Wir danken Dr. Claire Davis und Dr. Veronique Miron (The Queen es Medical Research Institute, Edinburgh, Vereinigtes Königreich) für erste Hilfe und Diskussionen über die experimentellen Ansatz und die QMRI Flow Cytometry Zelle Sortieren Anlage. Diese Arbeit wurde durch einen Krebs UK Karriere Einrichtung Forschungspreis für Dr. Dirk Sieger unterstützt.

1. Probe und Medien-Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie Embryo Medium (E3) durch Auflösen von 6,4 mM KCl, 0,22 mM NaCl, 0,33 mM CaCl2 2 H2O, 0,33 mM MgSO4 7 H2O in H2O.</li>
	<li>Sammeln Sie Zebrafish Embryos sofort nach der Befruchtung (0 Dpf).<ol>
<li>50 pro 90 mm Petrischale Zebrafisch-Embryonen aufgeteilt. Heben Sie Embryonen bei 28,5 ° C in 50 mL Embryo Medium (E3) behandelt mit 200 µM 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), vom Ende des ersten Tages der Entwicklung (0 Dpf) für die Dauer des Experiments Pigmentierung zu hemmen.</li>
		<li>Änderung der E3 + PTU Medium täglich für die Dauer des Experiments.</li>
		<li>-Mpeg1:eGFP und NBT:DsRed Larven bei 2 Dpf mit fluoreszierendem Stereomikroskop für positive Transgene Ausdruck, GFP+ Makrophagen/Mikroglia und DsRed+ Neuronen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie alle Medien der Tag vor dem Experiment unter einer Gewebekultur Haube zur Vermeidung von Kontaminationen, dann bei 4 ° c Lagern<ol>
<li>Bereiten Sie Medien A durch Auflösen von 15 mM Hepes und 25 mM D-Glucose in HBSS 1 X.</li>
		<li>Bereiten Sie Dichte Gradienten Medium (100 %) durch Mischen 9 Bände der gradient mittlerer Dichte 1 Volumen von HBSS 10 X.</li>
		<li>Bereiten Sie das Dichte Gradienten Medium (22 %) durch Verdünnung 22 mL Dichte Gradienten Medium (100 %) in 88 mL des DPBS 1 X.</li>
		<li>Bereiten Sie DPBS 1 X.</li>
		<li>Bereiten Sie E3 Medium + Tricaine durch Mischen E3 Medium mit 450 μM Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Homogenisierung
Hinweis: Alle Schritte sind durchgeführten 4 ° C.
<ol><li>90 mm Petrischalen mit 50 Larven in 50 mL E3 Embryo Medium behandelt mit 200 µM PTU um unheilbar betäuben fügen Sie 1,5 mL Tricaine (15 mM hinzu).<ol>
<li>10 narkotisierten Larven von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen.</li>
		<li>Transfer betäubt Larven 10 mal 10 in eine 55-mm-Petrischale gefüllt mit eiskalten E3 Embryo Medium + Tricaine.</li>
		<li>Richten Sie unter einem Stereomikroskop 10 Larven in der Mitte der Petrischale. Dann Transekt Larven Kopf über dem Dottersack mit chirurgischen Mikro-Schere (Schwimmblase zur Vermeidung von schwebenden Köpfe ausschließen).</li>
		<li>Köpfe von Petrischalen mit einer 3 mL Pasteurpipette Kunststoff Masse aufzusaugen. Warten Sie, bis alle Köpfe innerhalb der Pipettenspitze sammeln und dann in ein Glas-Homogenisator mit 1 mL eiskaltes Media A übertragen (transfer in einem minimalen Volumen, Medien zu reduzieren eine Verdünnung mit E3 + Tricaine). Halten Sie das Glas-Homogenisator auf Eis. Verwenden Sie ein Homogenisator pro versuchsbedingung.</li>
		<li>Ersetzen Sie jede kleine Petrischale mit Eis kalt E3 + Tricaine mit einer neuen erfolgt alle 30 min. zu versichern, dass Durchtrennung im kalten E3 + Tricaine Medium.</li>
		<li>Ersetzen Sie das eiskalte Media A in der Glas-Homogenisator, wenn die Farbe verblassen beginnt. Hinweis: Medien A Verdünnung kann der Kopf Gewebe aufgrund von Temperaturänderungen verändern.</li>
		<li>Sobald alle Köpfe gesammelt wurden (600 Köpfe/Zustand), die maximale Lautstärke von Medien A aus der Glas-Homogenisator entfernen und ersetzen es mit 1 mL frische eiskalte Medien A.</li>
		<li>Stören Sie das Hirngewebe mit einem engen Glas-Homogenisator auf Eis. Führen Sie 40 runden Zerkleinern und Wendungen für 3-5 Dpf Larven und 50 für 7 und 8 Dpf Larven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hinzufügen von Medien A 2 mL Zellsuspension (1 mL Media A / 200 Köpfe), das Verdünnen Zellen und verringern ihre Agglomeration mit Myelin um ihre Trennung während der Zentrifugation in Dichte-Gradienten-Medium zu erleichtern.<ol>
<li>Zelle Agglomeration zu beseitigen, führen Sie die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb oben auf einer kalten 50 mL Falcon-Röhrchen gepflegt auf Eis gelegt. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-Mal.</li>
		<li>1 mL Zellsuspension in kalten 1,5 mL Röhrchen zu übertragen und mit 300 g für 10 min bei 4 ° c drehen</li>
