שיטה זו של ניתוח oenocyte וכתמים טיפת השומנים ניתן להשתמש כדי להבין את המראה של טיפת השומנים ב oenocyte זחלים drosophila בתנאים נורמליים ולחוצים. שיטה זו מספקת כלי שימושי לחקר חילוף החומרים של השומנים לא רק חרקים, אלא גם יונקים עם שינויים קלים מעטים בלבד. כדי לגרום להטלת ביצים, הניחו 150 זבובים נקביים בתוליים ו-75 זכרים של הגנוטיפים הרצויים בבקבוק מטיל ביצים והניחו את הבקבוק מתחת לקופסה חסינת אור באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס עם 60% לחות.
לאחר שעה, מעבירים את הזבובים לבקבוק חדש ומניחים לזבובים להטיל ביצים בבקבוק החדש במשך שעה לפני הוצאת המבוגרים. לאחר מכן, אפשרו לביצים להתפתח לזחלי instar השלישיים למשך 84 שעות ב-25 מעלות צלזיוס עם מחזור בהיר-כהה של 12 שעות. לפני תחילת הטיפול ברעב, מניחים פיסת נייר סינון בגודל הולם לתוך צלחת פטרי בגודל שישה סנטימטרים ומוסיפים מיליליטר אחד של PBS על הנייר כדי ליצור תא רעב.
כדי להפוך תא טיפול בקרה, למקם חמישה מיליליטר של מזון קמח תירס סטנדרטי בלומינגטון לתוך צלחת פטרי שישה סנטימטרים. כאשר התאים מוכנים, השתמש במברשת צבע קטנה כדי לאסוף זחלים instar באותו גודל משוער מבקבוק הטלת ביצה. ו-20 זחלים באופן אקראי לכל רעב ולתא הבקרה.
לאחר מכן מניחים את התאים באינקובטור במשך 12, 24 או 36 שעות של פיתוח ו / או רעב. בסוף תקופת הטיפול, השתמש במקלפים כדי להעביר בעדינות זחלים מכל תא לתוך צלחת ניתוח המכילה PBS קר כקרח ול מניחים את הצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו. לכוון את הצד הגחוני הראשון של הזחל למעלה ולהשתמש במקלות כדי להחזיק בעדינות את הזחל במקום.
מניחים סיכה אחת דרך הלוע וסיכה נוספת דרך הספירק כדי לאבטח את הזחל לצלחת. השתמש מספריים האביב Vannas לעשות חתך אורך דרך האפידרמיס מן anterior לקצה האחורי של החיה. השתמש מטחנים כדי להסיר את הרקמה הפנימית של האפידרמיס, דואג כדי למנוע נזק oenocytes על פני השטח הפנימיים של האפידרמיס.
לאחר מכן השתמש במדפים כדי לאחזר את סיכות הניתוח ולהעביר את האפידרמיס לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר של PBS על קרח. עבור כתמי טיפת שומנים, דגירה האפידרמיס נותחה במאגר קיבוע במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב, ואחריו הפוגה מהירה במיליליטר אחד של PBS. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם שלוש שטיפות חמש דקות במיליליטר אחד של PBS לכל לשטוף כדי להסיר כל שאריות תיקון.
לאחר הכביסה האחרונה, הדגירה דגימות האפידרמיס עם בדיקה ליפופילית מתאימה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על מסובב. במהלך הדגירה, לעטוף את צינורות מדגם בנייר כסף כדי להגן על הרקמות מפני אור ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים במיליליטר אחד של PBS במשך 10 דקות לכל לשטוף. כדי לדמיין את האונוציטים, העבר כל דגימת אפידרמיס לשישה מיקרוליטרים של מדיום הרכבה על מגלשת מיקרוסקופ נקייה, התאם את כיוון הרקמה, כך שהמשטח הפנימי המכיל את האונוציטים נוגע בתחתית השקופית.
מניחים בעדינות כיסוי על האפידרמיס ואוטמים את הקצוות עם לק ציפורניים ברור. כאשר הלק התייבש, תדמיין את הדגימות במיקרוסקופ קונפוקל, שים הגדלה של 63 X עם אורכי הגל המתאימים של העירור וההפלה. יש כמה טיפות שומנים לגילוי בתוך oenocytes של זחלי האכלה נורמליים בשלבים התפתחותיים שונים.
כפי שנצפה בתמונות מייצגות אלה עם זאת, טיפות השומנים להגדיל את מספר oenocytes בתגובה 12, 24, ו 36 שעות תקופות של רעב. שיטה זו מספקת פרוטוקול קל וישים לחוקרים בתחומי מחקר רלוונטיים כדי לחקור אם מניפולציות גנטיות או סביבתיות לגרום לשינויים טיפת השומנים בתאים.
