מחקר זה נתמך על ידי הולנד הארגון עבור מדעי למחקר (בתחרות) (VENI 016.146.079), LUMC מחקר לאגודה גם AMS, וגם Stichting Bontius LUMC (MJG).

כל ניסויים עם דגימות רקמה אנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, תואמת הצהרת הלסינקי. כל השלבים מתבצעות עם ציוד סטרילי בתוך זרם תרבות תא ארון.
1. תכשירים
<ol><li>הכן EPDC בינוני על ידי ערבוב של Dulbecco של הנשר ששונה בינונית (DMEM נמוך-גלוקוז), בינוני 199 (M199) על יחס 1:1. להוסיף 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FBS, החום לא פעיל במשך 25 דקות ב- 56 ° C) והשלמה עם פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. לחמם את המדיום EPDC באמבט מים 37 º C.</li>
	<li>לחמם טריפסין 0.25%/EDTA (1:1) בתוך אמבט מים 37 º C.</li>
	<li>המעיל וולס עם ג'לטין. להוסיף ג'לטין 0.1% / PBS מכל קידוח, דגירה הלוחות למשך לפחות 15 דקות ב 37 º C. הנחיות לצלחת תרבות תא נדרש מסוכמים בטבלה1. הסר בזהירות את כל הנוזלים לפני ציפוי תאים.</li>
	<li>להכין מלאי פתרון של 10 מ מ SB431542 (SB), מדולל דימתיל סולפוקסיד (זהירות). להפוך 50 µL aliquots צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה התחתון חרוט, כמו צינורות גלאים, ואחסן אותם ב-20 ° C. שימו לב כי SB aliquots יכול להיות הקרת פעם אחת בלבד.</li>
</ol>2. אחזור ואחסון של הלב העוברי ובגירים דגימות
<ol><li>לאחסן האנושי למבוגרים auricles ישירות על הסרת במהלך ניתוח בצינור 50-mL עם 15 מ"ל DMEM גבוהה-גלוקוז המכיל 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ב 4 º C. בדרך כלל 3-5 ס מ גודל ודוגמאות ניתן לאחסן עד 48 שעות לאחר ניתוח.</li>
	<li>חנות ליבם עוברי המתקבל הפלה בחירה בחומר EPDC בינוני ב 4 ° C עד 24 שעות לאחר בידוד. עבור פרוטוקול זה, השתמש דגימות עם עידן הריונית בין שבועות 12-22. שימו לב כי ניתן להשתמש בלב שלם עבור בידוד של epicardium.</li>
</ol>3. בידוד של השכבה Epicardial
<ol><li>בזרימה שכבתית cabinet, להכין תבשיל 100-מ מ תא-תרבות עם PBS ולמקם droplet נפרד (~ 200 µL) ל- PBS במכסה. למלא צינור 15-מ ל מ ל מראש ומחוממת EPDC בינונית.</li>
	<li>המקום הרקמה לתוך המנה תרבית תאים מלאים PBS. ודא כי הרקמה הוא לחלח לעתים קרובות במהלך ההליך.</li>
	<li>שימוש של stereomicroscope, להסיר כל כך הרבה של השכבה epicardial מהרקמה ככל האפשר על ידי מתקלפת זה באמצעות מלקחיים. הערה: epicardium ניתן לזהות כמו שכבה דקה מאוד, שקוף בחוזקה דבקה החיצוני של הלב (איור 1 א'). נסה להימנע זיהום עם רקמת שומן epicardial וכלי הדם, מאז זה ה"בלתי הבידוד.</li>
	<li>לאסוף את חתיכות רקמה epicardial ה-droplet של PBS על המכסה.</li>
	<li>חותכים את הרקמה epicardial לחתיכות קטנות (0.5 מ מ3) באמצעות אזמל (איור 1B), או באמצעות קצות חדה מלקחיים קטנים. שימו לב כי החלקים צריך להיות מסוגל להעביר עם P1, pipet 000 עצה (שלב 3.6).</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של טריפסין הרקמה epicardial, לאסוף את השברים טריפסין עם P1, 000 pipet עצה. להעביר את הרקמה לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 1.5-mL (איור 1C).</li>
	<li>דגירה הצינורית בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך כדי טלטול-~ 60 סל ד.</li>
	<li>הסר את הצינור לאמבט מים, ולנקות החיצוני של הצינור עם 70% אתנול.</li>
	<li>לאפשר את הרקמה לשקוע לתחתית הצינור (איור 1D) ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע המכיל תאים epicardial אל הצינור 15-mL המכיל 5 מ"ל בינוני EPDC כדי להשבית את טריפסין.</li>
	<li>לחדש את הרקמה שנותרה בצינור צנטריפוגה חרוט עם טריפסין 1 מ"ל ומערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>חזור על שלב 3.7 כדי 3.10 פעמיים. בשלב הסופי, לאחר סך של 30 דקות של דגירה טריפסין, להעביר את תגובת שיקוע והן את הרקמה epicardial הנותרים לתוך הצינור המכיל EPDC בינונית.</li>
	<li>כאשר כל התאים נאספים EPDC בינוני, בעדינות עוברים ההשעיה מזרק 10-mL עם מחט 19-מד לתוך צינור 15-mL החדש מכנית מביצועם התאים (איור 1E). הערה: הקפד homogenize התליה על-ידי pipetting למעלה ולמטה עוברים גם הפתרון המחט כדי למנוע את המחט מקבל נחסמת.</li>
	<li>בהמשך מביצועם התאים, חזור על שלב 3.12 עם מחט 21-מד.</li>
	<li>מניחים מסננת תא 100-מיקרומטר על גבי צינור 50-mL ולהעביר את המדיום המכילות את התאים epicardial על גבי מסננת באמצעות פיפטה של 10-mL כדי להסיר כל גושים שנותרו (איור 1F).</li>
	<li>לשטוף את מסננת כדי לאסוף תאים שיורית מאת pipetting בינוני EPDC מ על גבי מסננת.</li>
	<li>Pipet התליה תא מהצינור 50-mL לתוך צינור 15-mL. מאז התאים שוקעים לתחתית הצינור, לנער את הפתרון בעדינות לפני pipetting. הערה: במהלך השלב זה לא הכרחי, צינור יותר קטן עזרי ויזואליזציה של בגדר לאחר צנטריפוגה.</li>
	<li>צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1 ג'י).</li>
	<li>הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא (איור 1 H) בהיקף הנדרש EPDC בינוני (טבלה 1). הערה: עבור העובר EPDCs, להשתמש ישירות EPDC בינוני המכיל 10 מיקרומטר של המדכא קינאז ALK5 (EPDC + SB). יכול להיות מצופה תאים בוגרים ללא SB במהלך המעבר הראשון.</li>
	<li>צלחת התליה תא על תרבות ג'לטין מצופה הלוחות (איור 1I). הגודל של הבאר תלוי בגודל של דגימת הרקמות epicardial (טבלה 1). שימו לב כי confluency נמוך יניעו את המופע של החובשים.</li>
	<li>מקם את התאים בחממה לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 כדי לאפשר את התאים לצרף הצלחת תרבות.</li>