		<li>Überstand mit einer 10 mL Spritze entfernen + Nadel 23 x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 1 mL eiskaltes 22 % Dichte Gradienten Medium sanft überlagert von 0,5 mL eiskaltes DPBS 1 x (Do nicht mischen sie eine Interphase zwischen beiden Lösungen zu sehen sein).<ol>
<li>Spin-Rohre bei 950 g ohne Bremse und langsame Beschleunigung für 30 min bei 4 ° C. Hinweis: Dieser Schritt trennt Myelin aus anderen Zellen durch Sequestrierung es in der Interphase des DPBS 1 X und 22 % Dichte Gradienten Medium, während Zellen an der Unterseite des Rohres pellet werden. Myelin-Entfernung ist effizienter, wenn Zellkonzentration nicht zu hoch ist.</li>
		<li>Verwenden einen 10-mL-Spritze + Nadel 23 x 1'' verwerfen das Maximum des DPBS, Dichte-Gradienten-Medium und Myelin gefangen in der Interphase.</li>
		<li>Waschen Sie Zellen mit 0,5 mL der Medien A + 2 % vom normalem ziegenserum (NGS), dann Spinnen Sie Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Das Maximum des Überstands zu verwerfen, dann bündeln alle Zelle Pellets aus der gleichen versuchsbedingung zusammen in 1 mL des Medien-A + 2 % NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Zellen von Interesse zum Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins wie Makrophagen/Mikroglia aus Mpeg1:eGFP bringen oder Neuronen aus NBT:DsRed transgene Fische (Screening von transgenen Fischen siehe 1.1.3), laufen die Zellsuspension durch ein Sieb 35 µm Zelle Kappe und übertragen Sie sie in eine kalt 5 mL FACS Röhren auf dem Eis, vor Licht geschützt werden. Hinweis: Alternativ kann die Immuno-Färbung der Mikroglia durchgeführt.</li>
</ol>(3) Microglia Immuno-Färbung
Hinweis: Alle Schritte sind bei 4 ° c durchgeführt.
<ol><li>Wieder aussetzen der Zelle Pellet mit 0,3 mL Media A + 2 % NGS. In 3 x 1,5 mL Röhrchen aufgeteilt: eine für ungefärbten Zellen, Auto-Fluoreszenz aus Zellen von Interesse, zum anderen für den sekundären Antikörper (1/200), die unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers Mikroglia und drittens als Test Messen Messen (4 4 Maus monoklonalen Antikörper (Mikroglia spezifische) (1/20) + Sekundärantikörper (1/200)).<ol>
<li>Fügen Sie Low Endotoxin, azid-Free (Blatt) bei 1 % auf Zellen (alle Röhren), CD16/CD32 Interaktionen mit der Fc-Domäne von Immunglobulinen zu blockieren. Inkubieren Sie Zellen für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min.</li>
		<li>Fügen Sie 4 4 Antikörper (1/20), Zellen (Röhre 3) und inkubieren Sie für 30 min unter schonenden rühren alle 10 Minuten.</li>
		<li>Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann den überstand verwerfen.</li>
		<li>Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien A + 2 % NGS, drehen dann Rohre bei 300 g für 10 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 0,5 ml Media A + 2 % NGS und Zellen mit Blatt bei 1 % für 10 min mit sanften Agitation alle 5 min inkubieren.</li>
		<li>Zellen (Rohr 2 und 3) sekundäre Antikörper (1/200) hinzufügen. Inkubieren Sie Zellen für 30 min mit sanften Agitation, alle 10 min und Lichtschutz.</li>
		<li>Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen, dann überstand verwerfen.</li>
		<li>Waschen zweimal mit 0,5 mL Media A + 2 % NGS, dann wieder auszusetzen Zelle Pellet mit 1 mL Media A + 2 % NGS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ein 35 µm Sieb Zellenabdeckung durchziehen Sie Zellsuspension und übertragen Sie diese in kalten 5 mL FACS Röhren auf Eis, vor Licht geschützt.</li>
</ol>(4) Zelle Sortieren (FACS)
Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei 4 ° C.
<ol><li>Sortieren Sie Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia mit einem FACS. Hinweis: Dieser Schritt erfolgt in der Regel von einem Mitarbeiter der FACS Facility und Einstellungen hängen von der Art der Ausrüstung verwendet.<ol>
<li>Fügen Sie DAPI in einer Konzentration von 1 µg/mL in jedem FACS-Röhrchen, abgestorbene Zellen zu kennzeichnen.</li>
		<li>FACS und Art Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia aus alle Gehirnzellen einrichten. Getrennte Zellen von Schutt in Abhängigkeit von ihrer Größe und Granularität, dann Tor Einzel-Zellen durch forward Scatter und Side Scatter. Schließen Sie aus, indem Sie DAPI Kennzeichnung von lebenden Zellen abgestorbene Zellen. Neuronen, Makrophagen/Mikroglia oder Mikroglia durch ihre jeweiligen positive Färbung zu identifizieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sammeln Sie Zellen in 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL eiskaltes Media A + 2 % NGS auf Eis. Verwenden Sie verschiedene Schläuche für jeden Zelltyp.<ol>
<li>Röhren bei 300 g für 10 min bei 4 ° C drehen und dann verwerfen des Überstands.</li>
