Name: isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains
Uploaded: 2018-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Claire Davis e Dr. Veronique Miron (The Queen Medical Research Institute, Edinburgh, Regno Kingdome) per aiuto iniziale e discussioni sull'approccio sperimentale e QMRI citometria a flusso e Cell Sorting Facility. Questo lavoro è stato supportato da un Cancer Research UK carriera stabilimento Award al Dr. Dirk Sieger.

1. campione e preparazione di terreni
<ol><li>Preparare il supporto di embrione (E3) sciogliendo 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O H2O.</li>
	<li>Raccogliere gli embrioni di zebrafish immediatamente dopo la fecondazione (0 dpf).<ol>
<li>Dividere gli embrioni di zebrafish in 50 a capsula di petri di 90 mm. Sollevare gli embrioni a 28,5 ° C in 50 mL di mezzo di embrione (E3) trattati con 200 µM 1-fenil 2-tiourea (PTU), dalla fine del primo giorno di sviluppo (0 dpf) per tutta la durata dell'esperimento per inibire la pigmentazione.</li>
		<li>Cambia l'E3 + PTU medio giornaliero per tutta la durata dell'esperimento.</li>
		<li>Schermo mpeg1:eGFP e larve di NBT:DsRed al dpf 2 utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente per l'espressione del transgene positivo, macrofagi GFP+ /microglia e DsRed+ i neuroni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare tutti i media il giorno prima dell'esperimento sotto una cappa di coltura del tessuto per evitare la contaminazione, quindi conservarli a 4 ° C.<ol>
<li>Preparare i supporti A sciogliendo 15 mM Hepes e 25 mM D-glucosio in HBSS 1 x.</li>
		<li>Preparare mezzo gradiente di densità (100%) con 9 volumi del mezzo gradiente di densità in 1 volume di HBSS 10 x.</li>
		<li>Preparare il supporto di gradiente di densità (22%) diluendo 22 mL di terreno gradiente di densità (100%) in 88 mL di DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparare DPBS 1 x.</li>
		<li>Preparare il medium E3 + tricaina mescolando E3 media con 450 μM tricaina.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. omogeneizzazione
Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti 4 ° C.
<ol><li>Aggiungere 1,5 mL tricaina (15 mM) contenente 50 larve in 50 mL di mezzo di embrione E3 trattati con 200 µM PTU per anestetizzare terminalmente li di Petri di 90 mm.<ol>
<li>Aspirare 10 larve anestetizzate dalle capsule di Petri con una pipetta Pasteur massa plastica da 3 mL.</li>
		<li>Trasferimento anestetizzato larve 10 per 10 in una capsula di Petri 55mm riempito con gelida E3 embrione medium + tricaina.</li>
		<li>Sotto un microscopio stereoscopico, allineano 10 larve al centro del piatto petri. Quindi transetto larvale teste sopra il vitellino utilizzando micro-forbici chirurgiche (escludere la vescica natatoria per evitare teste di galleggiamento).</li>
		<li>Aspirare con teste dalle capsule di Petri con una pipetta Pasteur massa plastica da 3 mL. Attendere fino a quando tutte le teste si riuniscono all'interno la punta della pipetta e poi trasferiscono in un omogeneizzatore di vetro contenenti 1 mL ghiacciata Media A (trasferimento in un volume minimo di ridurre Media una diluizione in E3 + tricaina). Mantenere l'omogeneizzatore di vetro sul ghiaccio. Utilizzare un omogeneizzatore a condizione sperimentale.</li>
		<li>Sostituire ogni piccolo piatto di petri contenente ghiaccio freddo E3 + tricaina con uno nuovo ogni 30 min per assicurare che il transection viene eseguita a freddo E3 + tricaina medio.</li>
		<li>Sostituire la gelida A Media nell'omogeneizzatore di vetro quando il colore inizia dissolvenza. Nota: Diluizione A media può alterare il tessuto testa a causa di sbalzi di temperatura.</li>
		<li>Una volta che tutte le teste sono stati raccolti (600 capi/condizione), togliere il volume massimo di supporto all'omogeneizzatore di vetro e sostituirlo con 1 mL della ghiacciata a Media fresco.</li>
		<li>Distruggere il tessuto di cervello con un omogeneizzatore di vetro stretto sul ghiaccio. Eseguire 40 giri di frantumazione e giri per 3-5 dpf larve e 50 per le larve di dpf 7 e 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di supporto A sospensione cellulare (1 mL di supporto A / 200 capi), che in grado di diluire le cellule e ridurre la loro agglomerazione con mielina per facilitare la loro separazione durante la centrifugazione in gradiente medio densità.<ol>
<li>Per eliminare agglomerazione di cella, è possibile eseguire la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 40 µm posizionato sopra un tubo falcon freddo 50ml mantenuto sul ghiaccio. Ripetere questa operazione 3 volte.</li>
		<li>Trasferire 1 mL di sospensione cellulare in provette da 1,5 mL freddo e li spin a 300 g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante usando una siringa da 10 mL + ago 23 x 1 '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare con 1 mL di 22% densità ghiacciata terreno sfumatura delicatamente overlaid da 0,5 mL di DPBS ghiacciata 1 x (do non mix loro, un'interfase tra entrambe le soluzioni saranno visibili).<ol>
<li>Girare le provette a 950 g senza freno e lenta accelerazione per 30 min a 4 ° C. Nota: Questo passaggio separa mielina da altre cellule sequestrando esso all'interfase di DPBS 1 x e 22% densità gradiente medio, considerando che le cellule saranno a pellet nella parte inferiore del tubo. Rimozione di mielina è più efficiente quando la concentrazione delle cellule non è troppo alto.</li>
		<li>Usando una siringa da 10 mL + ago 23 x 1 ' scartare il massimo di DPBS, densità gradiente medio e mielina intrappolato al loro interfase.</li>
		<li>Lavare le cellule con 0,5 mL di mezzi A + 2% di siero di capra normale (NGS), poi fai girare tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Scartare il massimo del surnatante, poi piscina tutte le palline delle cellule dalla stessa condizione sperimentale insieme in 1 mL di Media A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se le cellule di interesse esprimono una proteina fluorescente come macrofagi/microglia da mpeg1:eGFP o neuroni dai pesci transgenici NBT:DsRed (proiezione di pesci transgenici Vedi 1.1.3), eseguire la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 35 µm di cap e trasferirli in un tubi freddi 5ml FACS su ghiaccio, al riparo dalla luce. Nota: In alternativa, può essere eseguita la immunocolorazione della microglia.</li>
</ol>3. Microglia Immuno-colorazione
Nota: Tutti i passaggi sono eseguiti a 4 ° C.
<ol><li>Risospendere il pellet cellulare con 0,3 mL di Media A + 2% NGS. Dividerli in tubi 3 x 1,5 mL: uno per le celle non colorate su misura auto-fluorescenza da celle di interesse, in secondo luogo per l'anticorpo secondario (1/200) misurare il legame non specifico dell'anticorpo secondario di microglia e terzo come test (4 4 mouse monoclonale anticorpo (microglia specifica) (1/20) + anticorpo secondario (1/200)).<ol>
<li>Aggiungere basso endotossina, privo di Azide (foglia) all'1% delle cellule (tutti i tubi) per bloccare CD16/CD32 interazioni con il dominio Fc delle immunoglobuline. Incubare le cellule per 10 min con movimentazione delicata ogni 5 min.</li>
		<li>Aggiungere i 4 4 anticorpo (1/20) alle cellule (tubo 3) ed incubare per 30 min con agitazione delicata ogni 10 min.</li>
		<li>Girare i tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C, quindi scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare una volta con 0,5 mL di mezzi A + 2% NGS, poi girare le provette a 300 g per 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Pellet e risospendere con 0,5 ml di Media A + 2% NGS e incubare le cellule con foglia all'1% per 10 minuti con agitazione delicata ogni 5 min.</li>
		<li>Aggiungere anticorpo secondario (1/200) alle celle (filmato 2 e 3). Incubare le cellule per 30 min con agitazione delicata ogni 10 min e protezione dalla luce.</li>
		<li>Gira tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C, quindi eliminare il surnatante.</li>
		<li>Lavare due volte con 0,5 mL di mezzi A + 2% NGS, poi pellet e risospendere con 1 mL di Media A + 2% NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la sospensione cellulare attraverso un tappo di colino di 35 µm cellulare e trasferirli in provetta freddo 5 mL FACS su ghiaccio, al riparo dalla luce.</li>
</ol>4. cell Sorting (FACS)
Nota: Eseguire tutti i passaggi a 4 ° C.
