初期ヘルプと実験的アプローチと QMRI フローサイトメトリーと細胞選別設備に関する議論、博士クレア デイビスと博士ヴェロニク ミロン (女王の医療研究所、エジンバラ、ユナイテッド キングドーム) に感謝します。この作品は、博士ダーク シエガー癌研究英国のキャリア確立賞によって支えられました。

1. サンプルとメディアの準備
<ol><li>6.4 mM KCl、0.22 mM の NaCl、0.33 mM CaCl2 2 H2O、0.33 mM MgSO4 7 H2O H2o. を溶解することにより胚メディア (E3) の準備します。</li>
	<li>受精 (0 dpf) の直後にゼブラフィッシュ胚を収集します。<ol>
<li>90 mm シャーレあたり 50 にゼブラフィッシュの胚を分割します。開発 (0 dpf) 色素沈着を抑制する実験の期間の最初の日の終わりから胚胚中 (E3) 200 μ M 1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) で治療の 50 ml 28.5 ° c を上げます。</li>
		<li>変更、E3 + PTU 媒体毎日実験の持続期間のため。</li>
		<li>画面 mpeg1:eGFP と蛍光顕微鏡を用いた遺伝子発現の肯定的な GFP+マクロファージ/ミクログリアとした DsRed+ニューロン 2 dpf で NBT:DsRed 幼虫。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべてのメディアの汚染を避けるためにティッシュ文化フードの下で実験の前に一日を準備し、4 ° C で保存<ol>
<li>15 mM Hepes と 25 mM グルコース HBSS 1 を溶解することによりメディア A の準備 x。</li>
		<li>密度勾配 HBSS 10 の 1 ボリューム中の 9 つの容積を混合することによって密度勾配媒体 (100%) を準備 x。</li>
		<li>密度勾配媒体 (100%) の 22 mL DPBS 1 の 88 mL で希釈することによって密度勾配媒体 (22%) を準備 x。</li>
		<li>準備 DPBS 1 x。</li>
		<li>450 μ M と E3 媒体を混合して E3 媒体 + Tricaine を準備 Tricaine。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 均質化
注:すべての手順が実行される 4 ° C です。
<ol><li>200 μ M 末期それらを麻酔する PTU で治療 E3 胚中の 50 mL の 50 の幼虫を含む 90 mm シャーレに 1.5 mL Tricaine (15 mM) を追加します。<ol>
<li>3 ml のプラスチック製バルクのパスツール ピペット シャーレから 10 麻酔幼虫を吸います。</li>
		<li>伝達麻酔幼虫 55 mm のペトリ皿に 10 の 10 は、冷たい E3 胚中 + Tricaine でいっぱい。</li>
		<li>、顕微鏡下でペトリ皿の中心 10 幼虫に合わせます。その後、トランセクト卵黄嚢の外科マイクロはさみ (フローティング ヘッドを避けるために浮袋を除く) を使用して上記の幼虫の頭。</li>
		<li>3 ml のプラスチック製バルクのパスツール ピペット シャーレから頭を吸います。すべてのヘッド ピペット チップ内で収集し、1 mL 冷たいメディア A を含んでいるガラス ホモジナイザーに転送まで待つ (メディアを抑える最小限のボリュームで希釈して転送 E3 + Tricaine)。氷の上のガラスのホモジェナイザーを維持します。実験条件ごとの 1 つのホモジナイザーを使用します。</li>
		<li>氷が入っている各小さいペトリ皿を置き換える冷たい E3 + Tricaine 冷たい E3 + Tricaine で新しいものとその断裂を確保するために 30 分ごとを実行中。</li>
		<li>色が退色を起動時ガラス ホモジナイザの冷たいメディア A を取り付けます。 注:メディアの希釈は、温度変化による頭部の組織を変更できます。</li>
		<li>(600 頭/条件)、ガラスのホモジェナイザーからメディア A の最大ボリュームを削除し、1 ml の新鮮な冷たいメディア A の交換のすべてのヘッドが収集された後</li>
		<li>氷の上タイトなガラス ホモジナイザーを用いた脳組織を混乱させます。3-5 dpf 幼虫と 7 と 8 の dpf 幼虫 50 の 40 回のラウンドを粉砕し、回転を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞懸濁液にメディア A 2 mL を追加 (1 mL メディア A/200 頭)、それは細胞を希釈し、密度勾配媒体の遠心分離の間に彼らの分離を容易にするミエリンとその凝集を低減します。<ol>
<li>細胞の集積を避けるためには、氷の上を維持 50 mL の冷たいファイティングファルコン管の上に配置された 40 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液を実行します。この操作を 3 回繰り返します。</li>
		<li>冷たい 1.5 mL チューブに細胞懸濁液の 1 mL を移すし、4 ° c. で 10 分の 300 g でそれらをスピン</li>
		<li>10 mL のシリンジを使用して上清を除去 + 針 23 x 1」。</li>
	</ol>
</li>
	<li>優しく冷たい DPBS 1 の 0.5 mL でオーバーレイ冷たい 22% の密度勾配媒体の 1 mL の細胞ペレットを再停止 (は見られるそれらは、両方のソリューションの間中間期) x。<ol>
<li>スピンで 950 g ブレーキと 4 ° C で 30 分間低速加速なしチューブ 注:この手順は DPBS 1 の相間で貯留することで他のセルからの髄を分離 x と 22% 密度勾配媒体、細胞が管の底にペレットに対し。髄鞘の除去は、細胞濃度が高すぎるではない場合に効率的です。</li>
		<li>相間で 10 mL のシリンジ + 最大 DPBS、密度勾配媒体および髄鞘が閉じ込められた針 23 × 1 ' 破棄を使用します。</li>
		<li>メディア A 0.5 mL + ヤギ血清 (NGS) の 2% 血球を洗浄し、スピンで 4 ° C で 10 分間 300 g チューブ</li>
		<li>培養上清の最大値を破棄し、プールのメディア A + 2 %1 mL で一緒に同一の実験条件からすべての細胞ペレット NGS。</li>
	</ol>
</li>