		<li>Waschen Sie einmal mit 0,5 mL der Medien eine dann verwerfen die maximale überstand.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) RNA-Extraktion
<ol><li>Die verschiedenen Zelltypen getrennt durch FACS extrahieren Sie RNA. Verwenden Sie für die RNA-Extraktion eine besondere-Installationssatz und befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers. Sicherstellen Sie, dass in einer RNase frei Umgebung durch Reinigung Arbeitsbereich und Pipetten mit einem RNase Dekontamination Produkt arbeiten und Filtertips verwenden.<ol>
<li>Frisch bereiten Sie 1 mL Lyse-Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt zu. Hinweis: Hier wird β-Mercaptoethanol hinzugefügt, um RNA-Abbau zu reduzieren.</li>
		<li>Bereiten Sie 70 % und 80 % Ethanol-Lösung mit RNase freies Wasser.</li>
		<li>Lösen Sie Zellen mit 75 µL Lyse Puffer mit 50 µM β-Mercaptoethanol ergänzt. Verwenden Sie dann einen Schredder Zellaufschluss zu verbessern.</li>
		<li>RNA-Extraktion laut Hersteller der Bedienungsanleitung weiter.</li>
		<li>Am Ende des Protokolls eluieren der RNS mit 14 µL RNase freies Wasser um eine ausreichende RNA-Konzentration zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das hier beschriebene experimentelle Protokoll stellt eine robuste und effiziente Methode, Gehirnzellen von zebrafischlarven von 3 bis 8 Dpf zu isolieren. Wichtig ist, ist dies das erste Protokoll, das die spezielle Isolierung der Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn ermöglicht. Das Protokoll dient dazu, Zellmembran Integrität zu bewahren und um mögliche Änderungen der Genexpression, die während der Verarbeitungsprozess zu minimieren. Dieser letzte Punkt ist entscheidend für die Relevanz der Ergebnisse anhand der Analyse dieser isolierten zelluläre Genom Profile. In der Tat, Mikroglia und Makrophagen Polarisation sind stark von ihrer Mikroumgebung. Bei 37 ° C würde diese Zellen ihre Genexpressionsprofil in Reaktion auf experimentellen Bedingungen (Verletzungen (Durchtrennung) Antwort) geändert. Daher war es entscheidend, dieses Experiment bei 4 ° C vor RNA-Extraktion, zu verlangsamen, zelluläre Prozesse und metabolischen Tätigkeiten durchführen. Darüber hinaus wurde die mechanischen Gehirns Gewebe Homogenisierung bei 4 ° C anstelle von enzymatischen Gewebe Verdauung bei 37 ° C gewählt, um Auswirkungen auf Gen expressionsprofile zu vermeiden.
Es ist wichtig, hervorzuheben, dass diese Methode sehr schnell; innerhalb eines Tages können mehrere Gehirn-Zell-Populationen isoliert aus mindestens zwei verschiedenen experimentellen Bedingungen und ihre RNA extrahiert werden. Die Gesamtlänge des Protokolls hängt von der Anzahl der Larven für jede Bedingung verwendet, da die Durchtrennung der Larven Köpfe der limitierende Schritt (∼ 350 Köpfe/h) ist. Im Allgemeinen ist die Arbeit mit Mikroglia von 3 5 und 7 Dpf empfohlen Transekt ∼ 600 Köpfe pro Test zu genügend RNA extrahieren (Tabelle 1). Wie Mikroglia repräsentieren die Zelltyp mit dem geringsten Ertrag (ca. 112 Zellen pro Kopf bei 7 Dpf), die Anzahl der Köpfe für andere Zelltypen, einschließlich Makrophagen (ca. 170 Zellen pro Kopf bei 7 Dpf) reduziert werden kann.
Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass sobald Einstellungen auf dem FACS-Sorter festgelegt wurden, die gleichen Einstellungen für verschiedene Experimente verwendet werden können. Es wurde beobachtet, dass Zell-Populationen von einem Experiment zum anderen mit Toren bereits entworfen, perfekt zeigt die Reproduzierbarkeit der Experimente mit dieser Methode.
Ein kleinen Nachteil dieser Methode ist die relativ geringe Menge an RNA, die geerntet wird. Diese Einschränkung ist jedoch mehr ein biologisches Problem als ein technisches Problem, da die Anzahl der Mikroglia im Frühstadium der Entwicklung des Gehirns (Tabelle 1) sehr gering ist. Durch diese geringe Menge an RNA gesammelt Verstärkung Schritte Genom Breite Gen Expressionsanalyse durchführen berücksichtigt werden müssen. Glücklicherweise, produzieren diese Verstärkung Schritte ausreichende Mengen an hochwertigen cDNA. So können die globale Veränderungen in der Gen-expressionsprofile von isolierten Zellen untersucht werden.
Dieses Protokoll bietet abschließend eine robuste Methode zu isolieren und verschiedenen CNS Zelltypen aus Larven Zebrafisch Gehirn zu studieren. Dies kann angewendet werden, um ein tieferes Verständnis dieser Zellen während der Entwicklung als auch hinsichtlich ihrer Rolle bei der Krankheit studieren zu gewinnen.

