Name: stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains
Uploaded: 2018-07-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie gewährt MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, den National Health Research Institutes gewähren NMRI-EX106-10429NI und die vorgestellten Bereiche Research Center Program Stipendium Das Bildungsministerium durch Brain Research Center, National Yang-Ming University in Taiwan, und MOST106-2811-B-010-031 (S.-Y.C), MOST105-2811-B-010-036 und MOST106-2811-B-010-030 (H.-Y.K) Postdoctoral Fellowship-Stipendien.

Die tierischen Protokolle, die hier beschrieben wurden von Animal Care und Nutzung Ausschüsse der National Yang-Ming University genehmigt.
1. Vorbereitung des Inhabers für die Neugeborenen Welpen in der stereotaktischen Vorrichtung
<ol><li>Der Kopf Fach zu machen: Schneiden Sie unten eine 1,5 mL Zentrifugenröhrchen (15 mm lang) in die Form, die den Kopf des Neugeborenen Welpen passt durch Entfernen von 1/5 der Wand des Rohres.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Pipette Tip Box mit der richtigen Größe, die mit dem Sockel des stereotaktischen Apparats passt, und entfernen Sie die obere Abdeckung. Befestigen Sie das Kopf Tablett in Schritt 1.1 und eine Gewebe Einbetten von Kassette auf der Basis des Tipp-Tablett mit heiß-schmelzen Kleber vorbereitet. Die Höhe der Gewebe einbetten Kassette beträgt 7 mm, die verwendet wird, um Hals und Körper der Welpe in der Kopf-feste Position zu unterstützen.</li>
	<li>Legen Sie das ganze Setup in einem standard stereotaktischen Apparat.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Injektionsnadeln Edelstahl 30G
<ol><li>Pre-clean 30 G Spritze Nadeln durch Einweichen in Chloroform für 3 Tage.</li>
	<li>Verwenden Sie Zange vorsichtig und langsam die Nadel Herausziehen aus Polypropylen Drehkreuz in einer chemischen Kapuze.</li>
	<li>Waschen Sie die Nadeln mit absoluten Ethanol für 20 min, gefolgt von 70 % Ethanol Spülungen für 3 × 10 min auf einen Shaker bei 50 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Nadeln Luft trocknen, und speichern Sie die gereinigten Nadeln in einer sauberen Box bei Raumtemperatur (RT) bis zur Verwendung.</li>
</ol>3. bereiten Sie einen Adapter für die Mikroinjektion Schläuche
<ol><li>Verbinden Sie Mikroliter Spritze mit einer 30G Injektionsnadel mit einer PE10 Polyethylenschlauch (PE10 Rohr). Bereiten Sie einen PE20 Polyethylen Schläuche (PE20 Röhre) Adapter zur Überbrückung der Injektionsnadel und Mikroliter-Spritze. Die Verwendung des Adapters ist notwendig, da der Durchmesser der PE10 Rohr viel kleiner als die Nadel der Spritze 26 G Mikroliter ist.</li>
	<li>Bereiten Sie den Schlauch für die Mikroliter-Spritze: die vorgereinigten 30 G Injektionsnadel mit 5 cm PE20 Röhre zu verbinden, und die Kreuzung mit Sekundenkleber versiegeln. Dieser Schlauch-Adapter ist wiederverwendbar. Hinweis: Wenn die Nadel der Spritze Mikroinjektion 30 G, die Vorbereitung (Schritt 3.1) und Nutzung (Schritt 3.3) dieser Adapter ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Verbinden Sie den Schlauch-Adapter (vorbereitet in Schritt 3.1) mit einer Spritze Mikroliter (10 µL).</li>
	<li>Schließen Sie ein Ende der PE10 Rohr (nicht länger als 60 cm) auf die 30G Nadel PE20 Schlauch Adapter. Montieren Sie einen neuen 30G Injektionsnadel auf das andere Ende des Schlauches PE10.</li>
</ol>4. Laden Sie die Mikroinjektion Tube mit autoklaviert destilliertes Wasser, Farbstoff und Viren
<ol><li>Entfernen Sie den Kolben der Spritze Mikroliter. Verwenden Sie eine 25G Spritze laden die Mikroliter-Spritze und seine angeschlossenen PE-Rohr mit autoklaviert destilliertes Wasser, Luft aus dem Schlauch entfernen.</li>
	<li>Legen Sie den Kolben zurück zu den Mikroliter-Spritze, und drücken Sie den Kolben bis 2 µL destilliertes Wasser bleibt im Fass. Lassen Sie sich nicht das Volumen des destillierten Wassers werden niedriger als 2 µL.</li>
	<li>Montieren Sie sorgfältig die Mikroliter-Spritze auf der Mikro-Rate Spritze Strömungspumpe.</li>
	<li>Kleine Mengen von 0,1 % schnell grüne Farbstoff (in 0,9 % Kochsalzlösung vorbereitet und mit 0,22 µm Filter gefiltert) und die Virus-Flüssigkeiten zu einem Stück Parafilm Pipette.</li>
	<li>Ziehen Sie eine kleine Menge an Luft, eine Luftblase an der Kreuzung zwischen 30 G Injektionsnadel und PE10 Schlauch gefolgt von 0,7 µL des gefilterten schnell grün in das Rohr laden testen Sie die Strömung von Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch sichtbar zu machen.</li>
	<li>Ziehen Sie eine weitere kleine Menge Luft, eine zweite Luftblase gefolgt von Virus-Flüssigkeiten in der Mikroinjektion Schlauch laden zu machen.</li>
	<li>Befestigen Sie und sichern Sie die 30G Mikroinjektion Nadel am Arm des stereotaktischen Apparats.</li>
</ol>(5) Anästhesie des Neugeborenen Mäusen durch Unterkühlung
<ol><li>Legen Sie der Welpe in einer Latex-Handschuh-Hülle und Tauchen Sie es in crushed-Ice bis zum Hals für 5 min.</li>
	<li>Kneifen Sie die Pup Füße mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass keine Rücknahme Antwort seiner Füße.</li>
	<li>Der Welpe mit Latex-Handschuh Ärmel im Kopf Tray legen Sie und einige zerstoßenem Eis um der Latex Hülle, um es für die Hypothermie Anästhesie kalt zu halten.</li>
	<li>Tragen Sie Tierarzt Salbe auf Pup es Augen, Trockenheit während der Narkose möglichst zu verhindern.</li>
</ol>6. die Mikroinjektion
<ol><li>Bereiten Sie sterile Chirurgie durch Abwischen der stereotaktischen Instruments gründlich mit 70 % Ethanol. Das chirurgische Instrument durch Eintauchen in 70 % igem Ethanol zu sterilisieren.</li>
	<li>Schrubben Sie das Pup Kopf mit 70 % Ethanol. Suchen Sie die Wahrzeichen Lambda auf dem Schädel und markieren Sie der Lambda-Ausdruck mit einem Filzstift. Ziel ist die Spitze der Nadel an der Lambda-Ausdruck, und der anterior-posterioren (AP) und Medial-laterale (ML) Koordinaten als NULL festgelegt.</li>
	<li>Bewegen Sie die Injektion-Arm an den Zielstandort nach X und Y-Koordinaten der Ziel-Site. Für das Striatum postnatale Tag (P) 2 Jungtiere, die Koordinaten sind: AP, +2,4 mm anterior des Lambda-Ausdrucks; ML, 1,0 mm seitlich von der Mittellinie; dorsal-Ventral (DV), −1.7 mm aus dem Schädel. Markieren Sie die Position der schnell grünen Farbstoff in PE10 Rohr mit einem Stift.</li>
	<li>Bringen Sie die 30G Spritze langsam durchdringen die Haut und Schädel, und heben Sie dann die Spitze der Nadel bis zum Anschlag an der Oberfläche des Schädels. Die DV-Koordinate als NULL festgelegt.</li>
	<li>Bringe die 30G Spritze langsam bis sie die DV-Koordinate der Ziel-Site erreicht. Warten Sie 1 Minute um das Parenchym wieder seine normale Form zu ermöglichen. Führen Sie die Mikroinjektion Programm (100 nL/min).</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die Marke schnell grün färben geht in das PE-Rohr um sicherzustellen, dass die Virus Flüssigkeit ins Gehirn injiziert wird.</li>
	<li>1 min nach der Beendigung der Mikroinjektion warten, und langsam und schrittweise heben Sie dann die Nadel bis zu 1/2 Höhe von DV Tiefe innerhalb von 30 s. Nach 30 s, ziehen Sie die Nadel langsam aus der Welpe Kopf.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 6.2 bis 6.7 bis die Mikroinjektionen aller gezielte Seiten abgeschlossen sind.</li>