</ol>4. תרבות של EPDCs
<ol><li>לחדש את המדיום EPDC + SB לפחות כל 3 ימים.</li>
	<li>לבדוק את התאים לפחות כל 3 ימים באמצעות המיקרוסקופ. כאשר התאים מגיעים confluency, דהיינו, כאשר לוח תרבות מכוסה עם תאים, המעבר את התאים על יחס שטח של 1:2. שימו לב כי להגיע confluency יכול לקחת ~ 5-10 ימים.<ol>
<li>האחות המדיום באמצעות pipet או מערכת השאיפה עם, למשל, pipet זכוכית.</li>
		<li>לשטוף את התאים בקפידה על-ידי הוספת PBS לתאים. בעדינות מערבולת את הצלחת, מחוק לגמרי מגניב.</li>
		<li>הוסף טריפסין לצלחת. סובב בעדינות את הצלחת לכסות את כל התאים עם טריפסין, דגירה את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס. הערה: השתמש כמו טריפסין קטן ככל האפשר (אינדיקציה: µL 200 לאדם טוב של 6 טוב צלחת)</li>
		<li>הקש את הצלחת לנתק באופן מכני את התאים מהחלק התחתון של הלוח. השתמש במיקרוסקופ כדי בדיקה חזותית אם התאים יש מנותק. אם לא, תקופת דגירה לצלחת תרבות תא של רגע מיותר.</li>
		<li>להוסיף נפח בינוני EPDC + SB הנדרש לתאים, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה, להעביר התליה תא צלחת חדשה של תרבות ג'לטין מצופה. הערה: באופן כללי, תאים יכולים להישמר מורפולוגיה המרוצף עד המעבר 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. אינדוקציה של החובשים ב- EPDCs
<ol><li>לזירוז החובשים, לנתק את התאים עם טריפסין והעברת התאים לג'לטין חדש מצופה בארות על יחס 1:2 משטח EPDC + SB בינוני, כפי שמתואר 4 ולאחר תקופת דגירה של פחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.</li>
	<li>הסימון אם confluency הוא 50-70%, ואם EPDCs מורפולוגיה המרוצף. הערה: Confluency משפיע על היכולת של EPDCs לעבור החובשים.</li>
	<li>האחות המדיום מתאי ולשטוף את התאים בזהירות עם PBS (ראה שלב 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>לעורר תאים עם 1 ng/mL TGFβ3 EPDC בינוני ומניחים בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 5 ימים. שימו לב כי במהלך גירוי, המדיום EPDC המכיל TGFβ3 אין המיועדים לחידוש מלאי.</li>
	<li>נטר את התאים מדי יום. לאחר 5 ימים, תאים שעברו החובשים מזוהים עם מורפולוגיה בצורת כישור (איור 2 א).</li>
	<li>תרבות בצורת פלך EPDCs על פי השיטה המתוארת ב- 4 ללא תוספת של SB או TGFβ למדיום EPDC. שימו לב: באופן כללי, פלך בצורת EPDCs יכול להיות מחונן עד מעבר 20</li>
	<li>לאמת את המופע של החובשים עם צביעת immunofluorescent באמצעות נוגדנים נגד סמנים mesenchymal αSMA או Vimentin או phalloidin כדי לזהות את היווצרות F-אקטין מתח סיבים (איור 2B), או באמצעות PCR לרביעיית עבור גנים הקשורים החובשים ( למשל, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-קדהרין, MMP3, חילזון, שבלול) (איור 2C ו לטבלה 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells:+Their+origin,+role+and+fate.">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li><li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development.">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li><li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart.">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li><li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-Derived+Heart+Repair.">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li><li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor.">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li><li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li><li>M&#228;nner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li><li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation,+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes.">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li><li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns.">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li><li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development.">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li><li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury.">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li><li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction.">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li><li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells:+a+novel+model+to+study+their+activation.">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li><li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells.">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li><li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro.">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li><li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF&#946;-signaling+and+WT1.">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGF&#946;-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li><li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue.">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן נתאר של פרוטוקול מפורט כדי לבודד והתרבות תאים epicardial הראשית נגזר לבבות אדם מבוגר ו עוברית. אפיון מקיף של תאים אלה כבר שפורסמו בעבר17. אנחנו הראו כי שני סוגי תאים יכול להישמר כתאי אפיתל ריצוף דמוי כאשר תרבותי עם החומר המדכא קינאז ALK5 SB431542. החובשים הוא חלק בלתי נפרד של הפעלת epicard...

Epicardium, שכבת האפיתל תא בודד מעטפות הלב, הוא בעל חשיבות פיתוח הלב ותיקון (נבדקה בסמיתס. ואח 1). נכה, epicardium נובע העוגב proepicardial, מבנה קטן הממוקם בבסיס הלב המתפתח. סביב יום התפתחותית E9.5 העכבר ולאחר 4 שבועות תפיסה פוסט-אנוש, התאים להתחיל להעביר מתוך מבנה כרובית ולכסות את שריר הלב המתפתח2. ברגע נוצרת שכבה תא אפיתל בודד, חלק מהתאים epicardial עובר אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים). במהלך אמבולנס, תאים לאבד את מאפייני האפיתל שלהם, כגון תאים תאים הדבקויות, ולקבל הפנוטיפ mesenchymal אשר נותן להם את היכולת להעביר לתוך שריר הלב המתפתח. התאים נגזר epicardial בנוי (EPDCs) יכולים להתמיין מספר סוגי תאים הלב כולל fibroblasts, תאי שריר חלק, ואת פוטנציאל cardiomyocytes תאי אנדותל3, למרות בידול של האחרונים שני תא האוכלוסיות נותר כפוף הדיון (נבדקה בסמיתס. et al. 4). יתרה מכך, epicardium מספק אותות paracrine מאלף אל שריר הלב כדי לווסת את הצמיחה ואת vascularization5,6,7,8. מחקרים רבים הוכיחו כי היווצרות epicardial לקוי מוביל ליקויים התפתחותיים-שריר הלב9,10, להערכת11, הולכה מערכת12, תוך שימת דגש ארומטיים התרומה של epicardium את היווצרות של הלב.
למרות בלב למבוגרים epicardium קיים כשכבה רדום, זה הופך להפעיל על איסכמיה13. Epicardial הפעלה מחדש לאחר פציעה recapitulates מספר התהליכים המתוארים לפיתוח לב, כולל הפצת החובשים14, אם כי פחות ביעילות. מעניין, למרות המנגנון המדויק אינה מובנת במלואה, התרומה epicardial לתקן ניתן לשפר על ידי טיפול עם, למשל, β4? ואת מוכנה15 או שונו VEGF-A mRNA16, וכתוצאה מכך יושבחו דום לב פונקציה לאחר אוטם שריר הלב. Epicardium ולכן היא נחשבת מקור תא מעניינים לשיפור ותיקון אנדוגני של הלב הפצוע.
מנגנוני התפתחות הלב הם לעתים קרובות recapitulated במהלך פציעה, אם כי באופן פחות יעיל. בחיפוש אחר מפעילים epicardial, זה בעל חשיבות עליונה. כי אנחנו יכולים לקבוע ולהשוות לקיבולת המלאה של epicardium העובר ואת למבוגרים. יתר על כן, מנקודת מבט טיפולית, זה חשוב, בנוסף לניסויים בבעלי חיים, אנו להרחיב ידע לגבי התגובה של epicardium האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה לבודד, תרבות למבוגרים ו עוברית epicardial נגזר תאים אנושיים (EPDCs) במורפולוגיה אפיתל תאים דמויי, כדי לעודד את החובשים. במודל זה, אנו שואפים לחקור ולהשוות בהתנהגות התא epicardial למבוגרים ו עוברית.
היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש של חומר epicardial האנושי, אשר לא נחקרה ביסודיות. חשוב, פרוטוקול תרבות המתואר, בידוד ותא מספק שיטה אחידה אחת להפיק שני EPDCs חלוק עוברית, למבוגרים, המאפשרים השוואה ישירה בין מקורות שני תאים אלה. בנוסף, מאז epicardium הוא מבודד בהתבסס על המיקום שלו, זה מובטחת כי התאים נמצאים למעשה נגזרת epicardially17.
בעוד האדם שיטות בידוד EPDC הוקמו בעבר, אלה בעיקר להסתמך על פרוטוקולים תוצר איפה פיסות רקמת לב או epicardial הם מצופה על18,19מאכל התרבות התא. גישה זו בוחר ובכך במיוחד עבור תאים זה חלקית לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם על מנת להעביר, ו זה נוטים יותר עוברים החובשים ספונטנית. בפרוטוקול הנוכחי, epicardium שהוא מעובד תחילה פתרון תא בודד אשר מאפשר את EPDCs מבודד לשמור על מצב אפיתל שלהם. שיטה זו מספקת ולכן מודל מוצק במבחנה ללמוד החובשים epicardial.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&amp;micro;L Filtered Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Or home-made and sterilized</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Needles 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieves, 100 &amp;micro;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;3&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma</td><td>A2547&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens

Epicardium, שכבת תאים אפיתל כיסוי שריר הלב, יש תפקיד חיוני במהלך התפתחות הלב, כמו גם התגובה תיקון הלב לאחר פציעה איסכמי. כאשר מופעלת, תאים epicardial עוברים תהליך המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) כדי לספק לתאי שריר הלב ההתחדשות. יתר על כן, epicardium תורמת באמצעות הפרשת גורמים חיוניים paracrine. כדי להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של epicardium, דרושה דוגמנית התא האנושי. כאן אנחנו חלוקה לרמות מודל תרבות תא הרומן לנבוע ראשי תאים נגזר epicardial (EPDCs) ברקמת הלב האנושי למבוגרים ו עוברית. כדי לבודד EPDCs, epicardium גזור מבחוץ של הדגימה הלב, מעובד להשעיה תא בודד. בשלב הבא, EPDCs מצופה, תרבותי EPDC בינוני המכיל את המדכא 5-קינאז ALK SB431542 לשמור על פנוטיפ אפיתל שלהם. החובשים הנגרמת על ידי גירוי עם TGFβ. שיטה זו מאפשרת, לראשונה, חקר התהליך של החובשים epicardial אנושית בסביבה מבוקרת, ומקל צובר יותר על בסיס secretome של EPDCs עשוי לסייע הלב התחדשות. יתר על כן, גישה אחידה זו מאפשרת השוואה ישירה ההתנהגות האנושית למבוגרים ו עוברית epicardial.

כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול פשוטה כדי לבודד EPDCs מן האדם למבוגרים ו עוברית ברקמת הלב (איור 1). פרוטוקול זה מנצל מיקום נגיש epicardium בצד החיצוני של הלב (איור 1 א'). כתמים auricle הלב לאחר ניתוח מדגים כי WT1 + epicardium מוסר בעוד מטריצה חוץ-תאית subepicardial הבס?...

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens at JoVE.com

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.7K Views.  Leiden University Medical Center. Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.

Video: The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Engineering

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

בידוד ואפיון פונקציונלי של אדם חדרית שריר לב מדוגמאות כירורגי טריות

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Medicine

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

בידוד של תאי כלילית ותאים כליליים מהקיר החופשי של לב החולדה

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

בידוד של קרדיומיוציטים חדריים אנושיים מפרוסות שריר הלב ויסטום-לחתוך

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Epicardial תולדת תרבות Assay ו