Wissen über die Entwicklung des Gehirns und Erkrankungen des Gehirns hat in den letzten zehn Jahren seit der ersten Quantifizierung der Maus Gehirn Transkriptom1deutlich verbessert. In der Tat haben große Gen Ausdruck Genomanalyse wir Zugriff auf detaillierte genetische Informationen auf Gehirngewebe und Zellen, die sich ergänzen und Beobachtungen mit anderen Techniken und Werkzeuge verbessern können.
Der Zebrabärbling ist ein potenter biologisches Modell, leicht zu züchten und zu genetisch zu verändern; seine optische Transparenz bei Larvenstadien kann live imaging Beobachtungen2. Leider, im Vergleich zu Mensch und Maus, die Anzahl der verfügbaren Antikörper auszuführenden Immuno-Färbung ist eher gering. Um hier Abhilfe zu schaffen, sind transgene Zebrafisch Fisch Linien leicht gemacht durch genetisch ändern Fisch, fluoreszierende Proteine unter Zelle Art spezifische Promotoren auszudrücken. Transgene Zebrafisch-Linien wurden in der Vergangenheit zur Untersuchung der Rolle von Makrophagen und Mikroglia im zentralen Nervensystem (ZNS) Entwicklung und Krankheit3,4,5,6. Jedoch um ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse zu gewinnen müssen wir Veränderungen in der Genexpression in der jeweiligen Zelltypen zu verstehen. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine experimentelle Methode, um gezielt isolieren Zellen wie Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von 3 bis 8 Tage nach Befruchtung (Dpf) Larven Zebrafisch Gehirne. Für die Einrichtung des Protokolls arbeiteten wir mit transgene Fische-Linien, die grünes fluoreszierendes Protein (GFP) Ausdrücken in Makrophagen/Mikroglia unter der Makrophagen ausgedrückt gen Projektträger (Mpeg1:eGFP) und DsRed in Neuronen unter der neuronalen ß-tubulin Projektträger (NBT:DsRed)7,8,9. Darüber hinaus führten wir durch Immuno-Färbung der Mikroglia mit 4 4, ein Maus monoklonaler Antikörper, die spezifisch Zebrafisch Mikroglia10,11Flecken. Danach wird diese Zellen für weitere quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) oder Transkriptom-Analysen Ribonukleinsäure (RNA) entzogen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um effizient zu homogenisieren Gehirngewebe von zebrafischlarven; Neuronen, Makrophagen/Mikroglia und Mikroglia ohne Änderung der Plasmamembran Integrität zu sammeln und schließlich extrahieren RNA aus diesen Zellen in hoher Qualität (RIN > 7) und Quantität genomische Analysen durchzuführen. Im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Studien, die Trypsin-Behandlung bei 37 ° C zu verwenden, um zu verdauen Gehirn Gewebe12,13, fördert dieses Protokoll arbeiten bei 4 ° C bis der RNA Extraktionsschritt, Änderungen des genexpressionsprofils zu reduzieren. Dieser Schritt ist entscheidend als Mikroglia und Makrophagen sind hochsensible Zellen, die Veränderungen in ihrer Mikroumgebung sofort reagieren, durch die Veränderung ihrer Gen Ausdruck Profil und Polarisation14,15, 16.
Das Protokoll, hier im Detail beschrieben, zeigt, dass die Isolation der Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Zebrafisch-Larven Gehirne, aber praktisch, es an jede andere Zelle angepasst werden kann innerhalb des Gehirns - entweder über transgene Fische Linien präsentieren oder etikettiert mit spezifische Antikörper. Diese Methode ermöglicht eine bessere Charakterisierung der ZNS-Zellen durch ihre Breite Genexpressionsanalysen Genom und wird dazu beitragen, um ihre Rolle bei der Entwicklung und Erkrankungen des Gehirns zu verstehen.

<table><tbody><tr><td>1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 1X</td><td>Gibco</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Gibco</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS222)</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 90mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>101VIRR</td><td></td></tr><tr><td>Surgical micro-scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td><td>SLS</td><td>PIP4206</td><td></td></tr><tr><td>Glass homogenizer</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sterilin standard 55mm petri dishes</td><td>ThermoFisher</td><td>P55V</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylen conical tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>BD</td><td>302188</td><td></td></tr><tr><td>Needle 23G x 1&#039;&#039;</td><td>BD</td><td>300800</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS)</td><td>Cell Signalling</td><td>5425S</td><td></td></tr><tr><td>35 &amp;mu;m cell strainer cap</td><td>BD</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>BD</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td><td>Biolegend</td><td>101321</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Anti-4C4</td><td>Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS sorter FACSAria II</td><td>BD</td><td>QMRI, FACS facility</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>&amp;nbsp;31350-010</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>QIAGEN</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 96 Real-Time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq System V2</td><td>NuGEN</td><td>7102-32</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico reagents</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

Um ein detailliertes Verständnis der Rolle der verschiedenen ZNS-Zellen bei der Entwicklung oder die Einrichtung und das Fortschreiten der Erkrankungen des Gehirns zu gewinnen, ist es wichtig, diese Zellen zu isolieren, ohne ihre Genexpressionsprofil. Der Zebrafisch-Modell bietet eine große Anzahl von transgenen Fischen Linien, in denen bestimmte Zelltypen gekennzeichnet sind; zum Beispiel Neuronen in der NBT:DsRed Zeile bzw. Makrophagen/Mikroglia in der Mpeg1:eGFP-Linie. Darüber hinaus Antikörper wurden entwickelt, um bestimmte Zellen, wie z. B. Mikroglia mit 4 4 Fleck Antikörper.
Hier beschreiben wir die Isolation von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Larven Zebrafisch Gehirne. Zentral für dieses Protokoll ist die Vermeidung von einer enzymatischen Gewebe Verdauung bei 37 ° C, die zelluläre Profile ändern könnte. Stattdessen wird ein mechanisches System der Gewebe Homogenisierung bei 4 ° C verwendet. Dieses Protokoll beinhaltet Homogenisierung der Gehirne in Zellsuspension, ihre Immuno-Färbung und die Isolation der Neuronen, Makrophagen und Mikroglia durch FACS. Danach wir RNA aus diesen Zellen extrahiert und bewertet deren Qualität/Quantität. Wir es geschafft, die RNA von hoher Qualität zu erhalten (RNA Integrität Anzahl (RIN) > 7) qPCR auf Makrophagen/Mikroglia und Neuronen und transkriptomischen Analyse der Mikroglia durchführen. Dieser Ansatz ermöglicht eine bessere Charakterisierung dieser Zellen sowie ein besseres Verständnis über ihre Rolle in der Entwicklung und Pathologien.