</ol>7. postoperative Erholung des Welpen
<ol><li>Der Welpe für 20 min in einem Inkubator 33 ° C erwärmen. Überprüfen Sie die Erholung des Welpen von Hypothermie Anästhesie alle 5 min, bis der Welpe ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.</li>
	<li>Der Welpe zurück bis zum Staudamm zurück, nachdem der Welpe ist vollständig erholt.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Athos, J., Storm, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+stereotaxic+surgery+in+mice.">High precision stereotaxic surgery in mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).</li><li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain.">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li><li>Tye, K. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In der vorliegenden Studie zeigen wir Ihnen eine einfache und zuverlässige stereotaktischen Methode zum Einspritzen von AAV Viren in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Wir mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum Ai14 Reporter Mäuse bei P2 und dann analysiert die Reporter-gen-Expression bei P14. Wir fanden, dass AAV GFP-positiven Zellen in das Striatum auf Rostrocaudal Ebenen ausgestrahlt. Darüber hinaus Co ausgedrückt fast alle GFP-positiven Zellen TdTomato-Reporter-gen in Striatale Zellen, was auf eine erfolgreiche Cre-LoxP-DNA-Rekombination induziert durch AAV-vermittelten Expression von Kre Aktivität. Wir weiter bestätigt die Wirksamkeit dieses Ansatzes durch Mikroinjektionen von AAV-eGFP-Cre in das Striatum Foxp2fl/fl -Mäuse bei P2. Doppelte Kennzeichnung zeigte, dass viele Flugabwehrpanzer ausgestrahlt GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, schlägt eine erfolgreich bedingte Löschung des Foxp2 -Gens bei Neugeborenen Striatum fehlte. Die Bände der Flugabwehrpanzer mikroinjiziert werden mit der Größe der infizierten Hirnregionen korreliert. Mit 200 nL des injizierten Volumens, GFP-positiven Zellen wurden ausgiebig in der neonatalen Striatum gefunden, und einige verstreuten GFP-positiven Zellen waren auch in der Rinde angrenzend an das Striatum. Mit 50 nL des injizierten Volumens, GFP-positiven Zellen wurden lokal beschränkt sich auf die neonatale Striatum. Daher ist es wichtig für optimale Transduktion von neuronalen Populationen in bestimmten Gehirnregionen, die Volumen der injizierten Flugabwehrpanzer titrieren. Darüber hinaus richtet sich die Transduktion Rate auch nach der Titer von viralen Vorbereitung. Es ist denkbar, dass präzise gezielt bestimmte Zelltypen erreicht werden können, durch den Einsatz transgener Mäuse mit verschiedenen Promotoren.
Es gibt mehrere chirurgische Tipps für erfolgreiche Injektion Flugabwehrpanzer, den interessierten Gehirnregionen. Erstens ist es wegen der geringen Größe der Maus Welpen und die Schwierigkeiten bei der Sicherung der Position der Maus Kopf mit Händen während der Operation schwierig stereotaktischen Gehirnoperation bei Neugeborenen Mäusen10durchzuführen. Obwohl eine frühere Studie, neonatale stereotaktischen Operation gezeigt hat, aber es zwei Menschen erfordert, die Mikroinjektion während der Chirurgie11durchzuführen. Wir haben diese Probleme überwinden, indem man eine maßgeschneiderte Kopf fixiert-Gerät, das fest der Pup-Kopf während Gehirnchirurgie sichern kann. Die gesamte Verfahren können von einer einzigen Person durchgeführt werden. Die Gehirn-Größen von Neugeborenen Mäusen sind durch verschiedene genetische Hintergründe, mütterliche Fürsorge und das Alter der Welpen vielfältig. Ein Vorteil unserer hausgemachten Vorrichtung ist, dass es eine sanfte aber sichere Fixierung des Neugeborenen Maus Kopf, die für die Durchführung von hoher Präzision stereotaktischen Gehirnchirurgie notwendig ist. Zweitens ist durch die Elastizität der Haut und der dünnen Wand des Schädels, Hautschnitt, gefolgt von Schädel Bohren in den Kopf schwer in Neugeborenen Welpen durchzuführen. Um dieses Problem zu überwinden, ist es notwendig, eine Punktion der Haut und der Schädel mit einer Nadelspitze vor Senkung der Injektionsnadel, die gezielte Hirnregion zu machen. Drittens ist es wichtig, den Fluss der sichtbaren Farbstoff in das PE-Rohr um sicherzustellen, dass die Mikroinjektion in der Progression beim Einspritzen ist zu überprüfen. Bewegt sich der Farbstoff nicht in das PE-Rohr, Bemühungen getroffen werden, um Probleme beim Schießen der Probleme, einschließlich einem möglichen Austritt von Flüssigkeit in den Schlauch und verstopfte Nadeln. Beachten Sie, dass diese Methode für die Neugeborenen Welpen gilt, deren Lambda sind sichtbar durch die Haut vor P5. Für Welpen älter als P5 eventuell er einen Schnitt in der Haut, des Lambda-Ausdrucks verfügbar zu machen. Beachten Sie, dass die Beleuchtung auf P4 und P5 Maus Köpfe Wahrzeichen Lambda auffinden kann. Obwohl wir nicht diese Technik der stereotaktischen Chirurgie bei neugeborenen Ratten durchgeführt haben, gehen wir davon aus, dass die Technik für Ratte Welpen mit einigen Änderungen gilt.
Das auftreten und den maximalen Ausdruck von Viren tragen Genexpression dauern mehrere Tage oder Wochen nach Injektionen in die Gehirne14,15. In der vorliegenden Studie fanden wir, dass AAV-eGFP-Cre Viren-vermittelten Cre-LoxP DNA Rekombination in den Neugeborenen striatalen Neuronen bereits 8 Tage nach virale Transduktion stattgefunden. Die vorherige Studie berichtet, dass AAV-vermittelten Cre-abhängige Reporter Aktivität in den Riechkolben des Neugeborenen Maus Welpen so früh wie 3 Tage nach der Injektion der Masse der Flugabwehrpanzer15nachgewiesen werden kann. Es ist denkbar, dass der frühe Beginn der AAV-vermittelten Genaktivitäten ein Vorteil ist für das Studium Entwicklungsstörungen Ereignisse, die kontinuierlich in den postnatalen Gehirnen auftreten.
Zusammenfassend lässt sich sagen die neonatale stereotaktischen Technik, die wir entwickelt, ist nicht nur für bedingt löschen Gene in bestimmten Gehirnregionen, aber es ist auch offen für pharmakologische Reagenzien und neuronaler Tracer in bestimmten Gehirnregionen bei Neugeborenen Mäusen zu injizieren. Obwohl wir in der vorliegenden Studie, in der Regel nur Mikroinjektionen in die neonatale Striatum gemacht kann unsere stereotaktischen neonatale Gehirnchirurgie in bestimmten Gehirnregionen Ziel angewendet werden, wenn die Koordinaten der einzelnen Regionen im neonatalen Gehirn zur Verfügung stehen. Angesichts die Variabilität in der Größe des Neugeborenen mäusegehirnen mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen in verschiedenen Stadien, unbedingt die empirisch bestimmen die genauen Koordinaten des Ziel-Websites von den Ermittlern. Schließlich kann von stereotaktischen Mikroinjektionen der Flugabwehrpanzer gentechnisch veränderten optogenetische3 und Chemogenetic Proteine4 und neuronaler Aktivität Indikatoren5 in bestimmten Gehirnregionen auszudrücken, man die Rolle der neuronalen erkunden Aktivität auf die postnatale Entwicklung des Gehirns bei der Auflösung der Zelle typspezifischen und Schaltung Ebenen.

Moderne Studien der Struktur und Funktion des Gehirns erfordern in der Regel genetische Manipulation bestimmter Gene in neuronalen Zellen. Um die Funktionen der verschiedenen Gene, Transgene Mäuse tragen mutierten Allele, einschließlich Sonde wurden routinemäßig Knockout und Knock-in Allele generiert. Stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager ist eine Standardmethode zu liefern lokal Medikamente, Viren, Tracer und andere Reagenzien auf bestimmte Regionen von Nagetier Gehirne1,2. Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen erlaubt, die Genfunktion und neuronale Aktivität in bestimmten neuronalen Populationen des Mäusegehirns genetisch zu manipulieren. Die Zelle typspezifische Manipulation bietet einen leistungsfähigen Ansatz um neuronale Funktionen in komplexen neuronalen Schaltkreise des Gehirns3,4,5zu entschlüsseln.
Neurale Entwicklung des Nervensystems beginnt am frühen embryonalen Stadien und Entwicklungsprozesse weiter nach der Geburt bis zur juvenile Periode. Postnatale Reifung des Nervensystems beinhaltet die genaue synaptische Verdrahtung der neuronalen Schaltkreise, die für physiologische und kognitive Funktionen des Gehirns6erforderlich ist. Daher studieren Entwicklungsstörungen Ereignisse, die in Neugeborenen Zeitfenstern auftreten ist wichtig nicht nur für normale neurale Entwicklung zu verstehen, aber es kann auch Einblicke in die Pathogenese von Entwicklungsstörungen und neuropsychiatrische Störungen7 ,8. Obwohl die Methoden der stereotaktischen Gehirnchirurgie für Erwachsene Nager verfügbar2,9, sind einige Protokolle im Internet für stereotaktischen Gehirnoperation bei Neugeborenen Mäusen10,11. Stereotaktischen Mikroinjektionen von Reagenzien in die Gehirne von Neugeborenen Maus Welpen sind in der Tat schwierig, denn den Kopf des Neugeborenen Welpen zu empfindlich, um in den standard stereotaktischen Apparat fixiert werden. Dennoch ist die Anwendung der stereotaktischen Gehirnchirurgie mit transgenen Mäusen für Neugeborene Mäuse12machbar. Hier beschreiben wir eine einfache Methode mit einem hausgemachten Setup stereotaktischen Gehirnchirurgie in Neugeborenen Maus Welpen durchführen. Wir zeigen, dass diese Technik ermöglicht eine bedingt Floxed Gene microinjecting DNA AAV exprimierenden Cre-Rekombinase in das Striatum von Reporter-gen-Mäusen und bedingt Floxed Transgene Mäuse zu löschen. Dieses Verfahren gilt auch für Reagenzien in der neonatalen Striatum von Wildtyp Mäusen zu liefern.

<table><tbody><tr><td>30G PrecisionGlide Needle</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 305106</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>JT Baker</td><td>9180-03</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton MICROLITER Syringe</td><td>Hamilton&amp;nbsp;</td><td>80300</td><td>30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor</td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene tubing PE10</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Micro Flow Rate Syringe Pump</td><td>Longer Precision Pump Co.</td><td>TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit)</td><td></td></tr><tr><td>25G syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 302105</td><td></td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-7252</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Standard Stereotaxic Instruments</td><td>RWD Life Science</td><td>68037</td><td>Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor</td></tr><tr><td>Anti-FOXP2 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab16046</td><td>Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4,000</td></tr><tr><td>Anti-RFP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab65856</td><td>Mouse monoclonal to RFP, 1:1,000</td></tr><tr><td>BX63 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX63</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594</td><td>Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc.</td><td>111-585-003</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV1848</td><td>Lot # CS0987, 5.506x10&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt; (GC/mL)</td></tr><tr><td>AAV9.chicken actin-eGFP</td><td>AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan</td><td>N/A</td><td>1x10&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt; (GC/ml)</td></tr><tr><td>B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td><td>The Jackson Labtorary&amp;nbsp;</td><td>007914</td><td>Ai14</td></tr><tr><td>B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ</td><td>The Jackson Labtorary&amp;nbsp;</td><td>026259</td><td>Foxp2&lt;sup&gt;fl/fl&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline</td><td>Corning&amp;nbsp;cellgro</td><td>21-030-CVR</td><td></td></tr></tbody></table>

stereotaxic surgery for genetic manipulation in striatal cells of neonatal mouse brains

Viele Gene werden im embryonalen Gehirn exprimiert, und einige von ihnen werden kontinuierlich in das Gehirn nach der Geburt ausgedrückt. Für solche anhaltend exprimierten Gene können sie Funktion, um den Entwicklungsprozess und/oder physiologische Funktion im neonatalen Gehirn regulieren. Um neurobiologische Funktionen bestimmter Gene im Gehirn zu untersuchen, ist es unerlässlich, Gene im Gehirn zu inaktivieren. Hier beschreiben wir eine einfache stereotaktischen Methode um gen-Expression im Striatum von transgenen Mäusen bei Neugeborenen Zeitfenster zu inaktivieren. AAV-eGFP-Cre Viren wurden in das Striatum Ai14 Reporter-gen Mäuse an postnatalen Tag (P) 2 von stereotaktischen Gehirnchirurgie mikroinjiziert. Die TdTomato-Reporter-gen-Expression wurde im P14 Striatum, was darauf hindeutet, dass eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination in AAV ausgestrahlt Striatale Zellen erkannt. Wir weiter validiert diese Technik durch microinjecting Viren AAV-eGFP-Cre in P2Foxp2fl/fl -Mäuse. Doppelte Kennzeichnung der GFP und Foxp2 zeigte, dass die GFP-positiven Zellen Foxp2-Immunoreactivity in P9 Striatum, was den Verlust des Foxp2-Proteins in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Striatale Zellen fehlte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse eine wirksame genetische Löschung durch stereotaxically mikroinjiziert AAV-eGFP-Cre-Viren in bestimmten neuronalen Populationen im neonatalen Gehirn von transgenen Mäusen Floxed. Abschließend bietet unsere stereotaktischen Technik eine einfache Plattform für Genmanipulation in Neugeborenen mäusegehirnen. Die Technik kann nicht nur Gene in bestimmten Regionen des neonatalen Gehirn Löschen verwendet werden, aber es kann auch verwendet werden, um pharmakologische Medikamente, neuronaler Tracer, gentechnisch veränderten optogenetik und Chemogenetics Proteine, neuronaler Aktivität Indikatoren zu injizieren und anderen Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen.

Für den ersten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 200 nL AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 Viren (AAV-eGFP-Cre, 1/10-Verdünnung in Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung), die die DNA der Cre-Rekombinase Ausdrücken mit GFP in P2 Striatum von Ai14 Mäusen verschmolzen. Die Ai14 Mäuse express TdTomato-Reporter-gen bei Cre-vermittelten Löschung LoxP flankiert (Floxed) STOP-Kassette (Abbildung 2F). Die Köpfe wurden auf P14 für Immunostaining GFP und TdTomato geerntet. Viele AAV ausgestrahlt GFP-positiven Zellen wurden Gegenwart in das Striatum (Abbildung 2A, C), zeigt eine umfangreiche Infektion Striatale Zellen durch Viren AAV-eGFP-Cre. Ähnlich umfangreiche Ausdruck des TdTomato fand auch in das Striatum (Abb. 2 b, C). Bei der mikroskopischen Untersuchung bei hoher Vergrößerung, fanden wir, dass fast alle GFP-positiven Striatale Zellen der TdTomato Reporter-Gen Co ausgedrückt (Abbildung 2A'-C'). Darüber hinaus wurden TdTomato Signale in vermutlich Axon Terminals in den Globus Pallidus (Abb. 2D) und der Substantia Nigra Pars Reticulata (Abb. 2E), den Zielregionen von Striatonigral und Striatopallidal Projektion Neuronen erkannt. 13. diese Ergebnisse legen nahe, eine erfolgreiche Cre-LoxP vermittelte DNA Rekombination induziert durch AAV-vermittelten Expression von Kre-Aktivität in den Neugeborenen striatalen Neuronen.
Für den zweiten Satz des Experiments mikroinjiziert wir 50 nL AAV-eGFP-Cre Viren in das Striatum von Foxp2fl/fl -Mäuse tragen LoxP-flankiert von Foxp2 -Allele bei P2 (Abb. 3A- C, F), und das Gehirn auf P9 geerntet. Keine Foxp2+; GFP+ Doppel-markierten Zellen fanden sich im Striatum, dh., Foxp2-Protein fehlte in den GFP-positiven Zellen (Abbildung 3A'-C'). In Experimente, Foxp2+; GFP+ Doppel-markierten Zellen waren anwesend im Striatum von Foxp2fl/fl -Mäusen mit AAV-eGFP Kontrolle Viren (Abbildung 3D) und im Striatum von heterozygoten Foxp2fl / + Mäuse mit AAV-eGFP-Cre Viren (Abbildung 3E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Foxp2 -gen gezielt in AAV-eGFP-Cre ausgestrahlt Zellen des Neugeborenen Striatum gelöscht wird.
Die Ergebnisse der AAV-eGFP-Cre zusammengenommen; Ai14 und AAV-eGFP-Cre; Foxp2fl/fl Mäuse, die Technik der stereotaktischen neonatale Gehirnchirurgie, die wir entwickelt ist zugänglich für bedingt löschen Gene in bestimmten Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57270/57270fig1.jpg"> Abbildung 1: Stereotaktischen Apparat und hausgemachte Kopf fixiert Halter für Neugeborene Mäuse. (A) die stereotaktischen Einspritzanlage besteht aus den folgenden Geräten: i. Spritzenpumpe (Controller); II. Spritzenpumpe (Antriebseinheit); III. Mikroliter Spritze (10 µL); IV. PE20 Schlauch Adapter; v. PE10 Rohr; VI. 30G Injektionsnadel; VII. stereotaktischen Apparate; VIII. eine Pipette Tipps Box konvertiert Plattform für die Neugeborenen Welpen; XI: Eis. (B) die Höhe der Gewebe einbetten Kassette beträgt ca. 7 mm. Die Schaltfläche von 1,5 mL Zentrifugenröhrchen ist etwa 15 mm lang. (C) die Maus-Kopf ist in der hausgemachten Kopf fixiert Halterung gesichert. Der Pfeil zeigt die Wahrzeichen Lambda in den Kopf des Neugeborenen Mäusen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57270/57270fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57270/57270fig2.jpg"> Abbildung 2: Ausdruck des TdTomato im Striatum von P14 Ai14 Mäusen nach AAV-eGFP-Cre Cre-LoxP DNA Rekombination vermittelt. AAV-eGFP-Cre Viren wurden Sterotaxically in P2 Striatum von Ai14 Mäusen injiziert. Das Gehirn war auf P14 analysiert. (A) viele GFP-positiven Zellen in das Striatum (Str) vorhanden sind. (B) viele TdTomato-positiven Zellen sind auch im Striatum. (C) die zusammengeführten Bilder zeigen eine umfangreiche Co Lokalisierung der GFP und TdTomato im Striatum. Konfokale Bilder der Box Regionen A-C bei hoher Vergrößerung in A angezeigt werden "-C", beziehungsweise. Alle GFP-positiven Zellen (grün) Co express TdTomato (rot) im Striatum. (D, E) Die TdTomato Signale werden in den Zielregionen der striatalen Projektion Neuronen, einschließlich der Globus Pallidus (GP; entdeckt. (D) und der Substantia Nigra pars Reticulata (SNr; (E). (F) schematische Zeichnungen der AAV-eGFP-Cre und Ai14 transgene Konstrukte. CTX: Kortex; Sep: Septum; Hipp: Hippocampus; MB: Mittelhirn. Maßstabsleiste in A (für A-C), 200 µm; A "(für A'-C'), 10 µm; D (für D und E), 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57270/57270fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57270/57270fig3.jpg"> Abbildung 3. Bedingte Löschung des Foxp2 -Gens im Neugeborenen Striatum von Intrastriatal Injecions von Viren AAV-eGFP-Cre. Intrastriatal Injektionen von AAV-eGFP-Cre Viren wurden durchgeführt in P2 Foxp2fl/fl (A-C ") und Foxp2fl / +(E) Mäuse. Die Köpfe wurden in P9 analysiert. (A-C) GFP-positiven Zellen (A, C, grün) fehlen Foxp2-Immunoreactivity (B, C, rot) im Striatum von Foxp2fl/fl -Mäusen mit AAV-eGFP-Cre-Viren. Die geschachtelten Regionen in A-C sind bei hoher Vergrößerung in A gezeigt "-C", beziehungsweise. (D) Striatale Zellen Co Express GFP und Foxp2 befinden sich im Striatum, das mit AAV-eGFP Kontrolle Viren injiziert wurde. (E) GFP-positiven Zellen express Co Foxp2 (Pfeilspitzen) befinden sich im Striatum von Foxp2fl / + Mäuse mit AAV-eGFP-Cre-Viren. (F) schematische Zeichnungen der AAV-eGFP-Cre Virus und transgenen Mäusen Foxp2fl/fl . Maßstabsleiste in A (für A-C), 200 µm; A "(für A'-C', D und E), 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57270/57270fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Many genes are expressed in embryonic brains, and some of them are continuously expressed in the brain after birth. For such persistently expressed genes, ...

stereotaxic-surgery-for-genetic-manipulation-striatal-cells-neonatal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K Aufrufe.  National Yang-Ming University. Wir beschreiben ein Protokoll der stereotaktischen Operation mit einer hausgemachten Kopf fixiert Vorrichtung zur microinjecting Reagenzien in das Striatum von Neugeborenen mäusegehirnen. Diese Technik ermöglicht Genmanipulation in neuronalen Zellen bestimmter Regionen des Neugeborenen mäusegehirnen.

Serie: Stereotaxic Surgery for Genetic Manipulation in Striatal Cells of Neonatal Mouse Brains

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are restricted to two specific neurogenic niches: the subgranular zone of the dentate gyrus in the hippocampus and the ventricular-subventricular zone (V-SVZ; also called subependymal zone or SEZ) in the walls of the lateral ventricles. The development of in vivo gene transfer strategies for adult stem cell populations (i.e. those of the mammalian brain) resulting in long-term expression of desired transgenes in the stem cells and their derived progeny is a crucial tool in current biomedical and biotechnological research. Here, a direct in vivo method is presented for the stable genetic modification of adult mouse V-SVZ cells that takes advantage of the cell cycle-independent infection by LVs and the highly specialized cytoarchitecture of the V-SVZ niche. Specifically, the current protocol involves the injection of empty LVs (control) or LVs encoding specific transgene expression cassettes into either the V-SVZ itself, for the in vivo targeting of all types of cells in the niche, or into the lateral ventricle lumen, for the targeting of ependymal cells only. Expression cassettes are then integrated into the genome of the transduced cells and fluorescent proteins, also encoded by the LVs, allow the detection of the transduced cells for the analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects in the labeled cells and their progeny.

Here we describe a procedure based on the use of lentiviral particles for the long-term genetic modification of neural stem cells and/or their adjacent ependymal cells in the adult ventricular-subventricular neurogenic niche which allows the separate analysis of cell autonomous and non-autonomous, niche-dependent effects on neural stem cells.

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Neurowissenschaften

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation oder Viral stereotaktische Injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Adaptable Angled Stereotactic Approach for Versatile Neuroscience Techniques

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain regions still presents a challenge, particularly when targeting brain structures along the midline. These challenges include avoiding of the superior sagittal sinus and third ventricle and the ability to consistently target selective and discrete brain nuclei. In addition, more advanced neuroscience techniques (e.g., optogenetics, fiber photometry, and two-photon imaging) rely on targeted implantation of significant hardware to the brain, and spatial limitations are a common hindrance. Presented here is a modifiable protocol for stereotactic targeting of rodent brain structures using an angled coronal approach. It can be adapted to 1) mouse or rat models, 2) various neuroscience techniques, and 3) multiple brain regions. As a representative example, it includes the calculation of stereotactic coordinates for targeting of the mouse hypothalamic ventromedial nucleus (VMN) for an optogenetic inhibition experiment. This procedure begins with the bilateral microinjection of an adeno-associated virus (AAV) encoding a light-sensitive chloride channel (SwiChR++) to a Cre-dependent mouse model, followed by the angled bilateral implantation of fiberoptic cannulae. Using this approach, findings show that activation of a subset of VMN neurons is required for intact glucose counterregulatory responses to insulin-induced hypoglycemia.

Described here is a stereotactic procedure that can target challenging and difficult-to-reach brain regions (due to spatial limitations) using an angled coronal approach. This protocol is adaptable to both mouse and rat models and can be applied to diverse neuroscientific applications, including cannula implantation and microinjections of viral constructs.

Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Stereotactic surgery is an essential tool in the modern neuroscience lab. However, the ability to precisely and accurately target difficult-to-reach brain ...

Stereotaxic Intracranial Delivery of Chemicals, Proteins or Viral Vectors to Study Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra. Affected brain areas display intraneuronal fibrillar inclusions consisting mainly of alpha-synuclein (asyn) proteins. No animal model thus far has recapitulated all characteristics of this disease. Here, we describe the use of stereotaxic injection to deliver chemicals, proteins, or viral vectors intracranially in order to mimic various aspects of PD. These methods are well-established and widely used throughout the PD field. Stereotaxic injections are incredibly flexible; they can be adjusted in concentration, age of animal used for injection, brain area targeted and in animal species used. Combinations of substances allow for rapid variations to assess treatments or alter severity of the pathology or behavioral deficits. By injecting toxins into the brain, we can mimic inflammation and/or a severe loss of dopaminergic neurons resulting in substantial motor phenotypes. Viral vectors can be used to transduce cells to mimic genetic or mechanistic aspects. Preformed fibrillar asyn injections best recapitulate the progressive phenotype over an extended period of time. Once these methods are established, it can be economical to generate a new model compared to creating a new transgenic line. However, this method is labor intensive as it requires 30 minutes to four hours per animal depending on the model used. Each animal will have a slightly different targeting and therefore create a diverse cohort which on one hand can be challenging to interpret results from; on the other hand, help mimic a more realistic diversity found in patients. Mistargeted animals can be identified using behavioral or imaging readouts, or only after being sacrificed leading to smallercohort size after the study has already been concluded. Overall, this method is a rudimentary but effective way to assess a diverse set of PD aspects.

<meta charset="utf8"></head><body>Stereotaktische intrakranielle Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren zur Erforschung der Parkinson-Krankheit

We describe how to successfully inject solutions into specific brain areas of rodents using a stereotaxic frame. This survival surgery is a well-established method used to mimic various aspects of Parkinson's disease.

Stereotaktische intrakranielle Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren zur Erforschung der Parkinson-Krankheit

Parkinson's disease (PD) is a progressive disorder traditionally defined by resting tremor and akinesia, primarily due to loss of dopaminergic neurons in ...

Stereotaktischen Chirurgie für Genmanipulation in Striatale Zellen des Neugeborenen Mäusegehirnen

Zusammenfassung

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Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Stereotaktischen Chirurgie für Exzitotoxische Läsion Spezifische Hirnareale in der erwachsenen Ratte

Erweiterung der embryonalen und adulten neuralen Stammzellen

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch

Intracerebroventricular Viral Injektion der Neonatal Maus Gehirn für anhaltenden und verbreiteten Neuronale Transduction

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische

Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Stereotaktische intrakranielle Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren zur Erforschung der Parkinson-Krankheit

Stereotaktische intrakranielle Verabreichung von Chemikalien, Proteinen oder viralen Vektoren zur Erforschung der Parkinson-Krankheit