KP ככל כתב, כתב היד המתוקן. KP לבצע הניסויים וניתוח. עבודה זו נתמך על ידי פרס מעבר קריירה הלאומית המכונים לבריאות (NIH) (K22AI112816) כדי בשם

כל ההליכים ניסיוני בוצעו ב אוניברסיטת קליפורניה, אירווין.
1. מאגרי ופתרונות
<ol><li>להכין מרק Lysogeny (LB) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 25 גרם מיקס LB-מילר 1 ליטר של מים מזוקק פעמיים (ddH2O). צלחות פטרי, הוסיפו של 20 גרם נוספים של אגר. אוטוקלב לחטא. יוצקים 25 מ של אגר מותכת בינוני 10 ס מ קוטר פטרי ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. לאחסן מדיה נוזלי בטמפרטורת החדר, פלטות אגר ב 4 º C.</li>
	<li>הכנת לוחות Peptone שמרים גלוקוז (באסה) בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 1g של D-גלוקוז, 2 גר' peptone, 0.25 g של שמרים לחלץ, 4.2 גר'2פו ח'4, g 5.1 של נה2HPO47 שעות2O ו- 25 גרם אגר ב- 1 ליטר של ddH2 או אוטוקלב לחטא. שופכים 25 מ של אגר מותכת לתוך צלחות פטרי בקוטר ס מ 10 ולאפשר שבמהלכו בטמפרטורת החדר. חנות ב 4 º C.</li>
	<li>הכנת Peptone S (PS) בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 10 גרם של peptone, 7 גר' שמרים לחלץ, 15 גרם של D-גלוקוז, 0.12 גר' נה2HPO47 שעות2O, 1.4 גר'2פו ח'4, 40 µg של ויטמין B12 , ו- 80 µg חומצה פולית 800 מיליליטר ddH2O. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.<ol>
<li>למדוד את רמת החומציות של המדיום PS באמצעות מד pH. להוסיף 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 כדי להתאים את ה-pH ל 6.5. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O. מסנן לחטא באמצעות מסנן ואקום מיקרומטר 0.22 ולאחסן ב 4 º C. הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו 10 x פיתוח מאגר ראשוני (DB') מאגר בבקבוק זכוכית 1 ליטר על-ידי הוספת 3.4 גרם2פו ח'4, 13.4 גר' נה2HPO4 7 שעות2O ו- ddH2O הנפח הכולל של 800 מ ל. לכייל מד pH אלקטרוני באמצעות pH 4 ותקנים pH 7 אם לא נעשה שימוש מד pH תוך יום.<ol>
<li>למדוד את רמת החומציות של המאגר באמצעות מד pH אלקטרוני. להתאים את ה-pH ל 6.5 על-ידי הוספת בעדינות 5 מ' קו או 5 מ' H3פו4 לפי הצורך. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר באמצעות ddH2O ולחטא על-ידי autoclaving. לאחסן בטמפרטורת החדר. הערה: להמשיך בזהירות ההתאמות pH מאת ללבוש ציוד מגן כולל כפפות, ביגוד מגן, הגנה העין, ופונים הגנה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפוך 1 x פיתוח מאגר (DB) על-ידי ערבוב 100 מ של 10 x DB' מאגר עם 1 מ"ל של עיקור MgCl 2 מ'2, 1 מ"ל של עיקור CaCl 1 מ'2. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 1 ליטר בתוך בקבוק זכוכית 1 ליטר באמצעות ddH סטיריליים בלוק של2O. חנות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>הכנת PS:DB בינוני בבקבוק זכוכית 1 ליטר על ידי ערבוב 100 מ של מדיום PS מעוקר, 100 מ של עיקור 10 x DB' מאגר, ו- ddH סטיריליים2O כדי הנפח הכולל של 1 ל' השלמה עם 1 מ"ל של עיקור 2 מ' MgCl2 ו 1 מ"ל של עיקור מ' 1 CaCl 2-חנות ב 4 º C.</li>
	<li>להכין את הפתרון מניות calcein-אם על-ידי הוספת µL 50 של דימתיל סולפוקסיד 50 µg של calcein-אם במכל פלסטיק המסופקים על ידי היצרן. חנות ב-20 ° C.</li>
</ol>2. צמיחה ותחזוקה של Amoebae
<ol><li>לגדל זן e. coli B/r17 כמקור מזון עבור amoebae במהלך תקופת הגידול הראשוני. רצף של e. coli B/r של מניה קפוא המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס על גבי צלחת אגר ליברות, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשיג אחת המושבות.</li>
	<li>לחסן מושבה בודדת של e. coli B/r לתוך 2 מ ל LB בינוני, דגירה תוף רולר או מטרף ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>להביא e. coli תרבות הלילה טמפרטורת החדר. באמצעות מקל עץ, לחסן amoebae של מניה קפוא שמרו ב-80 מעלות צלזיוס לתוך µL 750 של התרבות בין לילה. הערה: שימוש discoideum ד זן AX3, בעל יכולת של צמיחה axenic18. שלב זה אינו מחייב צמיחה axenic, אבל והשלבים יהיה הדרישה שלו.</li>
	<li>מיד להוסיף 700 µL של amoebae -e. coli התערובת לצלחת Peptone שמרים גלוקוז (ג'יפ). להפיץ את התרבות באופן שווה על פני השטח של הצלחת בהטיית גב וושוב גם הוא צד אל צד כנדרש. הימנע משימוש מפזר.</li>
	<li>מקם את הצלחת ללמוד עם אגר פונה כלפי מעלה בתוך קופסה השומר על לחות גבוהה. שימוש שני מיכלי פלסטיק חד פעמיות (183 ס"מ על 183 ס"מ x 91 ס מ) נערמו בראש אחד את השני. למלא את המיכל התחתון כ 25 מ ל מים ומניחים את המיכל העליון עם כמה פתחים 0.5 ס מ קוטר קדח דרך הריצוף של המיכל כדי לאפשר לחות להעביר המים הקרים המיכל העליון.</li>
	<li>תקופת דגירה של ג'יפ צלחת ותיבת ב 22 ° C של 4-5 ימים עד אמבה נבגים הם נצפו גדל קרוב לפני השטח של הצלחת (איור 2). השתמש חממה בקירור כדי דגירה צלחות ולא הדגירה בטמפרטורת החדר. הערה: לאחר נבגים גדלו, הם נשארים קיימא על צלחות למשך מספר שבועות כאשר הוא מאוחסן ב 4 º C. חנות את הלוחיות עם אגר צד פונה כלפי מעלה. לאחר 3-4 ימי דגירה, אזורי, אגף בתוך הדשא חיידקי יכול להיות שנצפו, מעידות על תחילת הנבגה אמבה.<ol>
<li>שימו לב amoebae קטן נבגים מעל פני השטח צלחת אחרי 4-5 ימי דגירה (איור 2). הערה: לא גדלים על amoebae במשך יותר משבוע, ככל שאיכות הנבגים הקטנת מעבר פרק זמן זה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף amoebae נבגים כדי להתכונן הגידול axenic של amoebae מאד טיפ פיפטה עקר 1 מ"ל מקביל פני השטח של הצלחת. לאסוף חצי של 10 ס מ פטרי נבגים. הערה: להימנע מלגעת בקצה השטח של צלחת אגר תנועה זו לאסוף מספר רב של e. coli.</li>
	<li>Resuspend את amoebae על קצה פיפטה על ידי הטבעית הטיפ לתוך 1 מ"ל של PS בינוני בעדינות pipetting למעלה ולמטה.</li>
	<li>להעביר את התערובת חוסנו לתוך בקבוקון 250-mL המכיל 25 מ של המדיום PS בתוספת הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic-0.25 x ריכוז. הערה: אחסן את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic כמו aliquots µL 250 ב-20 ° C. הימנע מחזורים חוזרים ונשנים של מפשיר, הקפאה של פתרון זה כמו זו עלולה להפחית את יעילותה.</li>
	<li>לגדול amoebae axenically ב 22 ° C ב שייקר מסתובב ב 100 סל"ד. עבור וזמינותו התקפה אלימה בשלב 5, מגדלים תאים צפיפות אופטית הנמדד על 600 nm (OD600) של 0.2 עד 0.5. הערה: שלב זה דורש 3-4 ימים של גידול מימי חיסון (שלב 2.7). אם התאים גדלו צפיפות גבוהה יותר, לדלל את התרבות בחזרה ב- PS בינוניים יתר600 של 0.05 או נמוך, לגדול חזרה יתר600 של 0.2-0.5.</li>
</ol>3. צמיחת aeruginosa פ
<ol><li>לבחור מושבה בודדת של aeruginosa פ מ צלחת LB לחסן אותו לתוך 2 מ ל PS:DB תרבות, לגדול בין לילה ב 37 ° C כדי רוויה. הערה: לא להוסיף את הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic לתקשורת PS:DB.</li>
	<li>לדלל את בטחונות תרבות לילה או 1:1,000 לתוך צלחת פטרי בקוטר 6 ס מ באמצעות PS:DB. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, לגדול תרבויות באמצעות צינורות תרבות המקובלת במקום. נתנער התרבות rotator benchtop שוכן בגובה 100 סל"ד ב 37 º C.</li>
	<li>קציר תרבויות בנקודות זמן מסוים כדי להבטיח הפארמצבטית. ב- 30 דקות עד h 1 לפני הערכת התקפה אלימה, להכין את רכיב pad אגר כמתואר בסעיף 4. הערה: התקפה אלימה ב פ aeruginosa הנגרמת על ידי כ 8 שעות של צמיחה על משטחים.</li>
	<li>כדי לבודד את תאי השטח-attached, להסיר את המדיום הנוזלי הפטרי לשטוף מיד עם 1 מ ל DB המאגר כדי להסיר תאים פלנקטוניים, פנה/י מיד לשלב 5.1. התראה: אנחנו לא שוטפים יותר מ 30 s כמו זה perturb, ניתוק צמוד-משטח תאים, עשוי להשפיע על המדידה התקפה אלימה.</li>
	<li>בידוד תאי פלנקטוניים, להעביר 10 µL של התרבות צלחת פטרי צלחת פטרי נקי, פנה/י מיד לשלב 5.1.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ - הכנת משטח אגר
<ol><li>להכין רפידות אגר בערך 30 דקות ל- 1 h לפני amoebae מוכנים להיות מעורב עם aeruginosa פ.</li>
	<li>מיקרוגל 50 מ של 1% (w/v) אגר במאגר DB בבקבוקון 250 מ. לערבב כל 20 s עד גושים של אגר נעלמים.</li>
	<li>מגניב של אגר מותכת על-ידי הצבתו באמבט מים טרופה 55 ° צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>להוסיף µL 15 של הפתרון מניות calcein-אם-15 מיליליטר אגר מותכת צינור חרוטי. לערבב על-ידי היפוך בעדינות את הצינור 4 - 5 פעמים, פנה/י מיד לשלב הבא. הערה: לבצע שלב זה בשפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן 15 מ"ל. אל תשתמש/י מיכל זכוכית עבה כמו זה יגרום את אגר שבמהלכו מהר מדי.</li>
	<li>שופכים את התערובת אגר מותכת על גבי צלחת זכוכית 12 ס"מ x 10 ס"מ ולאפשר את אגר שבמהלכו במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לחתוך משטח אגר הקרושה למקטעים קטנים יותר של 1.5 ס מ x 1.5 ס מ על ידי הצבת לוח הזכוכית על רשת מודפסת חיתוך לאורך הרשת בעזרת סרגל מתכת.</li>
	<li>שמור את הג'ל להתייבש בתוך קופסה לחים עד שזה מוכן לשימוש.</li>
</ol>5. מיקרוסקופ - הכנת המדגם חיידקים-אמבה עבור הדמיה
<ol><li>כדי assay של התקפה אלימה של צמוד-משטח תאים חיידקיים, להוסיף 10 µL של תאים אמבה מהשלב 2.10 צמוד-השטח חיידקים מהשלב 3.4. הערה: שלב זה מתאר את ערבוב של amoebae עם חיידקים.</li>
	<li>כדי assay של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים, מערבבים µL 10 תאים אמבה מהשלב 2.10 עם 10 µL של חיידקים פלנקטוניים מהשלב 3.5. הערה: לא רחץ את התאים אמבה תוצרת axenically (-יתר600 של 0.2 עד 0.5) לפני ערבוב עם החיידקים. אין התפתחות החיידק יתקיימו בתרבות אמבה עקב השימוש של הפתרון אנטיביוטיקה-antimycotic.</li>
	<li>מיד במקום משטח אגר calcein-אם 1.5 ס מ x 1.5 ס מ שלב 4.5 מעל תערובת חיידקים-אמבה על פני צלחת פטרי. הערה: מקום משטח אגר מעל התערובת באמצעות תנועה חלקה מהירה. אל תסירו משטח לאט לתוך התערובת כמו תנועה זו נוטה לקדם תאים לעבר הפריפריה, מן החלק התחתון של משטח. שלב זה יבטיח כי חיידקים, amoebae הם אחיד מעורב, ללא יכולת תנועה וסלולרי כי שני סוגי מוגבלים על אותו מישור.</li>
	<li>להסיר עודפי נוזלים על-ידי pipetting בעדינות את כל הנוזל הנותר סביב משטח אגר. לאפשר הפטרי לייבוש למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מכסה עם הפטרי עם מכסה, דגירה התערובת אמבה קיבוע-חיידקים בטמפרטורת החדר במשך נוספים 40 דקות להמשיך לשלב 6.1. הערה: חשוב דגירה כל דוגמאות עבור אותה כמות של זמן, כמו עליות פלורסצנטיות רקע לאורך זמן. זמן הדגירה של 1 h מומלץ. Incubations יותר מ 1 h הם פחות לשחזור כפי amoebae תאים עשויים להתחיל פרץ.</li>
</ol>6. מיקרוסקופ - ייבוא תמונות
<ol><li>Amoebae תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות מסוגל לרכוש תמונות זריחה brightfield וירוק. עבור ירוק פלורסצנטיות, השתמש במסננים חלבון (GFP) זריחה ירוק עם 474/27 nm ו 525/45 ננומטר עירור, פליטה, בהתאמה. השתמש מטרה (≥0.3 מפתח נומרי) X 10 כדי amoebae את התמונה. הערה: calcein-AM באגר תגרום amoebae גוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית בערוץ פלורסצנטיות ירוק. Amoebae בריא אינם אחרת פלורסנט.</li>
	<li>להתאים את רכישת פעמים לניגודיות שלב, ערוצי ה-GFP כדי להגביל את phototoxicity, ולמטב את הטווח הדינמי של התמונה עוצמות. החלף את הניגוד שלב ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית במידת הצורך. הערה: השתמש חשיפות 100-200 ms עבור שלב חדות, זריחה GFP במידת האפשר. שמור את הגדרות החשיפה, מכשיר ללא שינוי לאורך כל הניסוי כולו. . זה קריטי עבור מחשוב מדד הרג המארח.</li>
	<li>לרכוש תמונות עבור תאים אמבה לפחות 100 על מנת לקבל נתונים סטטיסטיים טוב לחישוב המארח הרג אינדקס.</li>
</ol>7. תמונה ניתוח ואינדקס הרג מארח
<ol><li>לבצע ניתוח התמונה באמצעות ImageJ.</li>
	<li>לפתוח את קובץ התמונה של ניגודיות שלב ב ImageJ על ידי לחיצה על קובץ | פתוח ובחירת התמונה. התאם את הסף על ידי לחיצה על תמונה | ניתוח | סף. התאם את הסף העליון והתחתון כדי לבחור רק את עוצמת שיא (איור 3א).</li>
	<li>המירו את התמונה לערך בינארי על ידי לחיצה תהליך | בינארית | להפוך בינארי. למלא חורים על-ידי בחירה תהליך | בינארית | למלא חורים. הערה: שימוש בדמותו באיור 1 כמקור, צעדים 7.1-7.2 יפיק תמונה שבה amoebae וחיידקים צמוד-משטח מופיעים אזורים כהים (איור 3ב').</li>
	<li>להבטיח כי תיבות אזור ו מתכוון וערך אפור מוכנסים נתח | לקבוע מידות. למדוד את גודל משוער amoebae על-ידי בחירת הכלי אליפסה בסרגל הכלים הראשי. לחץ על ניתוח | מדד ושים לב האזור של נציג amoebae.</li>
	<li>ליצור מסכות amoebae על ידי לחיצה נתח | לנתח חלקיקים. בתיבה גודל, הזן את האזור כוללים את amoebae אבל לא לכלול את החיידקים. בחר מסכות בשורת התפריט הנפתח של הצג את האפשרות. ודא כי התיבה להוסיף מנהל מסומנת.</li>
	<li>לחץ על OK תמונה המציגה רק את amoebae ואת מנהל רועי הדו-שיח תופיע (איור 3ג').</li>
	<li>פתחו את התמונה פלורסצנטיות באמצעות קובץ | פתוח ובחירה את הקובץ המתאים. בחר את כל האזורים של רועי מנהל על-ידי החזקת מקש shift לחוץ ולאחר לחיצה על כל אזור ברשימה (איור 3ד').</li>
	<li>לחץ על לחצן למדוד רועי מנהל. פעולה זו תפתח חלון תוצאות הצגת בערך כלומר העוצמה של כל אמבה.</li>
	<li>להעתיק את הערכים פלורסצנטיות עבור כל אמבה לתוכנית של גליון נתונים ולחשב המארח הורג אינדקס על ידי לקיחת הממוצע של כל הערכים זריחה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease.">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).</li><li>Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella,+the+host+and+disease:+a+brief+review.">Salmonella, the host and disease: a brief review.</a> Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).</li><li>Alibaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+virulence+genes+identified+in+a+Dictyostelium+host+model.">Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).</li><li>Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+pathogen+Pseudomonas+aeruginosa+utilizes+conserved+virulence+pathways+to+infect+the+social+amoeba+Dictyostelium+discoideum.">The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).</li><li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+Analyzed+in+a+Dictyostelium+discoideum+Host+System.">Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).</li><li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+bacterial+protein+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+using+the+Dictyostelium+host+model+system.">Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).</li><li>Steinert, M., Heuner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+as+host+model+for+pathogenesis.">Dictyostelium as host model for pathogenesis.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).</li><li>Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum:+a+new+host+model+system+for+intracellular+pathogens+of+the+genus+Legionella.">Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).</li><li>Matz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+uses+type+III+secretion+system+to+kill+biofilm-associated+amoebae.">Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae.</a> ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).</li><li>Hauser, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+type+III+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa:+infection+by+injection.">The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).</li><li>Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+pH+insensitive,+two+color+fluorescence+viability+(cytotoxicity)+assay.">A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay.</a> Journal of Cell Biology. 111, 58 (1990).</li><li>Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -. P., Cushion, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+calcein+acetoxy+methyl+ester+and+ethidium+homodimer+or+propidium+iodide+for+viability+assessment+of+microbes.">Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes.</a> Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).</li><li>Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+attachment+induces+Pseudomonas+aeruginosa+virulence.">Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).</li><li>Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+staining+assessment+of+Schwann+cell+viability+within+whole+peripheral+nerves+using+calcein-AM+and+ethidium+homodimer.">Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer.</a> Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).</li><li>Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-isotopic,+highly+sensitive,+fluorimetric,+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes.">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).</li><li>Grieshaber, P., Lagr&#232;ze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM:+A+new+method+for+assessing+cell+vitality.">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).</li><li>Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inherited+Differences+in+Sensitivity+to+Radiation+in+Escherichia+Coli.">Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+of+Dictyostelium+discoideum+to+nucleic+acid+analogues.">Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues.</a> Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).</li><li>Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+virulence+factors+for+bacterial+pathogenicity+in+plants+and+animals.">Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals.</a> Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).</li><li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation.">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה כמותיים כדי assay התקפה אלימה ב aeruginosa פ. פרוטוקול זה עשוי להיבדק עם חיידקים אחרים. עם זאת, חשוב לזכור כי מדיום הגידול צריך להיות תואם תנאי הגידול של אמבה. בפרט, אנו יש אופטימיזציה הפרוטוקול באמצעות PS:DB כמו מדיום הגידול חיידקי. אם נעשה שימוש מדיה אחרת, ייתכן צורך ...

זיהום חיידקי הוא אחד הגורמים המובילים התמותה האדם וחיות1,2. היכולת למדוד התקפה אלימה של חיידקים תרבויות או biofilms חשוב הגדרות בריאות ומחקר. כאן, אנו מתארים שיטה רב תכליתי, מהירה, פשוטה יחסית לכמת התקפה אלימה חיידקי. האורגניזם האיקריוטים Dictyostelium discoideum (אמבה) משמש האורגניזם המארח מודל. ד discoideum שימש כמארח כדי לזהות גורמים התקפה אלימה Pseudomonas aeruginosa (aeruginosa פ)3,4,5 ו אחרים חיידקים6,7 ,8 , היא חשופה בעיקר אותם התקפה אלימה גורמים להרוג תאים בתרבית של כולל סוג III הפרשת9,10. מבחני התקפה אלימה הקודם באמצעות discoideum ד מעורב חשיפה ממושכת של חיידקים עם תאים discoideum ד במהלך שעות3,4,5. הפרוטוקול, כאן, מציג שיטה מהירה של קביעת התקפה אלימה באמצעות זה אמבה. פרוטוקול זה (איור 1) מתאר כיצד: (1) לגדל את amoebae axenically (בהיעדרו של חיידקים), (2) לגדול חיידקים על וזמינותו, (3) להכין חיידקים, התאים המארחים עבור מיקרוסקופ, (4) לבצע epifluorescence מיקרוסקופ, ולנתח (5) אמבה קרינה פלואורסצנטית.
Amoebae בתחילה קווצות שער החוצה מן המלאי קפוא, גדל על מדשאה של Escherichia coli (e. coli), שבו amoebae מייצרים נבגים. הנבגים האלו הם הרים, מחוסן לתוך בינוני מועשר לצמיחה axenic. Amoebae מתוחזקים באמצעות צמיחה axenic בתנאים עשירות עד שהם יהיו מוכנים להיות מעורב עם חיידקים להערכה של התקפה אלימה חיידקי. ההישרדות או מותו של amoebae זה לכמת על ידי מדידה של זריחה של calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), אשר הוא ביקע מאת תאיים esterases, ובכך, מופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית11,12. Amoebae חיה להפגין מעט או ללא קרינה פלואורסצנטית ואילו הדגיש, תאים הגוסס לזרוח באופן אינטנסיבי. תוצאה זו נובעת תיאגוד מעט או ללא calcein-אם amoebae בריאה, התאגדות, המחשוף של המצע לחוץ amoebae13. התנהגות זו היא בעיקר נבדלת זריחה calcein-אם תאים בתרבית של11,14,15,16.
חיידקים ייבחנו על התקפה אלימה גדלים בנפרד. כאן, אנו נתאר כיצד למדוד את התקפה אלימה של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ וכן פירוט איך לכמת את התקפה אלימה של יצורי (שחייה), צמוד-פני אוכלוסיות משנה. פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם כדי לבדוק את התקפה אלימה של חיידקים אחרים. במקטע תוצאות נציג, אנו מראים כי התקפה אלימה מופעלת בצמוד-משטח תאים והוא נמוך פלנקטוניים תאים, אשר דווחה בעבר13. מופעל התקפה אלימה צמוד-משטח aeruginosa פ הורג amoebae ואילו-מידבק תאים פלנקטוניים שנצרכים על ידי amoebae. אם אך ורק הוא להיות לבדיקה של התקפה אלימה של יצורי חיידקים, חיידקים יכולים להיות בתרבית צינורות רגילים תרבות יותר מאשר באמצעות צלחות פטרי כמפורט בפרוטוקול.
הצמיחה של amoebae ותרבויות aeruginosa פ חייבים להיות מתואמים כך aeruginosa פ תרבויות להגיע שלב הצמיחה המיועד ואילו amoebae גדלים על מצב יציב בתנאים עשירות. מצב זה מחייב בדרך כלל amoebae תרבויות אלקליניים לפחות יום אחד לפני כאשר הם מעורבבים עם חיידקים. Amoebae וחיידקים הם מתאושש באמצעות רפידות אגר, שיתוף incubated לשעה, עם תמונה ברזולוציה נמוכה (10 X, מפתח נומרי 0.3) חלבון פלורסצנטיות אובייקטיבי, ירוק (GFP) מסננים באמצעות מצלמה הדמיה. הניתוח יכול להתבצע באמצעות תוכנת ImageJ זמינה בחופשיות או אישית התמונה ניתוח תוכנה. הניתוח שלנו בוצעה באמצעות התוכנה שלנו שנכתבו באמצעות חבילת13ניתוח מדעי. התוכנה צריכה ליצור מסיכה באמצעות שלב חדות התמונה, לחלץ ערכים זריחה האזורים עם מסיכה בתמונה זריחה. קרינה פלואורסצנטית ערכים הם בממוצע לפחות מאה תאים, וכתוצאה מכך אינדקס הרג מארח מספריים.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

מבחני התקפה אלימה חיידקי מסורתי לערב חשיפה ממושכת של חיידקים במשך מספר שעות, התאים המארחים. במהלך תקופה זו, חיידקים יכולים לעבור השינויים בפיזיולוגיה עקב החשיפה לסביבת הגידול מארח ואת נוכחותם של התאים מארח. פיתחנו assay למדוד במהירות את מצב התקפה אלימה של חיידקים כי למזער את מידת שאליו הבקטריה גדלה בנוכחות התאים המארחים. חיידקים, amoebae מעורבבים יחד, ותשמרו על מטוס יחיד הדמיה באמצעות רכיב pad אגר. ההליך משתמש פלורסצנטיות בתא יחיד הדמיה עם אסתר calcein-acetoxymethyl (calcein-AM) כמחוון של בריאות התא המארח. ידי קרינה פלואורסצנטית של התאים המארחים ניתוח לאחר h 1 של חשיפה של התאים המארחים חיידקים באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. התמונה ניתוח תוכנה משמשת לחישוב בעל אינדקס הרג המארח. בשיטה זו נעשה שימוש כדי למדוד התקפה אלימה בתוך פלנקטוניים ומחוברת משטח Pseudomonas aeruginosa תת אוכלוסיות במשך השלב ההתחלתי של ביופילמים, שעשוי להיות מותאם חיידקים אחרים ושלבים אחרים biofilm הצמיחה. פרוטוקול זה מספק שיטה מהיר וחזק של מדידת התקפה אלימה, מונע רבים של המורכבויות המשויכות את הצמיחה ואת התחזוקה של שורות תאים בתרבית. התקפה אלימה פנוטיפים נמדד כאן באמצעות amoebae יש גם מאומתים באמצעות העכבר מקרופאגים. בפרט, זה וזמינותו שימש להקים את התקפה אלימה upregulates מצורף משטח aeruginosa פ.

גדלנו פראי-סוג aeruginosa פ זן PA1419 או ΔlasR זן20 ברקע PA14 אותו ב- 6 ס מ קוטר פטרי, לבדיקה של התקפה אלימה של תאים פלנקטוניים וצמוד-פני השטח. תרבויות חוסנו של יחיד-המושבות לתוך תרבויות PS:DB, גדל בין לילה תרבות צינורות תוף רולר ב 37 ° C כדי הרוויה, מדולל מט...

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק aeruginosa פ.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.2K Views.  University of California. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את התקפה אלימה של חיידקים פלנקטוניים או צמוד-השטח באמצעות discoideum ד (אמבה) כמחשב מארח. התקפה אלימה נמדד על פני תקופה של 1 h, המארח הורג הוא לכמת באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות וניתוח התמונה. נדגים את פרוטוקול זה באמצעות החיידק 

Video: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Immunology and Infection

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

<meta charset="utf8"></head><body>מעקב ארוך טווח וכימות של תנועתיות מיני Acanthamoeba

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: חקר ההתנהגות של Acanthamoeba לפיתוח אסטרטגיות ממוקדות למניעת Acanthamoeba Keratitis

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

וזמינותו התקפה אלימה חיידקי מהירה מבוססת תמונה באמצעות אמבה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Assay חזותי לפקח תחרות קטריאלי T6SS בתיווך

מידות תא יחיד של קרע vacuolar נגרמים על ידי פתוגנים תאיים

זיהומים של תאי יונקים צייתנים עם חיידקי protozoan דרוך-

גילוי של פתוגנים תאיים חדשים על ידי Amoebal Coculture וגישות Amoebal העשרה

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות

כימות של Acanthamoeba spp. תנועתיות