Das beschriebene Protokoll ist ein einfaches Verfahren, Neuronen, Makrophagen und Mikroglia von Zebrafisch-Larven Gehirne zu isolieren. Aus diesen isolierten Zellen, erhebliche Mengen von hoher Qualität (RIN > 7) RNA wurden extrahiert. Das Ziel dieses Protokolls ist, verschiedene Arten von Zellen aus CNS, mit minimalen Änderungen ihrer Genexpressionsprofil zu analysieren und zu charakterisieren, Zelleneigenschaften und Funktionen zu isolieren. Daher wird das gesamte Protokoll bei 4 ° C mit einer mechanischen Gehirns Gewebe Homogenisierung durchgeführt. Diese Methode hat für zwei Studien im Labor erfolgreich eingesetzt. In der ersten Studie wurden Neuronen und Makrophagen/Mikroglia isoliert aus 8 Dpf Mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ Larven (Abbildung 1). FACS Zellseparation aus Trümmern in Abhängigkeit von ihrer Größe erlaubt (FSC-A) und Granularität (SSC-A) (Abb. 1A). Einzelne Zellen wurden dann von Dubletten oder Zelle Agglomerate (Abbildung 1B) getrennt. Von der einzelnen Zellenbevölkerung wurde ein Tor gezogen, um abgestorbene Zellen (DAPI+) zu beseitigen. Die entsprechenden Dot-Plot ergab, dass dieses experimentelle Protokoll Zelle Plasmamembran Integrität bewahrt, wie abgestorbene Zellen nur 26,7 % (Abbildung 1C) beträgt. Zu guter Letzt wurden Neuronen (DsRed+) und Makrophagen/Mikroglia (GFP+) leicht von den live Zelle Bevölkerung Toren getrennt. Die Neuron-Bevölkerung (23,1 %) scheinen mehr im Vordergrund als die Makrophagen/Mikroglia Bevölkerung (1,56 %) innerhalb des Gehirns (Abbildung 1D). Dieses Protokoll erlaubt um RNA aus diesen Zellen um nachfolgende qPCR Analysen um die Expression bestimmter Gene zwischen Neuronen und Makrophagen/Mikroglia vergleichen zu isolieren. Abbildung 2 zeigt neuronale und Makrophagen/Mikroglia Gen Ausdruck Niveaus des wuchernden Cell nuclear Antigen (Pcna)gegen β-Aktin Housekeeping Gene als Vorbild.
Für die zweite Studie konzentrierte sich diese Methode auf Mikroglia Isolation von 3, 5 und 7 Dpf Larven Gehirne. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Experiment wurden durch Immuno-Beflecken Zellen isoliert mit 4 4, ein Antikörper, der spezifisch Mikroglia (Abbildung 3 A-D Etiketten). Wie zuvor beschrieben, Mikroglia (4 4+) wurden von lebenden Zellen ausgewählt und gesammelt (Abbildung 3D). Mikroglia Zahlen im Zebrafisch-Larven Gehirne sind variabel (Tabelle 1), und mit 3 Dpf (∼ 25 pro Fisch) sehr gering. Qualität und Quantität der extrahierten RNA aus diesen Zellen wurden gemessen mit einem Mikro-Kapillar-Elektrophorese basierte System. Ergebnisse der extrahierten RNA von Mikroglia 5 Dpf Larven Zebrafisch Gehirne wurden bereitgestellt, um ein Beispiel für eine RNA Analyse (Tabelle 1 (5 Dpf; Experiment 4)) zu illustrieren. Abbildung 4 zeigt die Elektrophorese-Spur und die grafische Darstellung erhalten für dieses Beispiel mit eine klare Visualisierung der ribosomalen RNA (28 s und 18 s). Diese Daten sind erforderlich, um Probe RIN zu berechnen und zu RNA-Konzentration zu bestimmen. Tabelle 1 fasst die Zahl der isolierten Mikroglia pro Fisch, die Menge an RNA pro Mikroglia und den RIN erreichte Punktzahl für jedes anderes Experiment auf 3, 5 und 7 Dpf. Die Menge und die Qualität der extrahierten RNA aus isolierten Mikroglia, die mit dieser Methode konnten wir die RNA in cDNA mit einem Kit zu verstärken. Qualität und Quantität von Edinburgh Genomics genannten Tests bestätigen, dass die verstärkte cDNA von ausreichender Qualität für die Bibliothek Vorbereitung und anschließende Sequenzierung. Abbildung 5 zeigt die Größenverteilung der cDNA-Fragmente und ihre Höhe mit einem elektrophoretischen System gemessen. In diesem Beispiel die cDNA hatte eine mittlere Größe von 299bp in einer Konzentration von 36100 Pmol/l Tabelle 2 zeigt bzw. qualitative und quantitative Untersuchungen auf verstärkte cDNA von RNA-Proben (Tabelle 1 (5 Dpf; Experiment 4)). Die verstärkte cDNA wurde erfolgreich für die Sequenzierung eingesetzt.
Mehrere Studien im Labor bestätigte, dass die Qualität und Quantität der extrahierten RNA aus Neuronen, Makrophagen und Mikroglia für nachfolgende qPCR und Genom Breite Genexpressionsanalysen verwendet werden können. Daher kann dieses experimentelle Protokoll verwendet werden, zuverlässig verschiedene Arten von ZNS-Zellen zu isolieren, ohne Veränderung ihrer Membran Integrität und Änderung ihrer Genexpressionsprofil zu begrenzen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> Abbildung 1 : FACS Sortierung für Neuronen und Makrophagen/Mikroglia aus Mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 Dpf zebrafischlarven. (A-C) Aufeinanderfolgenden Anspritzung sequenzielle Auswahl an alle Gehirn Zellen (A) zeigt, einzelne Zellen von forward Scatter und Side scatter (B). (C) toten Zellen wurden durch DAPI Kennzeichnung ausgeschlossen. (D) Neuronen und Makrophagen/Mikroglia wurden jeweils mit DsRed und GFP positive Färbung gekennzeichnet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> Abbildung 2 : Gen Expressionsanalyse für Pcna und β-Aktin in Neuronen und Makrophagen/Mikroglia. RNA aus isolierten Neuronen und Makrophagen/Mikroglia kann in cDNA für den Einsatz in quantitative PCR Analyse transkribiert werden. mRNA-Ausdruck Niveaus Pcna gegen β-Aktin Housekeeping Gen in isolierten Neuronen und Makrophagen/Mikroglia durch qPCR ermittelt (N = 3). Fache Änderung wurde mittels der Vergleichsmethode (ΔΔCT) gemessen. Fehler bar repräsentieren Mittelwert ± SEM <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> Abbildung 3 : FACS Sortierung für Mikroglia aus 3 Dpf zebrafischlarven. (A-C) Aufeinanderfolgenden gating Show sequenzielle Auswahl an alle Gehirn Zellen (A), einzelne Zellen von forward Scatter und Side scatter (B). (C) toten Zellen wurden durch DAPI Kennzeichnung ausgeschlossen. (D) Mikroglia wurden durch 4 4 positive Färbung. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> Abbildung 4 : Micro-Kapillar-Elektrophorese Ergebnisse der extrahierten RNA aus 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia. Die beiden hohen Gipfel sind die 18 s und 28 s ribosomalen RNA. RNA Integrität Anzahl (RIN) wurde durch die Bioanalyzer Software unter Verwendung der generierten Verhältnis von der 18 s und 28 s ribosomalen Untereinheiten und die Analyse des gesamten elektrophoretischen Trace automatisch berechnet. Mikroglia RNA hat ein RIN 8.6. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> Abbildung 5 : Qualität und Quantität Tests der verstärkten cDNA von RNS-Probe von 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia. Das Bild zeigt die cDNA Fragment Größenverteilung der analysierten Probe mit einer durchschnittlichen Größe von 299 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Zustand</td>
			<td>Experiment</td>
			<td>Anzahl der Fische</td>
			<td>Anzahl von Zellen</td>
			<td>Zellzahl pro Fisch</td>
			<td>RNA-Konzentration (Pg/Ul)</td>
			<td>Gesamt-RNS (Pg)</td>
			<td>RNA-Menge pro Zelle (Pg)</td>
			<td>RIN-Partitur</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37,55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31,15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0,16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18,54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0,20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0,07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54,18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0,09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0,07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0,04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0,06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0,07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99,87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0,08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092</td>
			<td>0,06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Zusammenfassung der Mikroglia Isolation und RNA-Extraktion aus 3, 5 und 7 Dpf Zebrafisch-Larven.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Interne Proben-ID</td>
			<td>Externen Proben-ID</td>
			<td>Qubit (ng/Ul)</td>
			<td>Qubit(ng/UL)</td>
			<td>Durchschnittliche Konzentration (ng/Ul)</td>
			<td>Volume (Ul)</td>
			<td>UG erhalten</td>
			<td>Pass/Fail-für minimale Konzentration</td>
			<td>Pass/Fail-für minimalen Menge</td>
			<td>Pass/Fail-für empfohlene Menge</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 Dpf (Versuch 4)</td>
			<td>58,8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58,6</td>
			<td>30</td>
			<td>1,76</td>
			<td>Pass</td>
			<td>Pass</td>
			<td>Pass</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">Probe-Anforderungen für Bibliothek-Vorbereitung:</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bibliothek-Prep</td>
			<td>Mindestmenge (ng)</td>
			<td>Empfohlene Menge (ng)</td>
			<td>Minimale Konzentration ng/uL</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>TruSeq Nano gel freie 350 bp-einfügen-Bibliothek von cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Menge Tests der verstärkten cDNA von RNS-Probe von 5 Dpf Zebrafisch Mikroglia.

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Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  University of Edinburgh. Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Serie: Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from the whole brain or from either the telencephalic, tectal or cerebellar regions of the adult zebrafish brain. Additionally, we describe the procedure to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres.

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Biologie

Aufbereitung von Darmzellen aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Autor im Rampenlicht: Isolierung und Analyse von Darmzellen von Zebrafischlarven zur Untersuchung transkriptomischer Aspekte der gastrointestinalen Entwicklung 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolierung von regionsspezifischer Mikroglia von einer Erwachsenenmaus Gehirnhälfte für tiefe einzellige RNA-Sequenzierung

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Neurowissenschaften

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research and develop alternative in vivo neuroinflammation models to understand the role of neuroinflammation in neurodegeneration. In this study, a larval zebrafish model of neuroinflammation mediated by ventricular microinjection of lipopolysaccharide (LPS) to induce an immune response and neurotoxicity was developed and validated. The transgenic zebrafish lines elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP, and mpo:EGFP were used for real-time quantification of brain neuron viability by fluorescence live imaging integrated with fluorescence intensity analysis. The locomotor behavior of zebrafish larvae was recorded automatically using a video-tracking recorder. The content of nitric oxide (NO), and the mRNA expression levels of inflammatory cytokines including interleukin-6 (IL-6), interleukin-1&#946; (IL-1&#946;), and human tumor necrosis factor &#945; (TNF-&#945;) were investigated to assess the LPS-induced immune response in the larval zebrafish head. At 24 h after the brain ventricular injection of LPS, loss of neurons and locomotion deficiency were observed in zebrafish larvae. In addition, LPS-induced neuroinflammation increased NO release and the mRNA expression of IL-6, IL-1&#946;, and TNF-&#945; in the head of 6 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, and resulted in the recruitment of neutrophils in the zebrafish brain. In this study, injection of zebrafish with LPS at a concentration of 2.5-5 mg/mL at 5 dpf was determined as the optimum condition for this pharmacological neuroinflammation assay. This protocol presents a new, quick, and efficient methodology for brain ventricle microinjection of LPS to induce LPS-mediated neuroinflammation and neurotoxicity in a zebrafish larva, which is useful for studying neuroinflammation and could also be used as a high-throughput in vivo drug screening assay.

This protocol demonstrates the microinjection of lipopolysaccharide into the brain ventricular region in a zebrafish larval model to study the resulting neuroinflammatory response and neurotoxicity.

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

Nuclei Isolation from Whole Tissue using a Detergent and Enzyme-Free Method

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension with&#160;intact cell or nuclei involves dissociation and permeabilization, steps that can introduce unwanted noise and undesirable damage. Particularly, certain cell-types such as neurons are challenging to dissociate into individual cells. Additionally, permeabilization of the cellular membrane to release nuclei requires optimization by trial-and-error, which can be time consuming, labor intensive and financially nonviable. To enhance the robustness and reproducibility of sample preparation for high-throughput sequencing, we describe a rapid enzyme and detergent-free column-based nuclei isolation method. The protocol enables efficient isolation of nuclei from the entire zebrafish brain within 20 minutes. The isolated nuclei display intact nuclear morphology and low propensity to aggregate. Further, flow cytometry allows nuclei enrichment and clearance of cellular debris for downstream application. The protocol, which should work on soft tissues and cultured cells, provides a simple and accessible method for sample preparation that can be utilized for high-throughput profiling, simplifying the steps required for successful single-nuclei RNA-seq and ATAC-seq experiments.

Single nuclei isolation relies on dissociation and detergent-based permeabilization of the cell membrane, steps that need optimization and are prone to introducing technical artifacts. We demonstrate a detergent and enzyme-free protocol for rapid isolation of intact nuclei directly from whole tissue, yielding nuclei suitable for single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) or ATAC-seq.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

High-throughput transcriptome and epigenome profiling requires preparation of a single cell or single nuclei suspension. Preparation of the suspension ...

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Zusammenfassung

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Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Darmisolierung aus Zebrafischlarven für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung

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RNA-Isolierung aus zellspezifische Subpopulationen Mit Laser-Mikrodissektion In Verbindung mit Rapid-Immunmarkierung

Hirnventrikuläre Mikroinjektionen von Lipopolysaccharid in Zebrafischlarven zur Beurteilung von Neuroinflammation und Neurotoxizität

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode