עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מסינגפור הספר לרפואה בוגר DUKE-NUS, קרן גו וסינגפור המילגה NRF (NRF-NRFF2016-01) כדי Manvendra ק סינג.

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים הספר לרפואה בוגר Duke-NUS ושימוש. 1. אחזור העוברי החדרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורבן עכבר בהריון בעיתוי בשלב העוברי הרצוי (E11.5 או E12.5) באמצעות תא המתת חסד עם אספקת גז דו תחמוצת הפחמן או שיטה אחרת המתת חסד אושרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על גבו על שולחן הניתוחים. לחטא את הבטן של הנקבה עם אתנול 70%. הרם את העור מעל הבטן ולעשות חתך קטן (1-2 ס&quot;מ) עם להב, ולאחר מכן החזק את העור בשתי ידיים מתרחק כדי לחשוף את דופן הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו לחתוך את דופן הבטן לחשוף את קרן הרחם. שימוש במלקחיים סטרילי כדי להרים את קרן הרחם ובזהירות לחתוך את רקמות השומן וכלי דם מצורפות קרן הרחם. חותכים את צוואר הרחם כדי לאחזר את הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרן הרחם בצלחת פטרי שמכילה Buff פוספט 1x קר סטרילי<html> ered מלוח (PBS) ולשטוף בעדינות. מניחים את צלחת פטרי על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים לחתוך את קו האמצע של קרן הרחם (מול לאתר שבו השליה ממוקמת) לחשוף את העוברים כי עדיין בתוך שק החלמון ואת המחובר לקיר הרחם דרך השליה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים סטריליות, לבתק את שק החלמון העוברי לשחרר את העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העובר בצלחת פטרי חדשה המכילה PBS 1x קר סטרילי. לערוף את העובר ומניחים אותו על גבו. גזור לפתוח את בית החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים סטרילי כדי לרומם את הרוח וחתך את הכלי סביבו כדי לשחרר את הלב מקיר החזה. שימו לב מיוחדת שלא לפגוע epicardium של הלב עם כלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך את דרכי היצוא ושניהם פרוזדורים. מעביר את החדר כדי צלחת נוספת עם PBS 1x הקר. מניח את הצלחת על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6-1.9 עד שכל החדרים מאוחזרות. </li></ol>le &quot;&gt; 2. Epicardial explant תרבות הערה: תרבות explants epicardial אלה גם בשקופיות קאמרית זכוכית או על ג&#39;ל קולגן עבור יישומים במורד הזרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זכוכית לשכת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התקשורת והתרבות, להוסיף 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 ng / צמיחה פיברובלסטים רקומביננטי מ&quot;ל גורם 2 (FGF2) עד בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM). בצע את כל שלבי ברדס הזרימה למינרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מדיה התרבות 500 μl היטב בכל תא 8-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל חדר ניכר במרכז באר. אוריינט החדר כדי לשמור על הצד גזור למטה על פני השטח התחתון של הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשים את הצלחת חממת תרבית תאים 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תרבות עם הפרעה מינימלית כדי לאפשר את explants לדבוק. כינונה של monolayer epicardial ניתן לראות לאחר 48-72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבידול של epicardתאי ial לתאי שריר חלק, תרבות תאים בשכבה epicardial בתקשורת בידול עבור 6 ימים נוספים. כדי להכין את התקשורת בידול, להוסיף 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -50 ng / גורם הגדילה ששינתה את המציאות רקומביננטי מ&quot;ל 1 בטא (TGF-β1) כדי DMEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קולגן ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ג&#39;ל קולגן צלחת 96-היטב באמצעות ערכת מסחרי 3D קולגן תרבות על פי פרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את העוצמה הרצויה של ג&#39;ל קולגן, לערבב את הכמות המתאימה של פתרון קולגן עם 5x של DMEM ו פיפטה למעלה ולמטה. הפתרון צריך להפוך צהוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח מקביל של פתרון נטרול ומערבב היטב מייד על ידי pipetting למעלה ולמטה. הפתרון יהפוך ורוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 100 μl של תערובת זו לבאר כל צלחת 96-היטב. מניחים את צלחת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 30-60 דקות עד אלהג&#39;ל נמוך לפלמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של התקשורת בתרבות שתוארו לעיל היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל חדר ניכר במרכז באר. כוונו את החדר כדי לשמור על הצד הגזור למטה על ג&#39;ל קולגן (הקודקוד של החדר צריך להתמודד עם הנסיין). בעדינות לשים את הצלחת בחזרה בחממת תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים, להסיר את החדרים. מכניס את הצלחת בחזרה לתוך חממת תרבית תאים עבור 2 ימים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את התקשורת והתרבות לסירוגין. </li></ol></li></ol> קיבוע ויזואליזציה 3. הערה: תאי Epicardial ניתן דמיינו על זכוכית או שקופיות קאמריות או ג&#39;ל קולגן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת והתרבות ולהוסיף נפח שווה של PBS 1x סטרילי כדי לשטוף את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מספיק 4% paraformaldehyde (PFA) כדי לכסות את התאים. תקן את התאים במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PFA ולשטוף explants עם 1x PBST (1x PBS עם0.1% טריטון X-100) כדי permeabilize התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immunostain עם נוגדן הרצוי (למשל אלקסה פלואוריד 488-phalloidin; ZO-1, α-טובולין ו אקטין שריר חלקה α) 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Mikawa, T., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+analysis+of+cardiac+morphogenesis:+discontinuous+formation+of+coronary+vessels.">Retroviral analysis of cardiac morphogenesis: discontinuous formation of coronary vessels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9504-9508 (1992).</li><li>Mikawa, T., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericardial+mesoderm+generates+a+population+of+coronary+smooth+muscle+cells+migrating+into+the+heart+along+with+ingrowth+of+the+epicardial+organ.">Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ.</a> Dev Biol. 174, 221-232 (1996).</li><li>Manner, J., Perez-Pomares, J. M., Macias, D., Munoz-Chapuli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+formation+and+developmental+significance+of+the+epicardium:+a+review.">The origin, formation and developmental significance of the epicardium: a review.</a> Cells Tissues Organs. 169, 89-103 (2001).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+contribute+a+novel+population+to+the+myocardial+wall+and+the+atrioventricular+cushions.">Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions.</a> Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).</li><li>von Gise, A., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+epithelial+to+mesenchymal+transitions+in+heart+development+and+disease.">Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease.</a> Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).</li><li>Katz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+compartments+of+the+proepicardial+organ+give+rise+to+coronary+vascular+endothelial+cells.">Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells.</a> Dev Cell. 22, 639-650 (2012).</li><li>Singh, M. K., Lu, M. M., Massera, D., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-processing+enzyme+Dicer+is+required+in+epicardium+for+coronary+vasculature+development.">MicroRNA-processing enzyme Dicer is required in epicardium for coronary vasculature development.</a> J Biol Chem. 286, 41036-41045 (2011).</li><li>Degenhardt, K., Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+approaches+under+development:+cardiovascular+embryology+applied+to+heart+disease.">New approaches under development: cardiovascular embryology applied to heart disease.</a> J Clin Invest. 123, 71-74 (2013).</li><li>Singh, M. K., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cardiac+mesenchymal+stem+cells:+expanding+the+outer+limit+of+heart+repair.">Epicardium-derived cardiac mesenchymal stem cells: expanding the outer limit of heart repair.</a> Circ Res. 110, 904-906 (2012).</li><li>Manner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+on+the+formation+of+the+epicardium+in+chick+embryos.">Experimental study on the formation of the epicardium in chick embryos.</a> Anat Embryol (Berl). 187, 281-289 (1993).</li><li>Manner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Dev Dyn. 233, 1454-1463 (2005).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Dev Dyn. 228, 161-172 (2003).</li><li>Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Bergwerff, M., Mentink, M. M., Poelmann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+outgrowth+inhibition+leads+to+compensatory+mesothelial+outflow+tract+collar+and+abnormal+cardiac+septation+and+coronary+formation.">Epicardial outgrowth inhibition leads to compensatory mesothelial outflow tract collar and abnormal cardiac septation and coronary formation.</a> Circ Res. 87, 969-971 (2000).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Dev Cell. 8, 85-95 (2005).</li><li>Merki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+retinoid+X+receptor+alpha+is+required+for+myocardial+growth+and+coronary+artery+formation.">Epicardial retinoid X receptor alpha is required for myocardial growth and coronary artery formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18455-18460 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Dev Biol. 255, 334-349 (2003).</li><li>Huang, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP+transcription+factors+mediate+epicardial+activation+during+heart+development+and+injury.">C/EBP transcription factors mediate epicardial activation during heart development and injury.</a> Science. 338, 1599-1603 (2012).</li><li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).</li><li>Christoffels, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tbx18+and+the+fate+of+epicardial+progenitors.">Tbx18 and the fate of epicardial progenitors.</a> Nature. 458, 8-9 (2009).</li><li>Rudat, C., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wt1+and+epicardial+fate+mapping.">Wt1 and epicardial fate mapping.</a> Circ Res. 111, 165-169 (2012).</li><li>Duim, S. N., Kurakula, K., Goumans, M. J., Kruithof, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+endothelial+cells+express+Wilms'+tumor-1:+Wt1+expression+in+the+developing,+adult+and+infarcted+heart.">Cardiac endothelial cells express Wilms' tumor-1: Wt1 expression in the developing, adult and infarcted heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 81, 127-135 (2015).</li><li>Iyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+derivation+of+epicardium+and+its+differentiated+smooth+muscle+cell+progeny+from+human+pluripotent+stem+cells.">Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells.</a> Development. 142, 1528-1541 (2015).</li><li>Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+the+epicardial+lineage+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 32, 1026-1035 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