<ol><li>Ordinare i neuroni, microglia/macrofagi e microglia utilizzando un FACS. Nota: Questa operazione viene solitamente eseguita da un membro del personale della struttura FACS e impostazioni dipendono dal tipo di attrezzatura utilizzata.<ol>
<li>Aggiungere DAPI ad una concentrazione di 1 µ g/mL in ciascun tubo di FACS per etichettare le cellule morte.</li>
		<li>Impostare FACS e sorta di neuroni, microglia/macrofagi o microglia da tutte le cellule del cervello. Celle separate dai detriti in funzione della loro dimensione e granularità, quindi cancello singolo-cellule di forward scatter e dispersione laterale. Escludere le cellule morte di DAPI etichettatura da cellule vive. Identificare i neuroni, microglia/macrofagi o microglia dalla loro rispettiva macchiatura positiva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere le cellule in provette da 1,5 mL contenente 1 mL di gelida Media A + 2% NGS su ghiaccio. Utilizzare tubi diversi per ogni tipo di cellula.<ol>
<li>Gira tubi a 300 g per 10 min a 4 ° C e quindi scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare una volta con 0,5 mL di Media un allora scartare il massimo del surnatante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. estrazione del RNA
<ol><li>Estrarre RNA dai tipi differenti delle cellule separati da FACS. Estrazione del RNA utilizzare un kit specifico e attenersi alle indicazioni del produttore. Garantire per lavorare in un ambiente privo di RNAsi di pulizia dell'area di lavoro e le pipette con un prodotto di decontaminazione di RNAsi e utilizzare puntali con filtro.<ol>
<li>Appena preparare 1 mL di tampone di lisi completati con 50 µM β-mercaptoetanolo. Nota: Qui, β-mercaptoetanolo è aggiunto per ridurre la degradazione del RNA.</li>
		<li>Preparare la soluzione di etanolo 70% e 80% utilizzando RNasi acqua gratuita.</li>
		<li>Lisare cellule con 75 µ l di tampone di lisi completati con 50 µM β-mercaptoetanolo. Quindi utilizzare un trituratore per migliorare la distruzione cellulare.</li>
		<li>Continuare manuale dell'estrazione di RNA secondo produttore.</li>
		<li>Alla fine del protocollo, eluire il RNA con 14 µ l di acqua libera RNasi per ottenere una sufficiente concentrazione di RNA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo sperimentale descritto qui rappresenta un metodo affidabile ed efficiente per isolare le cellule cerebrali da larve di zebrafish da 3 a 8 dpf. D'importanza, questo è il primo protocollo che permette l'isolamento specifico di microglia da cervelli di zebrafish larvale. Il protocollo è progettato per preservare l'integrità della membrana delle cellule e ridurre al minimo le potenziali modifiche di espressione genica che si verificano durante l'elaborazione. Quest'ultimo punto è fondamentale per la rilevanza dei risultati sulla base dell'analisi di tali profili genomici cellulari isolati. Infatti, la polarizzazione di microglia e macrofagi sono fortemente influenzati dalla loro microambiente. A 37 ° C, queste cellule avrebbero cambiato il loro profilo di espressione genica in risposta a condizioni sperimentali (risposta di lesione (transection)). Pertanto, è stato cruciale eseguire questo esperimento a 4 ° C prima dell'estrazione di RNA, di rallentare i processi cellulari e attività metaboliche. Inoltre, l'omogeneizzazione del tessuto di cervello meccanico a 4 ° C è stato scelto invece di digestione enzimatica del tessuto a 37 ° C per evitare qualsiasi impatto su profili di espressione genica.
È importante sottolineare che questo metodo è molto veloce; entro un giorno diverse popolazioni di cellule del cervello possono essere isolate da almeno due diverse condizioni sperimentali e loro RNA estratto. La lunghezza totale del protocollo dipende dal numero delle larve utilizzato per ogni condizione come il transection del teste larvale è il passaggio limitante (∼ 350 capi/h). In generale, per lavorare con microglia da 3, 5 e 7 dpf è consigliabile transetto teste di ∼ 600 per ogni test per ottenere abbastanza RNA per estrarre (tabella 1). Come microglia rappresentano il tipo di cella con il più basso rendimento (circa 112 cellule pro capite alle 7 dpf), il numero di teste può essere ridotta per altri tipi di cellule tra cui i macrofagi (circa 170 cellule pro capite al dpf 7).
Un altro vantaggio di questo protocollo è che dopo aver definite le impostazioni ordinatore FACS, le stesse impostazioni possono essere utilizzate per diversi esperimenti. È stato osservato che le popolazioni delle cellule perfettamente da un esperimento a altro con cancelli precedentemente progettati, mostrando la riproducibilità degli esperimenti utilizzando questo metodo.
Un leggero svantaggio di questo metodo è la quantità relativamente bassa di RNA che viene raccolto. Tuttavia, questa limitazione è più un problema biologico di un problema tecnico, come il numero di microglia è molto basso nelle fasi iniziali di sviluppo del cervello (tabella 1). A causa di questa bassa quantità di RNA raccolto, amplificazione passaggi devono essere considerati per eseguire analisi di espressione genica vasta di genoma. Fortunatamente, questi passaggi di amplificazione producono una quantità sufficiente di cDNA di alta qualità. Così, cambiamenti globali in profili di espressione genica delle cellule isolate possono essere studiati.
In conclusione, questo protocollo fornisce un metodo affidabile per isolare e studiare vari tipi di cellule di CNS dai cervelli di zebrafish larvale. Questo può essere applicato per ottenere una più profonda comprensione di queste cellule durante lo sviluppo anche per studiare il loro ruolo nella malattia.

Conoscenza per lo sviluppo del cervello e malattie cerebrali ha migliorato significativamente nell'ultimo decennio dal prima quantificazione del cervello del mouse trascrittomi1. Infatti, analisi dell'espressione genica vasta genoma ci dà accesso a dettagliate informazioni genetiche sul tessuto cerebrale e le cellule che possono integrare e migliorare le osservazioni fatte con altre tecniche e strumenti.
Zebrafish è un modello biologico potente, facile da allevare e di modificare geneticamente; la relativa trasparenza ottica a stadi larvali permette live imaging osservazioni2. Purtroppo, rispetto a umano e mouse, il numero di anticorpi disponibili per eseguire immunocolorazione è piuttosto basso. Per risolvere questo problema, linee pesce zebrafish transgenici sono facilmente realizzati modificando geneticamente i pesci per esprimere le proteine fluorescenti sotto promotori specifici di tipo cellulare. Linee di zebrafish transgenici sono stati utilizzati in passato per studiare il ruolo dei macrofagi e microglia durante lo sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC) e malattia3,4,5,6. Tuttavia, per ottenere una comprensione dettagliata di questi processi abbiamo bisogno di capire i cambiamenti nell'espressione genica nei tipi rispettivi cellulari. A questo scopo, abbiamo sviluppato un metodo sperimentale per isolare in modo specifico le cellule come i neuroni, i macrofagi e microglia da 3 a 8 giorni cervelli larvale zebrafish post-fertilizzazione (dpf). Per l'istituzione del protocollo, abbiamo lavorato con linee di pesci transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) in macrofagi/microglia sotto il promotore del gene del macrofago-espresso (mpeg1:eGFP) e DsRed in neuroni sotto il ß-tubulina neurale promotore (NBT:DsRed)7,8,9. Inoltre, abbiamo effettuato immunocolorazione della microglia utilizzando 4 4, un anticorpo monoclonale di topo che specificamente le macchie zebrafish microglia10,11. In seguito, l'acido ribonucleico (RNA) è estratta da queste cellule per ulteriore reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o analisi del trascrittoma. Questo protocollo è stato progettato per omogeneizzare in modo efficiente il tessuto cerebrale da larve di zebrafish; raccogliere i neuroni, microglia/macrofagi e microglia senza alterazione della loro integrità della membrana plasmatica e infine estrarre RNA da queste cellule in alta qualità (RIN > 7) e la quantità di eseguire analisi genomica. A differenza di studi precedentemente pubblicati che utilizzano il trattamento di tripsina a 37 ° C per digerire cervello tessuto12,13, questo protocollo promuove il lavoro a 4 ° C fino alla fase di estrazione RNA per ridurre le modifiche del profilo di espressione genica. Questo passaggio è cruciale come microglia e macrofagi sono cellule altamente sensibili che rispondono ai cambiamenti nella loro microambiente immediatamente alterando il loro gene expression profile e polarizzazione14,15, 16.
Il protocollo qui descritto in dettaglio, spettacoli che l'isolamento dei neuroni, macrofagi e microglia da zebrafish larvale cervelli, ma virtualmente, può essere adattato a qualsiasi altra cella presentano all'interno del cervello - tramite linee di pesci transgenici o etichettati con anticorpi specifici. Questo metodo permetterà una migliore caratterizzazione delle cellule di CNS attraverso loro analisi dell'espressione genica vasta genoma e aiuterà a comprendere il loro ruolo durante lo sviluppo e malattie del cervello.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

Per ottenere una comprensione dettagliata del ruolo delle diverse cellule di CNS durante lo sviluppo o l'istituzione e la progressione delle patologie del cervello, è importante isolare queste cellule senza modificare il loro profilo di espressione genica. Il modello di zebrafish fornisce un gran numero di linee di pesci transgenici in cui sono etichettati tipi cellulari specifici; ad esempio i neuroni nella riga di NBT:DsRed o macrofagi/microglia nella linea mpeg1:eGFP. Inoltre, gli anticorpi sono stati sviluppati per macchiare le cellule specifiche, come la microglia con 4 4 anticorpo.
Qui, descriviamo l'isolamento dei neuroni, macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale. Centrale di questo protocollo è l'evitare una digestione enzimatica del tessuto a 37 ° C, che potrebbe modificare i profili di cellulari. Viene invece utilizzato un sistema meccanico di omogeneizzazione del tessuto a 4 ° C. Questo protocollo comporta omogeneizzazione dei cervelli in sospensione cellulare, loro immunocolorazione e l'isolamento dei neuroni, i macrofagi e microglia di FACS. In seguito, abbiamo estratto il RNA da quelle cellule ed abbiamo valutato la loro qualità/quantità. Siamo riusciti a ottenere RNA di alta qualità (RNA integrità numero (RIN) > 7) eseguire qPCR analisi trascrittomica e neuroni e microglia/macrofagi, microglia. Questo approccio consente una migliore caratterizzazione di queste cellule, come pure una più chiara comprensione circa il loro ruolo nello sviluppo e patologie.

Il protocollo descritto è un approccio diretto per isolare i neuroni, macrofagi e microglia dai cervelli larvale zebrafish. Da questi isolato le cellule, una quantità significativa di alta qualità (RIN > 7) RNA sono stati estratti. L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i diversi tipi di cellule dallo SNC, con modifiche minime del loro profilo di espressione genica per analizzare e caratterizzare funzioni e proprietà delle celle. Pertanto, l'intero protocollo viene eseguita a 4 ° C con un'omogeneizzazione del tessuto di cervello meccanico. Questo metodo è stato utilizzato con successo per due studi condotti in laboratorio. Nel primo studio, i neuroni e microglia/macrofagi sono stati isolati da 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ larve (Figura 1). FACS ha permesso la separazione delle cellule dai detriti in funzione della loro dimensione (FSC-A) e granularità (SSC-A) (Figura 1A). Singole cellule poi sono state separate da doppietti o agglomerati di cellule (Figura 1B). Della popolazione di singola cellula, un cancello è stato disegnato per eliminare le cellule morte (DAPI+). La trama di dot corrispondente ha rivelato che questo protocollo sperimentale preserva l'integrità della membrana plasmatica delle cellule, come il tasso di cellule morte è solo il 26,7% (Figura 1C). Infine, i neuroni (DsRed+) e macrofagi/microglia (GFP+) è stati segregati facilmente dalle porte della popolazione di cellule vive. La popolazione di neurone (23,1%) è sembrato essere più prominente rispetto alla popolazione di microglia/macrofagi (1,56%) all'interno del cervello (Figura 1D). Questo protocollo ha permesso di isolare RNA da quelle cellule per eseguire analisi successive qPCR per confrontare l'espressione di specifici geni tra neuroni e microglia/macrofagi. Figura 2 Mostra un neurone e livelli di espressione genica di microglia/macrofagi dell' antigene nucleare delle cellule di proliferazione (pcna)contro il gene di mantenimento della casa β-actina come esempio.
Per il secondo studio questo metodo focalizzata sulla microglia isolamento da 3, 5 e 7 dpf larvale brains. In contrasto con l'esperimento descritto in precedenza, le cellule sono state isolate mediante immuno-colorazione utilizzando 4 4, un anticorpo che specificamente etichette microglia (Figura 3 A-D). Come precedentemente descritto, microglia (4 4+) sono stati selezionati da cellule vive e raccolti (Figura 3D). Microglia numeri all'interno di zebrafish larvale cervelli sono variabili (tabella 1) e molto basso alle 3 dpf (∼ 25 al pesce). Qualità e quantità di RNA Estratto da quelle cellule sono stati misurati utilizzando un sistema di elettroforesi di micro-capillare basato. Risultati ottenuti di RNA Estratto da microglia di 5 dpf larvale zebrafish cervelli sono stati forniti per illustrare un esempio di analisi di RNA (tabella 1 (dpf 5; esperimento 4)). La figura 4 Mostra la traccia di elettroforesi e sua rappresentazione grafica ottenuta per questo esempio con una chiara visualizzazione di RNA ribosomiale (28s e 18s). Questi dati sono necessari per calcolare il campione RIN e per determinare la concentrazione di RNA. La tabella 1 riassume il numero di microglia isolato al pesce, la quantità di RNA per microglia e il Punteggio di RIN ottenuto per ogni esperimento diverso al dpf 3, 5 e 7. La quantità e la qualità del RNA Estratto da microglia isolato utilizzando questo metodo ci ha permesso di amplificare il RNA in cDNA usando un kit. Test di qualità e quantità fornite da Edimburgo genomica confermano che il cDNA amplificato è di qualità sufficiente per la preparazione di biblioteca e successivo sequenziamento. La figura 5 Mostra la distribuzione delle dimensioni dei frammenti di cDNA e loro quantità misurata utilizzando un sistema elettroforetico. In questo esempio, il cDNA aveva una dimensione media di un 299bp ad una concentrazione di 36100 pmol/l. la tabella 2 illustra rispettivamente test di qualità e quantità effettuata il cDNA amplificato da campioni di RNA (tabella 1 (dpf 5; esperimento 4)). Il cDNA amplificato è stato utilizzato con successo per il sequenziamento.
Numerosi studi condotti in laboratorio hanno confermato che la qualità e la quantità di RNA Estratto da neuroni, macrofagi e microglia può essere utilizzati per successive qPCR e analisi dell'espressione genica vasta genoma. Di conseguenza, questo protocollo sperimentale consente di isolare in modo affidabile diversi tipi di cellule CNS senza alterare l'integrità della membrana e limitando la modifica del loro profilo di espressione genica.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Figura 1 : FACS ordinamento per i neuroni e macrofagi/microglia da /NBT:DsRed mpeg1:GFP++ 8 larve di zebrafish dpf. (A-C) Gating successivi Mostra selezione sequenziale di tutte le cellule di cervello (A), disperdono di singole cellule di forward scatter e lato (B). Cellule morte (C) sono stati esclusi dall'etichettatura DAPI. (D) neuroni e microglia/macrofagi sono stati identificati rispettivamente dalla macchiatura positiva DsRed e GFP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Figura 2 : Analisi di espressione genica per pcna e β-actina nei neuroni e microglia/macrofagi. RNA da isolato neuroni e microglia/macrofagi può essere trascritto in cDNA per uso nell'analisi quantitativa di PCR. livelli di espressione di mRNA di pcna contro gene house-keeping β-actina in neuroni isolati e macrofagi/microglia determinato da qPCR (N = 3). Cambiamento di piega è stato misurato usando il metodo comparativo (ΔΔCT). Errore bar rappresentano media ± SEM. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Figura 3 : FACS ordinamento per microglia da 3 larve di zebrafish dpf. (A-C) Successivi gating Visualizza selezione sequenziale del cervello tutte le cellule (A), disperdono di singole cellule di forward scatter e lato (B). Cellule morte (C) sono stati esclusi dall'etichettatura DAPI. (D) Microglia sono stati identificati da 4 4 macchiatura positiva. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Figura 4 : Risultati di elettroforesi di micro-capillare di RNA Estratto da 5 dpf zebrafish microglia. Le due alte cime sono il RNA ribosomiale 18S e 28S. Numero di RNA integrità (RIN) è stato calcolato automaticamente dal software bioanalyzer utilizzando il rapporto generato il 18S e 28S subunità ribosomali e l'analisi di tutto il tracciato elettroforetico. Microglia RNA ha un 8.6 RIN. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Figura 5 : Test di qualità e quantità di cDNA amplificato dal campione di RNA di 5 dpf zebrafish microglia. L'immagine mostra la distribuzione di dimensione del frammento del cDNA del campione analizzato con una dimensione media di 299 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Condizione</td>
			<td>Esperimento</td>
			<td>Numero di pesci</td>
			<td>Numero di cellulare</td>
			<td>Numero di cellulare per pesce</td>
			<td>Concentrazione di RNA (pg/ul)</td>
			<td>RNA totale (pg)</td>
			<td>Quantità di RNA per cella (pg)</td>
			<td>Punteggio di RIN</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37,55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31,15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18,54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25,97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19,94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0,26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84,59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74,95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85,05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99,87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7,8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Sintesi delle microglia isolamento e dati di estrazione di RNA da larve di zebrafish dpf 3, 5 e 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>ID campione interno</td>
			<td>ID campione esterno</td>
			<td>Qubit (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/UL)</td>
			<td>Media concentrazione (ng/ul)</td>
			<td>Volume (ul)</td>
			<td>UG ha ricevuto</td>
			<td>Pass/fail per concentrazione minima</td>
			<td>Pass/fail per quantitativo minimo</td>
			<td>Pass/fail per quantità consigliata</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (esperimento 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58,4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>Passare</td>
			<td>Passare</td>
			<td>Passare</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Requisiti del campione per libreria Prep:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Biblioteca Prep</td>
			<td>Quantità minima (ng)</td>
			<td>Quantità consigliata (ng)</td>
			<td>Minima concentrazione ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano libreria gratuita del inserto bp 350 da cDNA del gel</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2: Test quantità di cDNA amplificato dal campione di RNA di 5 dpf zebrafish microglia.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Vi presentiamo un protocollo per isolare i neuroni, i macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale in condizioni fisiologiche e patologiche. All'isolamento, RNA è Estratto da queste cellule per analizzare il loro profilo di espressione genica. Questo protocollo consente la raccolta di RNA di alta qualità per l'esecuzione dell'analisi a valle come qPCR e trascrittomica.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Edinburgh. Vi presentiamo un protocollo per isolare i neuroni, i macrofagi e microglia da cervelli di zebrafish larvale in condizioni fisiologiche e patologiche. All'isolamento, RNA è Estratto da queste cellule per analizzare il loro profilo di espressione genica. Questo protocollo consente la raccolta di RNA di alta qualità per l'esecuzione dell'analisi a valle come qPCR e trascrittomica.

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Elaborazione di cellule intestinali da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a cellula singola

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autore in primo piano: Isolamento e analisi delle cellule intestinali delle larve di zebrafish per lo studio degli aspetti trascrittomici dello sviluppo gastrointestinale 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Neuroscienze

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Biologia

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Source: Mazzolini, J. et al. <a href="https://www.jove.com/v/57431/isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval">Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video describes a protocol to isolate neurons, macrophages, and microglia from larval zebrafish brains by mechanically disrupting the brain tissue. The purified cell populations can further be used for genomic analysis.

Isolamento delle cellule cerebrali dalle larve di pesce zebra: una tecnica per ottenere neuroni, macrofagi e microglia intatti dal tessuto cerebrale del pesce zebra

Source: Mazzolini, J. et al. Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains. J. Vis. Exp. (2018)
This ...

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Isolamento intestinale da larve di pesce zebra per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Isolamento nuclei dal tessuto intero utilizzando un metodo detergente e senza enzimi

Isolamento delle cellule cerebrali dalle larve di pesce zebra: una tecnica per ottenere neuroni, macrofagi e microglia intatti dal tessuto cerebrale del pesce zebra