	<li>興味のセル表現 mpeg1:eGFP からマクロファージ/ミクログリアのような蛍光蛋白質、または NBT:DsRed 遺伝子導入魚 (遺伝子導入魚を参照してください 1.1.3 のスクリーニング)、35 μ m 携帯こし器を通って細胞懸濁液を実行からニューロン キャップしにそれらを転送します。光から保護されている氷の上の冷たい 5 mL FACS 管。 注:また、ミクログリアの免疫染色を実行できます。</li>
</ol>3. ミクログリア免疫染色
注:4 ° C ですべての手順を実行します。
<ol><li>メディア + 2% の 0.3 ml 細胞ペレットを再停止 NGS。3 × 1.5 mL チューブにそれらを分割: 無染色細胞ミクログリアと第 3 テストの二次抗体の非特異的結合を測定する二次抗体 (1/200) の第二に興味のセルから自動蛍光を測定するための 1 つ (4 4 マウス モノクローナル抗体 (ミクログリア特定) (1/20) + 二次抗体 (1/200))。<ol>
<li>低エンドトキシン、アジ化無料 (リーフ) 細胞 (すべての管) に 1% で免疫グロブリンの Fc ドメイン CD16/CD32 相互作用をブロックするを追加します。穏やかな攪拌 5 分ごとに 10 分のセルを孵化させなさい。</li>
		<li>4 4 を追加抗体 (1/20) (管 3) のセルに 10 分毎穏やかな撹拌で 30 分間インキュベートし、。</li>
		<li>4 ° C で 10 分の 300 g でチューブをスピンし、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>メディア A + 2 %0.5 mL と NGS、それからスピン チューブ 4 ° c. で 10 分の 300 g で一度洗う</li>
		<li>メディア + 2% の 0.5 ml の細胞ペレットの再停止 NGS と穏やかな攪拌 5 分ごとに 10 分間の 1% で葉の細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>二次抗体 (1/200) を (2 と 3 の管) のセルに追加します。すべての 10 分と軽い保護は、穏やかな攪拌と 30 分のための細胞を孵化させなさい。</li>
		<li>4 ° C で 10 分の 300 g でチューブをスピンし、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>メディア + 2 %1 mL でメディア A + 2 %ngs、細胞ペレットの再停止の 0.5 mL で 2 回洗浄 NGS。</li>
	</ol>
</li>
	<li>35 μ m の細胞のストレーナー キャップを介して細胞懸濁液を実行し、氷、光から保護に冷たい 5 mL FACS の管にそれらを転送します。</li>
</ol>4. セル (FACS) を並べ替え
注:4 ° C ですべての手順を実行します
<ol><li>神経細胞、マクロファージ/ミクログリアおよび、FACS を用いたミクログリアを並べ替えます。 注:この手順は通常 FACS 施設のスタッフ メンバーが実行し、使用機器の種類に依存する設定。<ol>
<li>死んだ細胞をラベルする各 FACS 管で 1 μ G/ml の濃度の DAPI を追加します。</li>
		<li>すべての脳細胞の FACS と並べ替えの神経細胞、マクロファージ/ミクログリアやミクログリアを設定します。破片のサイズと細かさで、関数の中から細胞を分離し、前方散乱、側方散乱による単一細胞のゲートします。DAPI は生きた細胞からラベリングによって死んだ細胞を除外します。彼らのそれぞれ肯定的な染色による神経細胞やマクロファージ/ミクログリア ミクログリアを識別します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>冷たいメディア + 2 %1 mL を含む 1.5 mL チューブに細胞を収集 NGS 氷の上。セル タイプごとに別のチューブを使用します。<ol>
<li>スピンで 4 ° C で 10 分間 300 g チューブと、上澄みを廃棄します。</li>
		<li>メディアの 0.5 mL とし、破棄上清の最大一度洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA の抽出
<ol><li>FACS で区切られた異なった細胞のタイプから RNA を抽出します。RNA の抽出特定のキットを使用し、製造元のガイドラインに従ってください。クリーニング ワークスペースと RNase 除染製品、ピペットによる RNase フリー環境で動作して、フィルターのヒントを確認します。<ol>
<li>たて 50 μ M β-メルカプトエタノールを添加した換散バッファーの 1 つの mL を準備します。 注:ここでは、RNA の劣化を抑える β-メルカプトエタノールが追加されます。</li>
		<li>無料水 RNase を使用して 70% と 80% のエタノール溶液を準備します。</li>
		<li>50 μ M β-メルカプトエタノールを添加した換散バッファーの 75 μ L で細胞を溶解させます。セル中断を改善するためにシュレッダーを使用しています。</li>
		<li>取扱説明書メーカーによると RNA の抽出を続行します。</li>
		<li>プロトコルの最後で、RNA 濃度が十分な RNase 自由水の 14 μ L の RNA を溶出します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirement+for+irf8+in+Formation+of+Embryonic+and+Adult+Macrophages+in+Zebrafish.">Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).</li><li>Mazaheri, F., Breus, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia.">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nature Communications. 5, 1-11 (2014).</li><li>Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+and+acute+neurodegeneration-specific+microglial+transcriptome+in+the+zebrafish.">Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish.</a> Glia. 65 (1), 138-149 (2016).</li><li>Hamilton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zebrafish+Live+Imaging+Model+Reveals+Differential+Responses+of+Microglia+Toward+Glioblastoma+Cells+In+Vivo.">A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo.</a> Zebrafish. , (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Peri, F., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Neuronal+Degradation+by+Microglia+Reveals+a+Role+for+v0-ATPase+a1+in+Phagosomal+Fusion+In+Vivo.">Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+descending+axons+preferentially+reroute+to+the+gray+matter+in+the+presence+of+a+general+macrophage/microglial+reaction+caudal+to+a+spinal+transection+in+adult+zebrafish.">Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).</li><li>Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptomic+landscape+of+the+developing+enteric+nervous+system+and+its+cellular+environment.">Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment.</a> BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li><li>Khuansuwan, S., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+during+development+of+the+zebrafish+pineal+complex+using+RNA+sequencing.">Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing.</a> Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).</li><li>Schmid, C. D., Melchior, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+LPS/IFN&#947;+activated+microglia+and+macrophages:+in+vitroversus+in+vivo.">Differential gene expression in LPS/IFN&#947; activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-+Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Khan, A., Ju, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+reveals+differential+activation+of+microglial+genes+after+ischemic+stroke+in+mice.">Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice.</a> Neuroscience. 348, 212-227 (2017).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで記述されている実験のプロトコルは、3 から 8 dpf にゼブラフィッシュ幼虫から脳細胞を分離する堅牢で効率的なメソッドを表します。重要なは、ゼブラフィッシュ稚魚の脳のミクログリアの特定の分離を可能にする最初のプロトコルです。プロトコルは、細胞膜の完全性を維持するために、処理中に発生する遺伝子発現の潜在的な変更を最小限に抑えるために設計されています。この最後の点は、これらの孤立した細胞ゲノムのプロファイルの解析に基づく結果の関連性にとって重要です。確かに、小グリア細胞およびマクロファージの偏光は、その微小環境に左右され。37 ° C でこれらの細胞が実験条件 (損傷 (断裂) の応答) への応答での遺伝子発現プロファイルを変わっていたでしょう。したがって、RNA の抽出、細胞プロセスと代謝活動を遅く前に 4 ° C でこの実験を実行することが重要だった。さらに、4 ° C で機械的脳組織の均質化は、37 ° C で酵素のティッシュの消化ではなく遺伝子発現への影響を避けるために選ばれました。
このメソッドは非常に簡単です。 強調表示することが重要です。日内でいくつかの脳細胞集団は、少なくとも 2 つの異なる実験条件から抽出した RNA の分離できます。プロトコルの長さの合計は、幼虫の頭の断裂が制限ステップ (∼ 350 頭/h) 条件ごとに使用される幼虫の個体数に依存します。一般に、3 からミクログリアを使用する 5 と 7 の dpf は勧めトランセクト ∼ 600 頭 (表 1) を抽出するのに十分な RNA を取得するテストごとにします。ミクログリア細胞型を表す最も低い収量 (7 dpf で一人当たり約 112 細胞)、マクロファージ (7 dpf で一人当たり約 170 細胞) を含む他の細胞型のヘッドの数を減らすことが。
このプロトコルの別の利点は、FACS 選別機の設定が確立されるは、異なる実験の同じ設定を使用できます。その細胞集団に完璧にフィット 1 つの実験から別以前に設計された、ゲートでこのメソッドを使用して実験の再現性を示すことが観察されています。
このメソッドの欠点はわずかは、収穫された RNA の比較的低いです。ただし、この制限は、脳開発 (表 1) の初期段階でミクログリア数が非常に少ない技術的な問題よりもより多くの生物学的問題です。収集された RNA のこの少量のため増幅手順はゲノム広い遺伝子発現解析に考慮する必要が.幸いなことに、増幅手順は高品質 cDNA の十分な量を生成します。したがって、単離細胞の遺伝子発現プロファイルのグローバルな変化を学ぶことができます。
結論としては、このプロトコルは、分離し、各種ゼブラフィッシュ稚魚の脳から中枢神経系細胞を研究する手法を提供します。これは、についてその疾患における役割を研究開発中にこれらの細胞のより深い理解を得るために適用できます。

脳の発達と脳の病気に関する知識は、マウス脳トランスクリプトーム1の最初の定量化から過去 10 年間で大幅に改善します。確かに、ゲノム広い遺伝子発現解析私たちは、脳組織と細胞を補完でき、他の手法やツールを使った観測を向上させる詳細な遺伝情報。
ゼブラフィッシュは強力な生物学的モデルで、簡単に繁殖と遺伝的に変更するのには幼虫の段階で、光の透過性は、ライブ イメージング観測2をことができます。残念ながら、比較する人間、マウス、入手可能な抗体免疫染色を実行する数はかなり低い。この問題を解決するには、トランスジェニックゼブラフィッシュ魚行は簡単に携帯型特定プロモーターの下で蛍光蛋白質を表現する魚に遺伝子改変によって行われます。トランスジェニックゼブラフィッシュ ラインは、中枢神経系 (CNS) の開発と疾患3,4,5,6時にマクロファージやミクログリアの役割を研究する過去に使用されています。しかし、これらのプロセスの詳細な理解を得るためには、各種細胞の遺伝子発現の変化を理解する必要があります。この目的に特にのように神経細胞、マクロファージ、3 から 8 日にミクログリア細胞を分離する実験手法を開発した後受精 (dpf) ゼブラフィッシュ稚魚脳。プロトコルの確立のため我々 は神経 β-チューブリンの下で神経細胞のマクロファージ表現遺伝子プロモーター (mpeg1:eGFP) と下流の下マクロファージ/ミクログリアで緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表す遺伝子導入魚ラインで働いてください。プロモーター (NBT:DsRed)7,8,9。さらに、ミクログリア 4 4、特に汚れのゼブラフィッシュ ミクログリア10,11マウスのモノクローナル抗体を用いた免疫染色を行った.その後、リボ核酸 (RNA) はさらに量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) またはトランスクリプトーム解析のためのこれらの細胞から抽出されます。このプロトコルは効率的にゼブラフィッシュ幼虫; から脳組織を均一に設計されています神経細胞、マクロファージ/ミクログリアとミクログリア細胞膜完全性の変化なしを収集し、最終的に高品質のこれらの細胞から RNA を抽出 (凛 > 7) とゲノム解析を実行する数量。脳組織12,13を消化する 37 ° C でトリプシン処理を使用して、以前に発行された研究とは異なりは、このプロトコルは、遺伝子発現プロファイルの変更を抑える RNA 抽出工程まで 4 ° c の作業を推進しています。このステップがミクログリアとして重要とマクロファージが非常に敏感な細胞の遺伝子発現プロファイルと偏波14,15,を変えることによってすぐに彼らの微小環境の変化に対応します。16。
詳しくは、ここで説明したプロトコル神経細胞、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ仔の脳が、事実上、それからの分離は、他のセルに合わせることができるショー脳内 - トランスジェニック魚行を使用して、いずれかを提示または付けられて特定の抗体。このメソッドは、中枢神経系細胞のゲノム広い遺伝子発現解析を通してのより良い特性を許可し、発展と脳の病気の中に自分の役割を理解するのに役立ちます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">P7629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Hepes</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine (MS222)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 90mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">101VIRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Surgical micro-scissors</td>
			<td style="width:319px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td>
			<td style="width:319px;">SLS</td>
			<td style="width:103px;">PIP4206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glass homogenizer</td>
			<td style="width:319px;">Wheaton</td>
			<td style="width:103px;">357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 55mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">P55V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">50 ml polypropylen conical tube</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:319px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:103px;">5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Needle 23G x 1&#39;&#39;</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:319px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:103px;">5425S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">35 &#956;m cell strainer cap</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td>
			<td style="width:319px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">101321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-4C4</td>
			<td colspan="2">Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS sorter FACSAria II</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td colspan="2">QMRI, FACS facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">&#160;31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">QIAshredder</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:319px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:103px;">1725271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:319px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">18080-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">LightCycler 96 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td style="width:319px;">Roche</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td style="width:319px;">NuGEN</td>
			<td style="width:103px;">7102-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Agilent RNA 6000 Pico reagents</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;">5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:319px;">Ambion</td>
			<td style="width:103px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

開発または設立時に別の中枢神経系の細胞の役割の解明と脳の病態の進行を得るためには、彼らの遺伝子発現プロファイルを変更することがなくこれらのセルを隔離することが重要です。ゼブラフィッシュ モデル提供多数の遺伝子導入魚ラインに特定の細胞型が分類される;たとえば NBT:DsRed ラインや mpeg1:eGFP ラインにおけるマクロファージ/ミクログリアのニューロン。さらに、抗体は、4 4 ミクログリアなどの特定の細胞を染色する開発されている抗体です。
ここでは、神経細胞、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳からの分離について述べる。このプロトコルの中心は、37 ° c では、携帯電話のプロファイルを変更可能性があります組織の酵素消化の回避です。代わりに 4 ° C で組織の均質化の機械システムが使用されます。このプロトコルは、脳の細胞懸濁液に均質化、彼らの免疫染色と細胞、マクロファージ、FACS によるミクログリアの分離を伴います。その後、それらの細胞から RNA を抽出し、その質・量を評価しました。高品質の RNA を取得管理して (RNA 整合性数 (鈴) > 7) ミクログリアのマクロファージ/ミクログリアとニューロン ・ トランスクリプトーム解析の qPCR を実行します。このアプローチにより、開発と病態におけるその役割についての明確な理解と同様、これらの細胞のより良い評価です。

記述されていたプロトコルは、神経細胞、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ仔脳から分離する簡単な方法です。これらから大量高品質のセルを分離 (凛 > 7) RNA を抽出しました。このプロトコルの目的は、さまざまな種類の細胞から中枢神経系、変更は最小限での彼らの遺伝子発現プロファイルを分析し、細胞の性質と機能を特徴付けるを分離することです。したがって、プロトコル全体が機械的脳組織の均質化と 4 ° C で実行されます。このメソッドは、正常に研究室で実行される 2 つの研究のために使用されています。最初の研究では、神経細胞とマクロファージ/ミクログリアは 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+幼虫 (図 1) から分離されました。FACS のサイズの関数で残骸からの細胞分離を許可 (FSC A) と粒度 (SSC-A) (図 1A)。単一のセルは、ダブレットまたは細胞塊 (図 1B) から、分かれていた。単一のセルの人口から (DAPI+) の死んだ細胞を除去するためにゲートを描いた。対応するドット プロットでは、死んだ細胞の率は 26.7% (図 1C) としてこの実験的プロトコルが細胞膜の完全性を維持すること明らかにしました。最後に、ニューロン (+した DsRed) とマクロファージ/ミクログリア (GFP+) 簡単に生きているセル人口のゲートから隔離されました。ニューロン集団 (23.1%) は、脳 (図 1D) 内のマクロファージ/ミクログリア人口 (1.56%) よりもより顕著なように見えた。このプロトコルは、その後 qPCR 神経細胞とマクロファージ/ミクログリアの間特定の遺伝子発現を比較する解析を実行するそれらの細胞からの RNA を隔離するできました。図 2ショー神経細胞やマクロファージ/ミクログリア遺伝子発現例としてβ-アクチン-ハウスキーピング遺伝子に対する増殖細胞核抗原 (pcna)の。
2 番目の研究のためこのメソッドはミクログリア 3、5、7 の dpf 幼虫の脳から分離に焦点を当てた。免疫染色で隔離されたセル、上記実験と対照をなして 4 4、特にミクログリア (図 3 A ~ D) と分類する抗体を使用しています。前述したように、ミクログリア (4 4+) 生きているセルから選ばれ、(図 3D) を収集します。ゼブラフィッシュ仔脳のミクログリア番号が変数 (表 1) と 3 dpf (∼ 25 魚あたり) で非常に低い。それらの細胞から抽出した RNA の量と質は、基づくマイクロ キャピラリー電気泳動システムを使用して測定しました。5 dpf ゼブラフィッシュ稚魚脳のミクログリアから抽出した RNA の得られた結果は、RNA 分析 (表 1 (5 dpf; 実験 4)) の例を説明するために提供されています。図 4は、電気泳動トレースとリボソーム RNA (28 秒・ 18 秒) を明確に可視化でこのサンプルの得られたそのグラフィック表現を示します。このデータは、凛のサンプルを計算して RNA 濃度を決定するため必要です。表 1は、魚、ミクログリアの RNA の量、3、5、7 の dpf でそれぞれ異なる実験のため得られた鈴スコアごと分離ミクログリアの数をまとめたものです。このメソッドを使用して分離のミクログリアから抽出した RNA の品質と量キットを使用して cDNA に RNA を増幅することができました。エジンバラ ゲノミクスによって提供される質と量のテストは、増幅 cDNA ライブラリの準備および後続のシーケンスのための十分な品質のであることを確認します。図 5は、cDNA 断片の電気泳動システムを使用して測定量のサイズ分布を示しています。このサンプルでは cDNA 36100 の濃度の 299bp の平均サイズがあった pmol/l.テーブル 2はそれぞれ (表 1 (5 dpf; 実験 4)) の RNA のサンプルからの増幅された cDNA は、質と量のテストを示しています。増幅 cDNA は、シーケンスの正常に使用されています。
研究室で実行されるいくつかの研究は、神経細胞、マクロファージやミクログリアから抽出した RNA の量と質を後続の qPCR のゲノム広い遺伝子発現解析使用できることを確認しました。したがって、この実験的なプロトコルは、膜の完全性の変更とその遺伝子発現プロファイルの変更を制限することがなく中枢神経系細胞の種類を確実に分離する使用できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> 図 1: 8 dpf ゼブラフィッシュ幼虫神経細胞とマクロファージ/ミクログリア mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+からの並べ替え FACS 。(A ~ C)前方散乱、側による単一細胞が散布図 (B)、連続ゲーティングすべて脳からの細胞 (A) 連続しない選択を示しています。(C) 死んだ細胞は、DAPI ラベリングによって除外されました。(D) 神経細胞とマクロファージ/ミクログリアは、下流と GFP 陽性によってそれぞれ識別されました。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> 図 2: Pcnaと神経細胞とマクロファージ/ミクログリアにおけるβ-アクチン遺伝子発現解析します。分離ニューロンとマクロファージ/ミクログリアからの RNA は、定量的 PCR 解析で使用するための cDNA に転写できます。β-アクチンの家は維持遺伝子分離神経細胞とマクロファージ/ミクログリア qPCR による決定に対するpcnaの mRNA 発現レベル (N = 3)。フォールドの変更を比較 (ΔΔCT) メソッドを使用して測定しました。誤差範囲を表す平均 ± SEM.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> 図 3: 3 dpf ゼブラフィッシュ幼虫からミクログリアの並べ替え FACS 。(A ~ C)連続ゲーティングを逐次すべて脳の細胞 (A)、前方散乱、側による単一細胞が散布図 (B)。(C) 死んだ細胞は、DAPI ラベリングによって除外されました。(D) ミクログリアが 4 4 によって識別された陽性。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> 図 4: 5 dpf ゼブラフィッシュ ミクログリアから抽出した RNA のマイクロ キャピラリー電気泳動結果。2 つの背の高いピークは、18 s、28 s リボソーム RNA です。RNA の整合性の数 (鈴) だった全体の電気泳動のトレースの分析と 18 秒と 28 秒の ribosomal 亜単位の生成比率を用いてバイオアナライザー ソフトウェアによって自動的に計算されます。ミクログリアの RNA が鈴 8.6 です。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> 図 5: 5 dpf ゼブラフィッシュ ミクログリアの RNA のサンプルからの増幅された cDNA の質と量のテスト。平均サイズが 299 の分析サンプルの cDNA フラグメント サイズの分布の図は跪く<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>条件</td>
			<td>実験</td>
			<td>魚の数</td>
			<td>セル数</td>
			<td>魚あたりのセル数</td>
			<td>RNA 濃度 (pg/ul)</td>
			<td>総 RNA (pg)</td>
			<td>1 つのセル (pg) RNA 量</td>
			<td>凛のスコア</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: ミクログリア分離と 3、5、7 の dpf ゼブラフィッシュ幼虫からの RNA 抽出データの概要。
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>サンプルの内部 ID</td>
			<td>外部サンプル ID</td>
			<td>量子ビット (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>平均濃度 (ng/ul)</td>
			<td>ボリューム (ul)</td>
			<td>受信した ug</td>
			<td>最小濃度の合否を判定</td>
			<td>最小量の合否を判定</td>
			<td>推奨量の合否を判定</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (実験 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>渡す</td>
			<td>渡す</td>
			<td>渡す</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">サンプル ライブラリの準備のための要件:</td>
		</tr>
<tr>
<td>ライブラリの準備</td>
			<td>最小量 (ng)</td>
			<td>推奨量 (ng)</td>
			<td>最小濃度 ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq ナノ ゲル cDNA から無料 350 bp 挿入ライブラリ</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:5 の dpf ゼブラフィッシュ ミクログリアの RNA のサンプルからの増幅された cDNA の数量をテストします。

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA のコレクションをできます。

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K ビュー.  University of Edinburgh. ニューロン、マクロファージやミクログリア ゼブラフィッシュ稚魚の脳生理学的および病理学的条件の下でからを分離するためのプロトコルを提案します。分離時にこれらの細胞の遺伝子発現プロファイルを分析するから RNA を抽出します。このプロトコルは、qPCR とトランスクリプトミクスのような下流の分析を実行するため高品質の RNA のコレクショ?...

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Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

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神経科学

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

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Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

胚性齧歯類の脳から単離、プライマリ脳ドーパミンニューロンの文化と長期メンテナンス

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

パーキンソン脳からの可溶性および不溶性のα-シヌクレインの逐次抽出

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

の除去<em&gt;ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から&gt;筋肉組織

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

ドーサルルート神経節マクロファージの迅速な分離

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...