אנו מודים ד ר קלייר דיוויס, ד ר ורוניק מירון (של המלכה Medical Research Institute, אדינבורו, נמצאת בליבה יונייטד) על דיונים הגישה ניסיוני ואת QMRI Flow Cytometry התא מיון מתקן ועזרה ראשונית. עבודה זו נתמכה על ידי סרטן מחקר בבריטניה הקריירה הממסד פרס כדי ד ר דרק Sieger.

1. מדגם והכנות מדיה
<ol><li>להכין העובר בינוני (E3) על ידי המסת 6.4 מ מ אשלגן כלורי, 0.22 מ מ NaCl, מ"מ 0.33 CaCl2 2 H2O, 0.33 מ מ MgSO4 7 שעות2O H2O.</li>
	<li>לאסוף דג זברה העוברים מיד לאחר ההפריה (0 dpf).<ol>
<li>פצל דג זברה עוברי 50 90 מ מ צלחת פטרי. העלאת עוברי ב 28.5 ° C ב- 50 מ של העובר בינוני (E3) שטופלו מיקרומטר 200 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל), בסוף היום הראשון של פיתוח (0 dpf) משך זמן הניסוי כדי לעכב פיגמנטציה.</li>
		<li>שינוי E3 + פרופילתיואוראציל בינוני מדי יום משך זמן הניסוי.</li>
		<li>מסך mpeg1:eGFP וזחלים NBT:DsRed-dpf 2 באמצעות stereomicroscope נמכרות עבור ביטוי חיובי transgene, המקרופאגים GFP+ /מיקרוגלייה DsRed+ נוירונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין כל המדיה יום לפני הניסוי ברדס תרביות רקמה כדי למנוע זיהום, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 º C.<ol>
<li>להכין מדיה A על ידי המסת 15 מ מ Hepes ו- 25 מ מ D-גלוקוז HBSS 1 x.</li>
		<li>הכן דחיסות צבע בינונית (100%) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום הדרגתיות צפיפות 1 ףקיהב HBSS 10 x.</li>
		<li>הכן המדיום הדרגתיות צפיפות (22 אחוז) על ידי דילול 22 מ של דחיסות צבע בינונית (100%) ב- 88 מ של DPBS 1 x.</li>
		<li>להכין DPBS 1 x.</li>
		<li>הכן E3 בינוני + Tricaine על ידי ערבוב בינונית E3 עם 450 μM Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המגון
הערה: כל השלבים הינם בביצוע 4 ° C.
<ol><li>להוסיף 1.5 mL Tricaine (15 מ מ) ל- 90 מ מ פטרי המכילות הזחלים 50 ב 50 מ של E3 העובר בינוני שטופלו 200 מיקרומטר פרופילתיואוראציל כדי סופני עזים ומתנגד להם.<ol>
<li>להתחנף 10 הזחלים מרדימים צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה.</li>
		<li>העברת ומורדמת הזחלים 10 ב-10 לתוך צלחת פטרי 55-מ מ מלא קפואים E3 העובר בינוני + Tricaine.</li>
		<li>תחת stereomicroscope, ישר הזחלים 10 במרכז הפטרי. ואז transect ראשים זחל מעל שק החלמון באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים (לא לכלול שלפוחית אוויר כדי למנוע הצפה ראשי).</li>
		<li>לספוג את ראשיכם צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה. לחכות עד כל ראשי מתאספים בעוד קצהו פיפטה ולאחר מכן להעביר אותם לתוך מהמגן זכוכית המכיל A Media כקרח 1 מ"ל (העברה באמצעי אחסון מינימלי כדי להפחית את המדיה לדילול ידי E3 + Tricaine). שמור את מהמגן זכוכית על קרח. השתמש מהמגן אחד לכל תנאי הניסוי.</li>
		<li>להחליף כל פטרי קטן המכיל קרח קר E3 + Tricaine חדשה כל 30 דקות כדי להבטיח את חיתוך מתבצע ב- E3 קר + Tricaine בינונית.</li>
		<li>החלף A Media כקרח ב מהמגן זכוכית הפעלת הצבע דוהה. הערה: דילול של המדיה יכול לשנות את הרקמה ראש עקב שינויי טמפרטורה.</li>
		<li>לאחר שנאסף כל ראשי (600 ראשי/תנאי), להסיר את הנפח המרבי של מדיה A מהמגן זכוכית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של טרי א מדיה קר כקרח</li>
		<li>לשבש את רקמת המוח עם מהמגן זכוכית צר על קרח. לבצע סיבובים 40 של ריסוק, והופך את הזחלים dpf 3-5, 50 עבור הזחלים dpf 7 ו- 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ל של מדיה A תא ההשעיה (1 מ"ל מדיה A / 200 ראשי), זה תאים למהול ולהפחית שלהם הצטברות המיאלין כדי להקל על הפירוד שלהם במהלך צנטריפוגה דחיסות צבע בינוני.<ol>
<li>כדי למנוע הצטברות תאים, לרוץ התליה תא דרך מסננת תא 40 µm להציב על גבי צינור בז קר 50 מ ל שמר על קרח. חזור על פעולה זו 3 פעמים.</li>
		<li>להעביר 1 מ"ל של השעיה תא קר mL 1.5 צינורות ולסובב אותם ב 300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מזרק 10-mL + מחט 23G x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחדש להשעות בגדר תא עם 1 מ"ל כקרח 22% צפיפות צבע בינוני בשכבות בעדינות על ידי 0.5 מ של קרח DPBS 1 x (do לא לערבב אותם, לאטמוספרה בין שני פתרונות יראו).<ol>
<li>ספין צינורות ב 950 g ללא בלימה והאצה איטי למשך 30 דקות ב 4 º C. הערה: שלב זה מפריד את המיאלין של תאים אחרים על-ידי sequestering זה-לאטמוספרה של DPBS 1 x ו- 22% צפיפות בינונית הדרגתיות, ואילו תאים גלולה בתחתית הצינורית. המיאלין הסרת יעיל יותר כאשר התא ריכוז אינו גבוה מדי.</li>
		<li>באמצעות על מזרק 10-mL + מחט 23G x 1'' להשליך המרבי של DPBS, צפיפות בינונית הדרגתיות המיאלין לכוד ב שלהם לאטמוספרה.</li>
		<li>לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% של סרום עז רגילה (הגדרות), ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע ולאחר מכן מאגר כל כדורי תא לפי מצב ניסיוני באותו יחד 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם התאים של ריבית מבטאים חלבון פלואורסצנטי כמו מקרופאגים/מיקרוגלייה מ mpeg1:eGFP או נוירונים NBT:DsRed הטרנסגניים דגים (הקרנת לראות דגים הטרנסגניים 1.1.3), לרוץ התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 35 קאפ ולהעביר אותם לתוך צינורות קר 5 מ"ל FACS בקרח, מוגן מפני אור. הערה: לחלופין, מכתים חיסונית של מיקרוגלייה יכולה להתבצע.</li>
</ol>3. מיקרוגלייה חיסונית מכתים
הערה: כל הצעדים מבוצעים ב 4 º C.
<ol><li>מחדש להשעות בגדר תא עם mL 0.3 של מדיה A + 2% המיתרים. לפצל אותם צינורות 3 x 1.5 mL: אחד עבור תאים וללא רבב למדוד אוטומטי-זריחה מתאי מעניינים, שנית הנוגדן המשני (1/200) למדוד את הכריכה לא ספציפית של הנוגדן משני כדי מיקרוגלייה ושלישית כמבחן (4C 4 העכבר monoclonal נוגדנים (מיקרוגלייה ספציפי) (1/20) + נוגדנים משניים (1/200)).<ol>
<li>הוסף אנדוטוקסין נמוכה, ללא אזיד (עלה)-1% תאים (כל צינורות) כדי לחסום את CD16/CD32 אינטראקציות עם התחום Fc של immunoglobulins. דגירה תאים עבור 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>הוסף את 4 4C נוגדן (1/20) על תאים (צינור 3) דגירה למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים, ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>צניפה תא מחדש להשעות 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים דגירה תאים עם עלה ב-1% למשך 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף נוגדנים משניים (1/200) לתאים (הצינור 2 ו- 3). דגירה תאים למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות והגנה אור.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>תשטוף פעמיים עם 0.5 מ של מדיה + 2% המיתרים, בזמנו, מחדש להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תריץ תא ההשעיה כובע מסננת 35 מיקרומטר תא ולהעביר אותם אל תוך קר 5 מ"ל FACS צינורות בקרח, מוגן מפני אור.</li>
</ol>4. תא מיון (FACS)
הערה: בצע את כל השלבים ב 4 º C.
<ol><li>למיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה באמצעות FACS. הערה: שלב זה מתבצע בדרך כלל על ידי איש צוות של המתקן FACS, הגדרות תלויות בסוג ציוד.<ol>
<li>להוסיף דאפי ריכוז של µg/mL 1 ב כל שפופרת FACS לסמן תאים מתים.</li>
		<li>להגדיר את הנוירונים FACS ומיון, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מכל התאים במוח. בתאים נפרדים מפני פסולת תפקודה של צפיפות רשת ובגודל שלהם, ואז שער חד-תאים על ידי פיזור קדימה ופיזור בצד. הכללת תאים מתים מאת דאפי labelling מתוך תאים חיים. לזהות נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מאת שלהם מכתים חיוביות בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף תאים צינורות 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מדיה A + 2% קר כקרח המיתרים על קרח. השתמש צינורות שונים עבור כל סוג התא.<ol>
<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה אז למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA החילוץ
<ol><li>לחלץ RNA סוגי התאים מופרדים על-ידי FACS. לחילוץ RNA להשתמש ערכת ספציפיים, פעל לפי ההנחיות של היצרן. ודא עובד בסביבה RNase חינם על-ידי ניקוי סביבת פיפטות עם מוצר טיהור RNase ולהשתמש מסנן טיפים.<ol>
<li>להכין טרי 1 מ"ל של פירוק מאגר בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. הערה: כאן, β-mercaptoethanol נוספת כדי להפחית את ה-RNA השפלה.</li>
		<li>להכין פתרון אתנול 70% ו- 80% באמצעות RNase מים חינם.</li>
		<li>Lyse תאים עם 75 µL מאגר פירוק בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. לאחר מכן להשתמש מגרסה והשמד לשיפור לשבירת תאים.</li>
		<li>המשך במדריך של החילוץ-RNA לפי יצרן.</li>
		<li>בסוף הפרוטוקול, elute את ה-RNA עם 14 µL של מים בחינם RNase בריכוז ה-RNA מספיקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirement+for+irf8+in+Formation+of+Embryonic+and+Adult+Macrophages+in+Zebrafish.">Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).</li><li>Mazaheri, F., Breus, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia.">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nature Communications. 5, 1-11 (2014).</li><li>Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+and+acute+neurodegeneration-specific+microglial+transcriptome+in+the+zebrafish.">Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish.</a> Glia. 65 (1), 138-149 (2016).</li><li>Hamilton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zebrafish+Live+Imaging+Model+Reveals+Differential+Responses+of+Microglia+Toward+Glioblastoma+Cells+In+Vivo.">A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo.</a> Zebrafish. , (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Peri, F., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Neuronal+Degradation+by+Microglia+Reveals+a+Role+for+v0-ATPase+a1+in+Phagosomal+Fusion+In+Vivo.">Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+descending+axons+preferentially+reroute+to+the+gray+matter+in+the+presence+of+a+general+macrophage/microglial+reaction+caudal+to+a+spinal+transection+in+adult+zebrafish.">Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).</li><li>Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptomic+landscape+of+the+developing+enteric+nervous+system+and+its+cellular+environment.">Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment.</a> BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li><li>Khuansuwan, S., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+during+development+of+the+zebrafish+pineal+complex+using+RNA+sequencing.">Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing.</a> Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).</li><li>Schmid, C. D., Melchior, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+LPS/IFN&#947;+activated+microglia+and+macrophages:+in+vitroversus+in+vivo.">Differential gene expression in LPS/IFN&#947; activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-+Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Khan, A., Ju, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+reveals+differential+activation+of+microglial+genes+after+ischemic+stroke+in+mice.">Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice.</a> Neuroscience. 348, 212-227 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול נסיוני המתוארים כאן מייצג שיטה חזקה ויעילה כדי לבודד תאי מוח של דג זברה הזחלים 3 כדי 8 dpf. חשוב, זה הפרוטוקול הראשון המאפשר הבידוד ספציפי של מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. הפרוטוקול נועד כדי לשמר את שלמות קרום התא כדי למזער את השינויים פוטנציאלי של ביטוי גנים שאירעו במהלך העיבוד. הנקודה האחרונה חיונית הרלוונטיות של תוצאות בהתבסס על הניתוח של פרופילים מבודדים אלה גנומית הסלולר. אכן, קיטוב מיקרוגלייה ו מקרופאג חריפה מושפעים microenvironment שלהם. ב 37 מעלות צלזיוס, תאים אלה הייתי משנה שלהם פרופיל ביטוי גנטי בתגובה לתנאי הניסוי (פציעה (חיתוך) תגובה). לכן, זה היה חיוני לבצע את הניסוי הזה ב 4 ° C לפני החילוץ RNA, להאט תהליכים תאיים ופעילויות מטבולית. יתר על כן, המגון רקמת המוח מכני ב 4 ° C נבחר במקום עיכול אנזימטי רקמות ב 37 ° C כדי למנוע כל השפעה על ביטוי גנים פרופילים.
חשוב להדגיש כי שיטה זו היא מהירה מאוד; תוך יום מספר אוכלוסיות של תאי המוח יכול להיות מבודד לפחות שני תנאים ניסויים שונים ו- RNA שלהם שחולצו. האורך הכולל של הפרוטוקול תלוי המספר של הזחלים משמש עבור כל תנאי חיתוך של ראשי הזחל הוא הצעד המגביל (∼ 350 ראשי/h). באופן כללי, כדי לעבוד עם מיקרוגלייה 3, 5 ו-7 dpf מומלץ transect ∼ ראשי 600 לכל מבחן כדי לקבל מספיק RNA לחלץ (טבלה 1). מיקרוגלייה מייצגים את סוג התא עם הנמוך ביותר תשואה (כ – 112 תאים לכל ראש-7 dpf), ניתן לצמצם את מספר ראשי עבור סוגי תאים אחרים כולל מקרופאגים (כ – 170 תאים לכל ראש-7 dpf).
יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי ברגע הגדרות ב סדרן FACS הוקמו, באותן ההגדרות יכול לשמש לניסויים שונים. נצפתה כי אוכלוסיות תאים מתאימים באופן מושלם מהניסוי אחד אחר עם שערים תוכנן בעבר, מציג את הפארמצבטית הניסויים בשיטה זו.
חיסרון קל של שיטה זו הוא כמות נמוכה יחסית של RNA האיסוף. אולם, מגבלה זו היא יותר עניין ביולוגי מאשר בעיה טכנית, כמו מספר מיקרוגלייה נמוכה מאוד בשלבים המוקדמים של התפתחות המוח (טבלה 1). בגלל זה כמות נמוכה של RNA שנאספו, הגברה צעדים שצריך לקחת בחשבון כדי לבצע ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום. למרבה המזל, השלבים הגברה לייצר כמויות מספיקות של cDNA באיכות גבוהה. לפיכך, שינויים כלליים של ביטוי גנים פרופילים של תאים מבודדים ניתן יהיה ללמוד.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חזקה לבודד וללמוד סוגים שונים של תאים CNS מן המוח דג זברה זחל. זה ניתן להחיל כדי לרכוש הבנה מעמיקה יותר של תאים אלה במהלך הפיתוח גם כדי ללמוד את התפקיד שלהם למחלה.

ידע על התפתחות המוח, המוח מחלות השתפרה במידה ניכרת בעשור האחרון מאז כימות הראשון של העכבר-המוח-transcriptomes-1. אכן, ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום נותן לנו גישה למידע גנטי מפורט על רקמת המוח ותאי זה יכול להשלים ולשפר את תצפיותיו עם טכניקות וכלים אחרים.
דג זברה היא דוגמנית ביולוגי חזק, קל להתרבות וכדי לשנות גנטית; שקיפותו אופטי בשעה שדרגות מאפשרת חיים תצפיות הדמיה2. למרבה הצער, בהשוואה ל אנושי, עכבר, המספר של נוגדנים זמינים לביצוע מכתים חיסונית נמוכות למדי. כדי לתקן זאת, קווים דגים דג זברה מהונדס בקלות מתבצעים על-ידי שינוי גנטית דג אקספרס חלבונים פלורסנט תחת התא סוג ספציפי היזמים. דג זברה מהונדס קווים שימשו בעבר ללמוד את התפקיד של מקרופאגים מיקרוגלייה בזמן מחלה3,4,5,6ופיתוח של מערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, כדי להשיג הבנה מפורטת של תהליכים אלה אנחנו צריכים להבין שינויים בביטוי הגנים סוגי תאים המתאימים. לכוונה זו, פיתחנו שיטה ניסיונית במיוחד בידוד תאי כמו נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה 3 8 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחל דג זברה המוח. להקמתה של הפרוטוקול, עבדנו עם קווים דגים הטרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב מקרופאגים/מיקרוגלייה תחת הגן בא לידי-ביטוי מקרופאג יזם (mpeg1:eGFP) ו- DsRed בנוירונים תחת ß-טובולין עצבית יזם (NBT:DsRed)7,8,9. יתר על כן, ביצענו מכתים חיסונית של מיקרוגלייה באמצעות 4C 4, נוגדן חד שבטי העכבר זה במיוחד כתמי דג זברה מיקרוגלייה10,11. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית (RNA) מופק מן התאים האלה עוד יותר כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) או transcriptome ניתוחים. פרוטוקול זה תוכנן כדי homogenize ביעילות רקמת מוח של דג זברה הזחלים; לאסוף את הנוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה ללא שינוי של שלמות קרום פלזמה שלהם ולחלץ סוף סוף RNA של תאים אלה באיכות גבוהה (RIN > 7) וכמות לבצע אנליזה גנומית. בניגוד מחקרים שפורסמו בעבר להשתמש טריפסין טיפול ב 37 מעלות צלזיוס לעכל12,של רקמת המוח13, פרוטוקול זה מקדם את העבודה ב 4 ° C עד השלב החילוץ RNA כדי להפחית את השינויים של פרופיל ביטוי גנטי. שלב זה הוא קריטי כמו מיקרוגלייה ו מקרופאגים הם תאים רגישים אשר מגיבים לשינויים microenvironment שלהם מיד על ידי שינוי שלהם ג'ין ביטוי פרופיל של קיטוב14,15, 16.
הפרוטוקול, המתוארים כאן בפירוט, מראה שהבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן מוח זחל דג זברה, אך למעשה, זה ניתן להתאים לכל תא אחר להציג בתוך המוח - גם באמצעות דגים הטרנסגניים שורות או בלוחיות הסבר נוגדנים ספציפיים. שיטה זו יאפשר אפיון טוב יותר של תאי מערכת העצבים המרכזית דרך את בדיקותיהם ביטוי הגן רחב של הגנום, תסייע לך להבין את תפקידם במהלך התפתחות המוח מחלות.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

כדי לקבל הבנה מפורטת של התפקיד של תאים שונים CNS במהלך פיתוח או הקמת והתקדמות של פתולוגיות במוח, חשוב לבודד תאים אלה מבלי לשנות פרופיל ביטוי גנטי. המודל דג זברה מספק מספר רב של קווים דגים מהונדס שבו לוחיות ההסבר סוגי תאים ספציפיים; לדוגמה הנוירונים NBT:DsRed קו או מקרופאגים/מיקרוגלייה בקו mpeg1:eGFP. יתר על כן, פותחו נוגדנים כתם תאים ספציפיים, כגון מיקרוגלייה עם 4C 4 נוגדן.
כאן, אנו מתארים את הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. מרכזי פרוטוקול זה הוא ההתרחקות עיכול אנזימטי רקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יכול לשנות פרופילים הסלולר. במקום זה משמש מערכת מכנית של רקמות המגון ב 4 ° C. פרוטוקול זה כרוך המגון המוח לתוך התא ההשעיה, מכתים חיסונית שלהם, הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מאת FACS. לאחר מכן, אנו מופק RNA תאים אלה, להעריך את האיכות/כמות. הצלחנו להשיג RNA באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר (RIN) > 7) כדי לבצע qPCR על ניתוח מקרופאגים/מיקרוגלייה נוירונים, ואת transcriptomic על מיקרוגלייה. גישה זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תאים אלה, כמו גם הבנה ברורה יותר על התפקיד שלהם בתחום הפיתוח פתולוגיות.

הפרוטוקול המתואר היא גישה ישירה לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה. אלה מבודדים תאים, כמויות משמעותיות של איכות גבוהה (RIN > 7) RNA חולצו. המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד סוגים שונים של תאים של מערכת העצבים, בשינוי מינימלי של שלהם פרופיל ביטוי גנטי לאבחן ולאפיין את מאפייני תא ופונקציות. לכן, פרוטוקול כולו מתבצע ב 4 ° C עם המגון רקמות המוח מכני. שיטה זו שימש בהצלחה במשך שני מחקרים שבוצעו במעבדה. במחקר הראשון, נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה הם בודדו אותנו מהמתרחש 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ הזחלים (איור 1). FACS מורשה למחקר מפני פסולת תפקודה של גודלם (FSC-A), צפיפות (האס-A) (איור 1א'). תאים בודדים הופרדו אז doublets או תא agglomerates (איור 1B). מן האוכלוסייה תא בודד, שער צוירה לסלק תאים מתים (דאפי+). העלילה נקודה המתאימה חשף כי פרוטוקול נסיוני זה שומר על תאי פלזמה הקרומיות, כמו הקצב של תאים מתים רק 26.7% (איור 1C). לבסוף, נוירונים (DsRed+) ו מקרופאגים/מיקרוגלייה (GFP+) היו בקלות הפרדה בין השערים אוכלוסיית תאים חיים. האוכלוסייה נוירון (23.1%) נראה בולט יותר מאשר באוכלוסיה מקרופאגים/מיקרוגלייה (1.56%) בתוך המוח (איור 1D). פרוטוקול זה אפשרה לבודד RNA של תאים אלה כדי לבצע ניתוח qPCR עוקבות. להשוות את הביטוי של גנים ספציפיים בין הנוירונים מקרופאגים/מיקרוגלייה. איור 2 מופעים עצביים, מקרופאגים/מיקרוגלייה ג'ין רמות הביטוי של מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (pcna)נגד הגן משק בית β-אקטין כדוגמה.
לצורך המחקר השני בשיטה זו התמקדו מיקרוגלייה בידוד מן המוח זחל dpf 3, 5, 7. בניגוד הניסוי המתואר לעיל, התאים היו מבודדים על ידי מכתים חיסונית באמצעות 4C 4, נוגדנים אשר במיוחד תוויות מיקרוגלייה (איור 3 A-D). כאמור תיאר, מיקרוגלייה (4C 4+) נבחרו מתוך תאים חיים ואסף (איור 3ד'). מיקרוגלייה בתוך המוח זחל דג זברה המספרים משתנה (טבלה 1), נמוך מאוד-dpf 3 (∼ 25 לכל דג). האיכות והכמות של RNA שחולצו מן תאים אלה נמדדו באמצעות מערכת אלקטרופורזה מיקרו-נים מבוסס. התוצאות המתקבלות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה 5 מוח של דג זברה זחל dpf סופקו להדגמת של RNA ניתוח (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). איור 4 מציג את האיתור אלקטרופורזה וייצוג גרפי שלו השיג עבור דוגמה זו עם פריט חזותי ברור של ribosomal RNA (28s ו- 18s). נתונים אלה יש צורך לחשב לדוגמה רין וכדי לקבוע ריכוז ה-RNA. טבלה 1 מסכמת מספר מיקרוגלייה מבודד לכל הכמות של RNA לכל מיקרוגלייה ודגים, התוצאה רין השיג עבור ניסוי שונות-dpf 3, 5, 7. הכמות והאיכות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה מבודדים באמצעות שיטה זו אפשר לנו להגביר את הרנ א לתוך cDNA באמצעות ערכת. בדיקות איכות וכמות שסופקו על-ידי אדינבורו גנומיקה לאשר cDNA מוגבר באיכות מספקת עבור ספריית הכנה ורצף עוקבות. איור 5 מציג את התפלגות גודל של קטעי cDNA והכמות שלהם נמדד באמצעות מערכת electrophoretic. במדגם זה, cDNA היה בגודל אכזרי של 299bp-ריכוז 36100 pmol/ל' בטבלה 2 מדגים בהתאמה בדיקות איכות וכמות ב cDNA מוגבר מדגימות RNA (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). CDNA מוגבר שימש בהצלחה עבור רצף.
מספר מחקרים שבוצעו במעבדה אישרו כי האיכות והכמות של RNA שחולצו מן הנוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה יכול לשמש qPCR הבאים וניתוחים ביטוי הגן רחב הגנום. לכן, פרוטוקול נסיוני זה ניתן לבודד אמינה סוגים שונים של תאי מערכת העצבים המרכזית ללא שינוי שלהם הקרומיות והגבלת שינוי של הפרופיל שלהם ביטוי גנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> איור 1 : FACS מיון נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה מן mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) Gating רצופים מציגה מבחר רציף של תאים כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה אותרו בהתאמה על ידי DsRed ו- GFP מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> איור 2 : הביטוי מפענוח pcna ו β-אקטין נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה. יכול להיות עיבד RNA נוירונים בודדים, מקרופאגים/מיקרוגלייה לתוך cDNA לשימוש בניתוח ה-PCR כמותי. mRNA רמות הביטוי של pcna נגד β-אקטין ג'ין משק בית מבודד נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה נקבעים על-ידי qPCR (N = 3). קיפול שינוי נמדדה באמצעות השיטה השוואתי (ΔΔCT). שגיאה בר לייצג זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> איור 3 : FACS מיון עבור מיקרוגלייה מ 3 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) תאים רצופים המגביל הצג רציפים מבחר כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) מיקרוגלייה זוהו על ידי 4C 4 מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> איור 4 : מיקרו-נים תוצאות אלקטרופורזה של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה דג זברה dpf 5. שתי הפסגות גבוה הן ribosomal RNA 18S, 28S. RNA תקינות מספר (RIN) היה מחושבים באופן אוטומטי על ידי תוכנת bioanalyzer באמצעות היחס שנוצר את 18S, 28S ribosomal subunits וניתוח של האיתור electrophoretic כולו. מיקרוגלייה RNA יש של 8.6 רין. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> איור 5 : בדיקות האיכות והכמות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה. התמונה מציגה cDNA פרגמנט גודל להתפלגות המדגם שנותחה בגודל אכזרי של 299 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>תנאי</td>
			<td>ניסוי</td>
			<td>מספר דגים</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד לכל דג</td>
			<td>ריכוז ה-RNA (pg/ul)</td>
			<td>סה כ RNA (עמוד)</td>
			<td>כמות ה-RNA בכל תא (עמוד)</td>
			<td>רין ניקוד</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092, שעות</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סיכום של בידוד מיקרוגלייה ו RNA חילוץ נתונים הזחלים דג זברה dpf 3, 5, 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מזהה דגימה פנימי</td>
			<td>זיהוי הדגימה חיצוני</td>
			<td>קיוביט (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>ריכוז ממוצע (ng/ul)</td>
			<td>נפח (ul)</td>
			<td>ug התקבל</td>
			<td>עובר או נכשל עבור ריכוז מינימלי</td>
			<td>עובר או נכשל עבור כמות minimim</td>
			<td>עובר או נכשל עבור הכמות המומלצת</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (ניסוי 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">דרישות לדוגמה עבור הספרייה במכינה:</td>
		</tr>
<tr>
<td>הספרייה במכינה</td>
			<td>כמות מינימלית (ng)</td>
			<td>הכמות המומלצת (ng)</td>
			<td>Ng ריכוז מינימלי/uL...</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ננו TruSeq ג'ל חינם 350 bp הוסף ספריית cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: כמות בדיקות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Edinburgh. אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptom...

Video: Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Developmental Biology

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Biology

עיבוד תאי מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

מחבר זרקור: בידוד וניתוח תאי מעיים של זחלי דגי זברה לחקר היבטים שעתוק של התפתחות מערכת העיכול 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

Summary

Explore More Videos

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

תרבות, תרביות תאים תאים ראשי דג זברה

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

מיקרו-הזרקות חדריות למוח של ליפופוליסכריד לדגי זברה זחליים להערכת דלקת עצבית ורעילות עצבית

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים