( 재료의 표참조) (AF488) (10 µ g/mL) 37 ° c.에 30 분</li>
		<li>870 x g 후 보육 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
		<li>1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 8 µ L 플라스틱</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크와 형광 페인트 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크 형광 페인트의 얼룩의 효능을 직접 비교를 공동 얼룩의 두 종류와 같은 세포 인구 얼룩. 이렇게 하려면 먼저 셀 형광 캡슐와 단계 2.2.1-2.2.3에 의하여 세포 벽 얼룩을 품 어.</li>
		<li>다음, 붙일 스테인드 세포 현 탁 액 및 인도 잉크를 유리 슬라이드에 동일 볼륨 (4 µ L) 플라스틱. 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 비-독성 실 란 (투명 매니큐어)와 가장자리를 밀봉.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미지 수집/현미경
<ol><li>
인도 잉크 얼룩이 세포 이미징.
	<ol>
<li>표준 가벼운 현미경 (100 X 배율)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼, 최소한 지켜질. 이 실험에 대 한 이미지는 노출 시간 셀의 작은 움직임으로 인 한 흐림 효과 최소화 하면서 이미지 대비를 극대화 하기 위해 최적화 된 16 비트 깊이에 인수 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>형광 현미경 검사 법에 의해 셀을 이미지를 현미경 이미징 소프트웨어 열고 fluorophores 사용에 대 한 적절 한 여기 및 방출 파장 선택 (CFW와 AF488는 흥분는 405nm 전등과 488 nm, 각각 사용 하 여). 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼 최소한 지켜질.</li>
		<li>특정된 필드 내에서 각 셀에 대 한 최대 캡슐 직경 얻을 수 있도록 셀의 z-스택 이미지 시리즈를 취득 합니다.<ol>
<li>현미경 제어 소프트웨어에서 "z-스택" 바 "z-스택" 컨트롤 패널을 열고 패널의 왼쪽된 위 모퉁이에서 "첫 번째/마지막" 옵션을 선택을 클릭 합니다.</li>
			<li>초점을 현미경에 정밀한 초점 제어를 사용 하 여 단일 효 모 세포와 모든 현재 시야 내에서 캡슐의 넓은 포인트 이며 클릭 "설정 첫 번째" 수준.</li>
			<li>현재 시야 내에서 셀의 모든 캡슐과 같은 셀의 셀 시체의 포인트로 위에 초점을 정밀한 초점 컨트롤을 사용 하 고 "마지막 설정"을 클릭 합니다.</li>
			<li>그런 다음 현재 위치에 대 한 z-스택 얻으려고 "수집" 탭에서 "실험 시작"을 클릭 합니다. 여러 위치에 프로세스를 반복 하 여 최소 50 셀의 z-스택 이미지 획득. 참고: 이러한 실험 confocal pinhole 설정 되었습니다 1.0 AU와 0.7 µ M를 커버 하는 10-20 조각의 겹치는 z 시리즈는 선택한 위치에 인수 했다. AU = 공기 단위.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음, 각 z 스택 시리즈 변환 최대 강도 예측 (MIP) 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 참고: MIPs 프로젝트 스택된 이미지29의 모든 면에서 가장 큰 강도. MIPs를 만드는 생산 최대 셀 및 스택 내에 캡처된 3 차원 캡슐 직경에 해당 하는 이미지의 2 차원 표현을 하나 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>Widefield (40 배 확대) 나 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 (63 X 또는 100 배 확대). 인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 셀에 대 한 컴퓨터 제어 단계와 기름 침수 목표 widefield 현미경을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 참고: 사용 중인 현미경 해야 제어할 수 CFW 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 340-380 nm 여기 필터를 통해 흥분 하 고 빛을 방출 하는 형광은 400 nm dichroic 거울에서 반영 435-485 nm 배리어 필터를 통해 감지 한다. AF488 형광 465-495 nm 여기 필터를 통해 흥분 수 그리고 방출된 빛 515-555 nm 배리어 필터 505 nm dichroic 거울에서 반사를 통해 검출 될 수 있다.</li>
		<li>각 착 방법에 대 한 조건 당 50 셀의 최소 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 수동 측정 캡슐의
<ol><li>인도 잉크 또는 형광 성 얼룩으로 얼룩이 셀, 수동으로 측정 캡슐 및 셀 직경 셀 측정 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면, "파일"로 이동 > "이미지 열기" > "측정"을 커서를 사용 하 여 전체 셀 (전체 직경)의 가장 넓은 지점을 통해 직선을 그립니다.</li>
	<li>다음, 다시 "측정"을 클릭 하 고 세포 체 (세포 체 직경)를 통해 직선을 그립니다. 참고: 측정 셀에 자동으로 저장 됩니다.</li>
	<li>모든 셀 (최소 50/그룹)에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>그들은 측정 됩니다 일단 이미지를 저장 하려면 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장" 하 고 이미지를 적절 하 게 이름을.</li>
	<li>새로 측정된 파일을 선택 하 고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어를 내보낼.</li>
	<li>방정식을 사용 하 여 캡슐 평균 직경을 계산: ([총 직경]-[셀 본체 지름]).</li>
</ol>5. 자동화 측정 캡슐의
참고: 성공적인 자동화 된 측정을 위해 16 비트 이미지를 사용 대비 높은 수준 하 고는 제대로 적절 한 이미지 분석 소프트웨어 함께 초점을 맞추고 있다 ( 재료의 표참조). C. neoformans 캡슐 측정에 대 한 이미지 때 그것은 세포 벽과 캡슐 사이 경계에 어두운 반지에 집중 하는 것이 중요. 소프트웨어를를 제대로 셀 및 캡슐을 나타내는 수 있습니다.
<ol><li>반전 및 모든 인도 잉크 묻은 적절 한 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 셀 이미지의 복사본을 만듭니다 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면 "파일" > "열기" 인도 잉크 얼룩이 이미지를 연 다음 "제어" + "나"는 이미지를 반전. 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장"을 거꾸로 이미지를 저장.</li>
	<li>원래와 거꾸로 가져올 소프트웨어에 이미지 클릭 "파일" > "가져오기 순서" > "로드 이미지" > "정의 시퀀스 (수동으로)" > "치수 (채널)" > "가져오기" > "적용". 참고: C. neoformans 세포 시체 및 캡슐 확인 될 수 있다 고 '조리법'-는 소프트웨어에 포함 된로-특정 알고리즘을 사용 하 여 마스크.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 검색 하 고 셀 바디 마스크 다음 "적용"을 클릭 합니다. 거꾸로 이미지에서 C. neoformans 세포의 경계를 정의 하는 어두운 반지 주변 캡슐 보다 밝게 된다.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 그들의 캡슐에서 C. neoformans 세포 시체를 세그먼트 다음 "적용" 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "셀 몸"를 이름을 바꿉니다. 참고: 여러 이미지 처리 단계 제조 법 구성: 배경 제거, 물체 감지, 개체 분리 및 하위 집합 필터링.</li>
	<li>다음, 원본 이미지에 ' 세포 증식 ' 제조 법을 사용 하 여 캡슐, 마스크를 감지 하 고 "적용"을 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "캡슐"을 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>서로 인접 한 캡슐을 분할 하는 원본 이미지에 새로운 마스크를 만들기 제조 법, ' 캡슐 파티션 '을 사용 하 여. 이렇게 하려면 제조 법 드롭 다운 메뉴에서 "파티션 캡슐"을 클릭 합니다. 캡슐 파티션 상자에서 캡슐 영역에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "캡슐" (5.5)을 선택 합니다. Crypto 셀 (5.4)에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "바디 셀"을 선택 합니다. 입력된 채널, 및 "분할 캡슐에 대 한 마스크 만들기"원본 "를 선택입니다. 클릭 "적용 참고: 제조 법 셀 및 캡슐 직경, 길고 짧은 축 검출 마스크에서 셀과 캡슐, 및 지역 측정의 센터를 교차의 평균으로 정의 생성 합니다. 이 소프트웨어의 스프레드시트 탭 아래에 있는 출력을 찾아. 모든 이미지 (최소 50 셀/그룹)에 대해이 프로세스를 반복 합니다. 제조 법의 매개 변수 개별 이미지의 최적화를 조정 하거나 여러 개의 이미지의 일괄 검색에 대 한 최적화 된 수 있습니다. 추가 측정 셀 및 캡슐의 형태학의 포괄적인 특성화에 대 한 제조 법으로 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 선택의 스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

<ol>
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H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. 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저자, Hoyin 라는 DRVision Aivia 자동된 이미지 분석 소프트웨어를 게시 하는 제품 관리자입니다.

수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (즉, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료, ...

매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 요인 있다. Acapsular 변종 악성8되지 않는 다 당 류 캡슐 미생물의 기본 독성 요인으로 간주 됩니다.
Cryptococcal 캡슐의 3 개의 원리 구성 요소를 만든: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), mannoproteins (MPs)9. MPs는 캡슐의 비교적 작은 세포 벽 관련 구성 요소, 면역성 이며 주로 프로 염증 반응을9,10를 홍보할 수 있습니다. GXM 및 GalXM 캡슐의 대부분을 확인 하는 반면, (> 90% 무게에 의해) 면역 효과11있다. 그것의 immunomodulatory 효과 이외에는 캡슐 vivo에서 의 급속 한 확대는 호스트 phagocytic 세포 (즉, 중 성구 및 대 식 세포)12섭취에 기계적인 장벽을 만듭니다. C. neoformans 캡슐과 그것의 종합은 복잡 하지만 전반적으로, 증가 캡슐 직경 증가 독성6,,1314와 상관 된다. 이 감안할 때, 신속 하 고 정확 하 게 계량 캡슐 측정 수 C. neoformans 연구에 대 한 중요 하다.
C. neoformans 세포와 그것의 다 당 류 캡슐 동적 구조 이며 시간15변화 표시. 캡슐은 밀도, 크기, 및 호스트 환경16,,1718의 변화에 대 한 응답에서 어셈블리에서 변경할 수 있습니다. 낮은 철 또는 영양 수준, 혈 청, 인간의 생리 적 pH를 증가 CO2 노출 캡슐 성장16,18,,1920를 시작으로 알려져 있습니다. 또한, 연구원은 보여주었다는 감염 시 immunoreactivity에 큰 차이가 발생 하는 구조적인 변화 대출 호스트 C. neoformans 를 이점을21,22. 이것은 C. neoformans 캡슐의 아키텍처는 다양 한 방법으로 분석 하기 때문에 알려져 있다. 전자 현미경 검사 법, 예를 들어 캡슐 외부, 더 투과 층23아래 내부 전자 밀도 레이어와 이기종 매트릭스는 계시 했다. 산란 및 광학 족집게를 사용 하 여 연구자의 고분자 속성24더 명료를 허용 했습니다. 둘 다 정적 및 동적 산란 측정에서 결과 분석, 우리는 알고 다 당 류 캡슐 복잡 한 분기 구조23있다. 광학 핀셋 구조 강성을 테스트 하 고 평가 하는 그것의 항 체 반응24사용 되었습니다. 그러나, 지금까지 가장 자주 고용된 분석 C. neoformans 캡슐의 그것의 크기의 측정 이다.
캡슐 크기 척도, 연구원은 간단한 측정 해야 사용: 캡슐의 선형 직경. 디지털 현미경 인도 잉크 또는 형광 염료와 스테인드 여러 C. neoformans 셀 (일반적으로 수백)의 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 각 셀 몸과 주변 캡슐의 크기 측정 됩니다. 데이터는 컴파일하고 캡슐의 평균 직경 (셀 바디 + 캡슐) 전체 셀 직경에서 세포 체 직경을 빼서 계산 됩니다. 이 시점까지이 측정 수행 되었습니다 수동으로. 그러나 일반적으로 정확 하 고, 연구자에 대 한이 메서드는 단점이 있습니다. 큰 데이터 집합 며칠이 걸릴 수 있습니다 또는 직접 분석 하는 주. 그리고 이러한 측정 수동으로 할 수 있습니다, 때문에 주관과 인간의 오류 영향을 미칠 수 결과.
자동화 된 컴퓨터 이미지 분석 생물 이미지 25,,2627의 더 빠르고 더 신뢰할 수 있는 분석을 사용 하는 분자 세포 생물학의 여러 분야에서 연구자 불가 결 한 도구가 되고있다. 정확한 이미지 분석 기법 무엇입니까 종종 복잡 하 고 거 대 한 데이터 집합에서 양적 정보 내 필요 하다. 그러나, 일부 측정, 특히 C. neoformans 캡슐의 측정을 자동화 하기 어려운 되었습니다. 정확 하 게 식별 하는 세포 벽과 캡슐, 일반적으로 어두운 링 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 군데 나타나는 간의 인터페이스 간단한 임계값을 사용 하 여 해결 성가신 될 수 있습니다. 또한, C. neoformans 세포 문화에 함께 덩어리 하는 경향이 셀의 정확한 세분화 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
이 프로젝트의 목표는 (i) C. neoformans, (ii) 비교 및 대비 인도 잉크 캡슐 유도 대 한 표준 프로토콜 중 하나를 설명 했다 고 형광 얼룩으로 직경 측정 캡슐 관련 된 (iii) 개발 간단 하 고, 계산 방법 인도 잉크 얼룩이 이미지 분석 소프트웨어, (iv)를 사용 하 여 셀의 이미지를 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 이점 및 제한 수동으로 캡슐 직경을 측정 하 고 소프트웨어 자동화를 사용 하 여의 평가 합니다. 우리 두 착 방법, 형광 세포 벽 및 캡슐의 라벨의 찾을, 더 시간이 걸리는 반면, 실험 사이 가장 일관 된 결과 제공. 그러나 두 방법 모두 성공적으로 구별을 사용 하는, 실험실 및 임상 C. neoformans 사이 긴장 다른 전시 캡슐 크기. 또한, 우리는 인도 잉크 얼룩이 이미지에서에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하 고 이것은 캡슐의 수동 측정에 대안을 발견 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Induction&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. neoformans cells&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&amp;nbsp; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td></tr><tr><td>DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Falcon</td><td>CL5335-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td>MaxQ6000</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend XTR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Legend Micro 21R</td></tr><tr><td>India ink</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-910-56</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td><td></td><td></td><td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td></td><td></td><td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips</td><td>Corning</td><td>2855-18</td><td>#1.5 thickness</td></tr><tr><td>Clear nail polish or other non-toxic sealant</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Image Acquisition&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td>Cargille&amp;nbsp;</td><td>16484</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope with immersion oil objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td></tr><tr><td>Light microscope camera</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td></tr><tr><td>Confocal microscope with oil immersion objective</td><td>Zeiss</td><td></td><td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Confocal microscope software</td><td>Zen 2009</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope camera</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Widefield imaging software</td><td>Nikon Elements (Nikon)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Capsule Measurement&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image editing software</td><td>Photoshop (Adobe)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope software for manual measurement</td><td>Axiovision (Carl Zeiss)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software for automated meesurement</td><td>Aivia (DRVision Technologies)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheet software</td><td>Excel (Microsoft)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.

캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231.
캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 ...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

size-matters-measurement-capsule-diameter-cryptococcus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K 조회수.  Middle Tennessee State University. 다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

비디오: Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

연구

유전학

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

면역학 및 감염병학

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

생체공학

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

심사에 생체 외에서 국물 Microdilution: 새로운 항진균 성 화합물을 감지 하는 쉽고 빠른 방법

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

생물학

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically estimated on solidified media by comparing colony size. However, to quantitatively measure the growth rate of genetically different fungal strains or strains under different environmental/growth conditions (pH, temperature, carbon and nitrogen sources, antibiotics, etc.) is challenging. Thus, the pursuit of complementary approaches to quantify growth kinetics becomes mandatory in order to better understand fungal cell growth. Furthermore, it is well-known that filamentous fungi, including Aspergillus spp., have distinct modes of growth and differentiation under sub-aerial conditions on solid media or submerged cultures. Here, we detail a quantitative microscopic method for analyzing growth kinetics of&#160;the model fungus Aspergillus nidulans, using live imaging in both submerged cultures and solid media. We capture images, analyze, and quantify growth rates of different fungal strains in a reproducible and reliable manner using an open source, free software for bio-images (e.g., Fiji), in a way that does not require any prior image analysis expertise from the user.

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

We present a label-free live imaging protocol using transmitted light microscopy techniques to capture images, analyze and quantify growth kinetics of the filamentous fungus A. nidulans in both submerged cultures and solid media. This protocol can be used in conjunction with fluorescence microscopy.

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Assessing the Putative Anticryptococcal Properties of Crude and Clarified Extracts from Mollusks

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The widespread use of antifungals in clinical settings, their use in agriculture, and strain hybridization have led to increased evolution of resistance. This rising rate of resistance against antifungals is a growing concern among clinicians and scientists worldwide, and there is heightened urgency to develop novel antifungal therapies. For instance, C. neoformans produces several virulence factors, including intra- and extra-cellular enzymes (e.g., peptidases) with roles in tissue degradation, cellular regulation, and nutrient acquisition. The disruption of such peptidase activity by inhibitors perturbs fungal growth and proliferation, suggesting this may be an important strategy for combating the pathogen. Importantly, invertebrates such as mollusks produce peptidase inhibitors with biomedical applications and anti-microbial activity, but they are underexplored in terms of their usage against fungal pathogens. In this protocol, a global extraction from mollusks was performed to isolate potential peptidase inhibitors in crude and clarified extracts, and their effects against classical cryptococcal virulence factors were assessed. This method supports the prioritization of mollusks with antifungal properties and provides opportunities for the discovery of anti-virulence agents by harnessing the natural inhibitors found in mollusks.

The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans produces a variety of virulence factors (e.g., peptidases) to promote its survival within the host. Environmental niches represent a promising source of novel natural peptidase inhibitors. This protocol outlines the preparation of extracts from mollusks and the assessment of their effect on fungal virulence factor production.

연체 동물의 원유 및 정제 추출물의 추정 항 크립토 코커스 특성 평가

Cryptococcus neoformans is an encapsulated human fungal pathogen with a global distribution that primarily infects immunocompromised individuals. The ...

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

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