זה הוא מכריע לפתח טכניקות להקל על המחקר של epicardium כדי לשרת את המשמעות הגוברת של epicardium בפיתוח לב והתחדשות. מערכת התרבות epicardial תנוחות יתרונות משמעותיים למחקר epicardial. דרך חלופית לבודד תאים epicardial היא להשתמש מיון התא המופעל פלואורסצנטי...

שפע של נתוני ניסוי הדגים כי epicardium משפיע שלבים קריטיים בפיתוח לב. במהלך הפיתוח, מחצה transversum מוליד גוש של תאים mesothelial המכונה proepicardium 1-4. תאים מן proepicardium מכן להעביר ומעטפת שריר הלב להרכיב את epicardium. בעקבות זאת, תת קבוצה של תאים epicardial לעבור והוליד EMT לאוכלוסייה הנדידה של תאים שמקורם epicardium (EPDCs) כי לאחר מכן לפלוש שריר הלב. שושלת גנטית וכן retroviral התחקות ניסויים הוכיחה כי EPDCs להתמיין שושלות שונות, כולל תאי שריר חלק, פיברובלסטים, אנדותל תאי cardiomyocytes (אם בכלל). לכן EPDCs לתרום רבות להתפתחות של כלי הדם הכליליים ואדריכלות שריר הלב 1,2,4-9. יתר על כן, epicardium חיוני לפיתוח השכבה הקומפקטית חדרית 10-12. לקבלת דוארxample Gittenberger-דה גרוט et al., הוכיח כי עיכוב התולדה של proepicardium מוביל מערך של ליקויים כגון שריר לב רזה, looping הלקוי של לב היווצרות מחץ interventricular נורמלית וכתוצאה מכך, 13 הקטלניות עובריות. גורמי paracrine מופרשי epicardium העוברי לווסת התפשטות cardiomyocyte והבחנה. בקנה אחד עם זו, מחיקה ספציפי epicardium של מסלולי איתות כגון חומצה רטינואית (RA), גורמי גדילה פיברובלסטים (FGFs) ו Wnt / β-קטנין הביאה לצמיחת שריר לב פגומה קטלנית עוברי 14-16. למרות epicardium היה ככל הנראה רדום לבבות מבוגרים, מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי תכנית התפתחותית מחדש של epicardium הבא לב פציעת 17,18. לאחר ההפעלה, התאים עוברים התפשטות מהירה EMT שתוצאתן היווצרות EPDC. תאים אלה מציגים את capacity להתמיין פיברובלסטים ותאי שריר חלק אבל לא cardiomyocytes או תאי האנדותל 18. בנוסף, EPDCs מפריש גורמי proangiogenic שסיוע של כלי הדם של האזור הפגוע ובכך להקל על תפקוד לב משופר על ידי הקטנת הגודל האוטם. בשל ממצאים אלה, epicardium צברה עניין במחקר של פיתוח, מחלות לב וכלי דם והתחדשות. טכנולוגיה מהונדסת יש מהפכה במחקר רפואי במאות ה -21. בעזרת טכנולוגיות מהונדסות, במודלים של עכברים חולים מחקו את המצב האנושי מבחינה מטבולית ו pathophysiologically פותחו בהצלחה. עם זאת, לומד את התנהגות התא epicardial מוטנטים אלה כבר אתגר בעיקר בשל הקטלניות עובריים מוקדם. בהתחשב תפקיד משמעותי כי epicardium משחק בפיתוח והתחדשות לב, הקמנו מערכת תרבות במבחנה לעכבר epicardiaתאי l. שיטה זו מאפשרת תרבות ארוכת הטווח של תאי epicardial ומקל על מחקר מפורט של שני המאפיינים החשובים של epicardium: יכולתו להעביר ולבדל. תעלות חדרי המוח נכרת מן העכבר יכול להיות מתורבת על ג&#39;ל קולגן אשר ניתן להשתמש בהם כדי לנהל מבחני הגירה. בתרבית במטריצה ​​3D כי משכפל את תאי מטריקס עשיר קולגן של השכבה subepicardial טוב משכפלת את הפיזיולוגיה תא vivo. לחלופין, הם יכולים להיות מתורבתים בשקופיות קאמריות כדי להקים monolayer epicardial אז מה שיכול לשמש עבור מגוון רחב של יישומים במורד זרם. בשכבה זו יכולה לשמש כדי להכתים חלבונים צומת חזק אשר יספק תובנות על היכולת של epicardium לעבור EMT שהוא חיוני עבור הגירה. בנוסף, ניסויים בידול יכול גם להתבצע על תאים אלה. יתר על כן, פרופיל ביטוי גנים יכול להיות מנותח על ידי חילוץ RNA מן התאיםביצוע תגובת שרשרת פולימראז כמותיים (qPCR). לבסוף, monolayers יכול גם להיות מטופלות בעזרת חומרי ואחריו ניתוח מולקולרי לבדוק רפויים פוטנציאלי. להרכיב, מערכת תרבות epicardial זה מספקת לנו את ההזדמנות כדי להמחיש ולאסוף נתונים מולקולריים אשר מסייע להבנה על פיתוח epicardial. עוד תכונה רצויה של שיטה זו היא שהיא פשוטה ולא הגדרה מורכבת נדרשת. בקיצור, את העוברים נקצרים בכל הבאה E11.5 או E12.5 בו הלב הוא נכרת. תעלות חדרי המוח אז בתרבית על ג&#39;ל או קולגן או שקופיות קאמריות. כתוצאה מכך, התאים האלה יכולים לשמש כדי לבצע ניסויים במורד זרם.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>PeproTech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant transforming growth factor beta 1 (TGF-&amp;beta;1)</td><td>PeproTech</td><td>100-21</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-Tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T 6074</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-smooth muscle actin (SMA) antibody</td><td>Sigma</td><td>A 2547</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin antibody</td><td>Life tech invitrogen&amp;nbsp;</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>3D Collagen Culture kit&amp;nbsp;</td><td>Millipore&amp;nbsp;</td><td>ECM 675</td><td></td></tr><tr><td>8-well chamber slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>NNU 154534-PK</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Life Technologies</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 Real-Time PCR System</td><td>Life Technologies</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Superscript First Strand Synthesis kit</td><td>Life Technologies</td><td>11904-018</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro culture of epicardial cells from mouse embryonic heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

שימוש זה פרוטוקול התרבות, תאי epicardial עיקריים יכולים להיות מבודדים עם טוהר גבוה עבור יישומים במורד זרם. התאים בתרבית מסוגלים לעבור EMT, להעביר ולבדל רק כתאים epicardial לעשות in vivo. כדי לקבוע את הטו?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart at JoVE.com

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

in-vitro-culture-of-epicardial-cells-from-mouse-embryonic-heart

Research

JoVE Journal

Engineering

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

7.3K Views.  Duke-NUS Graduate Medical School. The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells. 

Video: In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicardial תולדת תרבות Assay ו<em&gt; Ex Vivo</em&gt; הערכה של נדידת תאים שמקורם Epicardial

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Developmental Biology

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

In Vitro Generation of Heart Field-specific Cardiac Progenitor Cells

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in developmental cardiology have led to generating cardiac cells from pluripotent stem cells, it is unclear if the two cardiac fields - the first and second heart fields (FHF and SHF) &#8212; are induced in pluripotent stem cells systems. To address this, we generated a protocol for in vitro specification and isolation of heart field-specific cardiac progenitor cells. We used embryonic stem cells lines carrying Hcn4-GFP and Tbx1-Cre; Rosa-RFP reporters of the FHF and the SHF, respectively, and live cell immunostaining of the cell membrane protein Cxcr4, a SHF marker. With this approach, we generated progenitor cells which recapitulate the functional properties and transcriptome of their in vivo counterparts. Our protocol can be utilized to study early specification and segregation of the two heart fields and to generate chamber-specific cardiac cells for heart disease modelling. Since this is an in vitro organoid system, it may not provide precise anatomical information. However, this system overcomes the poor accessibility of gastrulation-stage embryos and can be upscaled for high-throughput screens.

The purpose of this method is to generate heart field-specific cardiac progenitor cells in vitro in order to study the progenitor cell specification and functional properties, and to generate chamber specific cardiac cells for heart disease modelling.

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

Pluripotent stem cells offer great potential for understanding heart development and disease and for regenerative medicine. While recent advances in ...

טרנסגנזה מבוססת אלקטרופורציה של תאי לב בלבבות עכברים

An Efficient Transgenesis Approach for Gene Delivery in the Mouse Embryonic Heart

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, and fate of these progenitors are vital for the proper development of this organ. The molecular mechanisms that govern the morphogenesis of the heart are essential for understanding the pathogenesis of congenital heart diseases and embryonic cardiac regeneration. Classical approaches to investigate these mechanisms employed the generation of transgenic mice to assess the function of specific genes during cardiac development. However, mouse transgenesis is a complex, time-consuming process that often cannot be performed to assess the role of specific genes during heart development. To address this, we have developed a protocol for efficient electroporation and culture of mouse embryonic hearts, enabling transient transgenesis to rapidly assess the effect of gain- or loss-of-function of genes involved in cardiac development. Using this methodology, we successfully overexpressed Meis1 in the embryonic heart, with a preference for epicardial cell transfection, demonstrating the capabilities of the technique.

מחבר זרקור: טרנסגנזה של תאי לב לבדיקת גנים מהירה

This protocol presents a detailed methodological framework for electroporation-based transgenesis of cardiac cells in developing mouse hearts. The video assets provided here will facilitate learning of this versatile technique.

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

The mammalian heart is a complex organ formed during development via highly diverse populations of progenitor cells. The origin, timing of recruitment, ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biology

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

רומן<em&gt; Ex vivo</em&gt; שיטת תרבות ללב העכבר העוברית

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

במבחנה והתרבות של תאי Epicardial מתוך לב העכבר עוברי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Epicardial תולדת תרבות Assay ו

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

גישת טרנסגנזה יעילה להעברת גנים בלב העוברי של העכבר

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

רומן

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים