Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP와 그대로 쓴 원고를 수정. KP는 실험 및 분석을 수행합니다. 이 작품을 다른 이름으로 국립 보건원 (NIH) 경력 전환 상 (K22AI112816)에 의해 지원 되었다

모든 실험 절차, Irvine가 주 대학에 실행 되었다.
1. 버퍼 및 솔루션
<ol><li>이중 증 류 물 (ddH2O) 1 L에 파운드-밀러 믹스의 25 g을 추가 하 여 1 리터 유리병에 Lysogeny 국물 (파운드)를 준비 합니다. 접시, 한 천의 추가 20 g 추가. 오토 클레이 브 소독. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 매체의 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 실내 온도에 액체 미디어와 4 ° c.에 한 천 배지를 저장</li>
	<li>D-포도 당 1 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시를 준비, 펩, 효 0.25 g의 2 세대 추출, KH2포4의 4.2 g, 나2HPO47 H2O, 5.1 g, 한 천의 ddH2 1 리터에 25 g O. 고압 소독입니다. 10 cm 직경 접시에 녹은 한 천 25 mL를 붓고 고 실 온에서 응고를 허용 합니다. 4 ° c.에 게</li>
	<li>펩의 10 g을 혼합 하 여 1 리터 유리병에 펩 S (PS) 매체를 준비, 7 g의 효 모 추출 물, D-포도 당, 나2HPO47 H2O, KH2포4의 1.4 g, 비타민 B12 의 40 µ g의 0.12 g의 15 g 80 µ g ddH2오의 800 mL에서 엽 산의 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.<ol>
<li>PH 미터를 사용 하 여 PS 매체의 pH를 측정 합니다. 5 M 코 또는 5 M H3포4 pH 6.5 조정 하려면 추가 합니다. 1 l 최종 볼륨 조정 ddH2오 필터를 사용 하 여 0.22 μ m 진공 필터를 사용 하 여 소독 및 4 ° c.에 저장 참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 개발 버퍼 프라임 배 준비 (DB') KH2포4나2HPO4 7 H2O, 그리고 ddH2O의 13.4 g 3.4 g 800 mL의 총 볼륨을 추가 하 여 1 리터 유리병에 버퍼. 하루 내 pH 미터를 사용 하지 않은 경우 pH 4와 pH 7 표준 사용 하 여 전자 pH 미터 보정.<ol>
<li>전자 산도 측정기를 사용 하 여 버퍼의 pH를 측정 합니다. 부드럽게 5 M 코 또는 5 M H3포4 필요에 따라 추가 하 여 6.5에 pH를 조정 합니다. 1 l ddH2O를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 하 고 압력가 마로 소독 하 여 소독. 실내 온도에 상점. 참고: 장갑, 보호복, 눈 보호, 보호 장비를 착용 하 여 pH 조정으로 신중 하 게 진행 하 고 얼굴을 보호.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 개발 버퍼 (DB) x 10 100 mL를 혼합 하 여 만들 DB x'의 1 mL와 버퍼 2 M MgCl2, 소독 하 고 1 mL의 1 M CaCl2소독. 1 l 1 L 유리 병 실내 온도에 압력가 마로 소독 멸 균된 ddH2O. 저장소를 사용 하 여 최종 볼륨을 조정 합니다.</li>
	<li>멸 균된 PS 매체의 100 mL를 혼합 하 여 1 리터 유리병에 PS:DB 매체를 준비, 100 mL의 멸 균 10 DB x' 버퍼, 그리고 소독된 ddH2O 1 L. 보충의 총 볼륨의 1 mL을 소독 2 M MgCl2 와 1 mL의 1 M CaCl 소독 2. 4 ° c.에 게</li>
	<li>Calcein-am는 제조업체에서 제공 하는 플라스틱 용기에서 50 µ g에 DMSO의 50 µ L을 추가 하 여 calcein 오전 재고 솔루션을 준비 합니다. -20 ° c.에 게</li>
</ol>2. 성장과 Amoebae의 유지 보수
<ol><li>초기 성장 기간 동안 대장균 스트레인 B/r17 amoebae 위한 음식 근원으로 성장. 행진 대장균 냉동된 재고에서 B/r 파운드 한 천 격판덮개에-80 ° C에 저장 하 고 37 ° C 하룻밤 단일 식민지를에서 품 어.</li>
	<li>LB 매체의 2 mL에 대장균 B/r의 단일 식민지를 접종 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 37 ° C에서 통에서 품 어.</li>
	<li>실 온에 하룻밤 대장균 문화를 가져와. 나무 막대기를 사용 하 여, 야간 문화 750 µ L로-80 ° C에서 보관 냉동된 재고에서 amoebae 접종. 참고: 사용 디 discoideum 스트레인 AX3, axenic 성장18수 있는. 이 단계는 axenic 성장, 필요 하지 않습니다 하지만 후속 단계 그의 요구를 해야 합니다.</li>
	<li>즉시 포도 당 효 모 펩 (GYP) 접시에 amoebae-대장균 혼합물의 700 µ L를 추가 합니다. 뒤로-및-앞뒤와 측면-투-사이드 필요에 따라 그것을 기울이기로 접시의 표면에 균등 하 게 문화를 확산. 스프레더 사용을 하지 않습니다.</li>
	<li>GYP 접시를 한 높은 습도 유지 하는 상자에 향하도록 넣습니다. 2 일회용 플라스틱 용기를 사용 하 여 (183 cm x 183 cm x 91 cm) 서로 위에 쌓아. 물 약 25 mL와 하단 컨테이너와 상위 컨테이너에는 물이 저수지에서 이동 수 분 수 있도록 컨테이너의 바닥을 통해 교 련된 여러 0.5 cm 직경 구멍 최고 컨테이너를 놓습니다.</li>
	<li>4-5 일 아메바 포자 표면 근처에 있는 격판덮개 (그림 2)의 성장 관찰 하는 때까지 GYP 접시와 22 ° C에서 상자를 품 어. 냉장된 인큐베이터를 사용 하 여 접시 보다는 실 온에서 부 화를 품 어. 참고: 포자, 성장 후 그들은 남아 있다 4 ° c.에 저장 될 때 몇 주 동안 접시에 가능한 한 천 면이 위로 향하도록 접시를 저장 합니다. 3-4 일 후 부 화, 세균성 잔디밭에서 비운의 영역 관찰할 수 있습니다, 아메바 포자 형성의 발병을 나타내는.<ol>
<li>인큐베이션 (그림 2)의 4-5 일 후 작은 amoebae 플레이트 표면 위에 포자를 관찰 합니다. 참고:이 기간을 넘어 포자의 품질 저하로, 일주일 이상 amoebae를 성장 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수집 amoebae 포자 균 1 mL 피 펫 팁 접시의 표면에 병렬 스윕하여는 amoebae의 axenic 성장을 위한 준비를 합니다. 10 cm 배양 접시의 절반에서 포자를 수집 합니다. 참고:이 모션 대장균의 다 수 수집 됩니다 한 천 격판덮개의 표면에 팁을 만지지 마십시오.</li>
	<li>PS 매체의 1 mL에 팁을 immersing 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 피 펫의 끝에는 amoebae를 resuspend.</li>
	<li>0.25 배 농도에서 항생제 antimycotic 솔루션과 보완 PS 매체의 25 mL를 포함 하는 250 mL 플라스 크에 접종된 혼합물을 전송 합니다. 참고:-20 ° c.에 250 µ L aliquots 항생제 antimycotic 솔루션 저장 해빙이 그 효능을 줄일 수로이 솔루션의 동결의 반복된 주기를 하지 마십시오.</li>
	<li>100 rpm 회전 통에 22 ° C에서 axenically amoebae 성장. 5 단계에서 독성 분석 결과 대 한 600에서 측정 하는 광학 밀도 세포 성장 0.2 0.5 nm (OD600). 참고:이 단계는 접종 (2.7 단계)의 시간에서 3-4 일을 요구 한다. 더 높은 밀도에 세포 성장, PS는 OD600 0.05 이하로 중간에 다시 문화를 희석 하 고 0.2 0.5의600 세 다시 성장.</li>
</ol>3. P. 녹 농 균 의 성장
<ol><li>파운드 플레이트에서 P. 녹 농 균 에의 한 식민지 선택, PS:DB 문화 2 mL에 접종 하 고 채도를 37 ° C에서 하룻밤 성장. 참고: PS:DB 미디어 항생제 antimycotic 솔루션을 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>PS:DB를 사용 하 여 6 cm 직경 샬레에 숙박 문화 1: 100 또는 1:1,000를 희석. Planktonic 세포 독성은 전적으로 분석 되 고, 만약 성장 대신 기존의 문화 관을 사용 하 여 문화. 37 ° c.에서 100 rpm에서 설정 벤치탑 회전자에 문화를 흔들어</li>
	<li>재현성을 보장 하기 위해 특정 시간 포인트에서 문화를 수확. 독성을 평가 하는 앞서 1 h 30 분 천 패드 섹션 4에서에서 설명한 대로 준비 합니다. 참고: 피 녹 농 균 에 독성 약 8 h의 표면에 성장에 의해 유도 된다.</li>
	<li>표면 부착 세포 분리, 배양 접시에서 액체 매체를 제거 하 고 즉시 planktonic 셀을 제거 하려면 DB 버퍼의 1 mL로 씻어 5.1 단계로 바로 진행. 주의: 30 이상 세척 하지이 것으로 s 교란 및 표면 부착 세포를 분리 하 고 독성 측정에 영향을 미칠 수 있습니다.</li>
	<li>Planktonic 세포를 분리, 깨끗 한 배양 접시에 배양 접시에서 문화의 10 µ L를 전송 하 고 5.1 단계로 바로 진행 합니다.</li>
</ol>4. 현미경-천 패드의 준비
<ol><li>Amoebae P. 농 균혼합 준비가 전에 천 패드 1 시간 30 분 정도 준비 합니다.</li>
	<li>250 mL 플라스 크에 DB 버퍼 한 천 1% (w/v) 50 mL를 전자 레인지. Agar의 대단히 짧은 시간까지 혼합 모든 20 s가 사라집니다.</li>
	<li>15 분 동안 데워 55 ° C 물 욕조에 그것을 배치 하 여 녹은 agar를 냉각 하십시오.</li>
	<li>15 ml 원뿔 튜브에 녹은 agar의 calcein 오전 재고 솔루션의 15 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 반전 튜브 4-5 배 하 여 혼합 하 고 즉시 다음 단계를 진행 합니다. 참고: 폴 리 프로필 렌 15 mL 원심 분리기 튜브에서이 단계를 수행 합니다. 이를 너무 빨리 응고 한 발생할 것입니다 두꺼운 유리 용기를 사용 하지 마십시오.</li>
	<li>12 cm x 10 cm 유리 접시 위에 녹은 한 천 혼합물을 부 어 하 고 실 온에서 10 분간 응고 agar를 허용 합니다. 유리 접시 인쇄 된 격자에 놓고 절단 금속 눈금자를 사용 하 여 그리드를 따라 작은 1.5 c m x 1.5 c m 섹션으로 응고 한 천 패드를 잘라.</li>
	<li>사용할 준비가 될 때까지 습 한 상자에 수 화 젤을 유지.</li>
</ol>5. 현미경-영상에 대 한 박테리아 아메바 샘플의 준비
<ol><li>표면에 부착 된 세균 세포의 독성을 분석 결과, 추가 10 µ L 아메바 세포의 단계 2.10에서에서 3.4 단계에서 표면에 부착 된 박테리아를. 참고:이 단계는 박테리아와 amoebae의 혼합을 설명 합니다.</li>
	<li>Planktonic 세포의 독성을 분석 결과, 단계의 3.5 planktonic 박테리아의 10 µ L로 단계 2.10에서에서 아메바 세포의 10 µ L을 혼합 한다. 참고: 박테리아와 혼합 하기 전에 (한 OD600 0.2 0.5) axenically 성장 아메바 세포 씻지 않는. 아니 대장균 성장 항생제 antimycotic 솔루션의 사용으로 인해 아메바 문화에서 관찰 됩니다.</li>
	<li>바로 페 트리 접시 표면에 박테리아 아메바 혼합물 위에 4.5 단계에서 1.5 c m x 1.5 c m calcein 오전 천 패드를 놓습니다. 참고: 빠른 부드러운 모션을 사용 하 여 혼합물 위에 천 패드를 놓습니다. 이 모션 주변 그리고 패드의 아래쪽에서 세포를 밀어 경향이 있다 혼합물에 천천히 패드를 낮출 하지 않습니다. 이 단계는 박테리아와 amoebae는 균등 하 게 보장 한다 혼합, 움직일 수 두 종류 세포 같은 평면에 수감 된다.</li>
	<li>천 패드를 둘러싼 나머지 액체 밖으로 부드럽게 pipetting으로 과잉 액체를 제거 합니다. 실 온에서 20 분 동안 건조를 페 트리 접시를 허용 합니다.</li>
	<li>Petri 접시 뚜껑으로 커버 하 고는 추가 40 분 진행 단계 6.1에 대 한 실 온에서 고정된 아메바-박테리아 혼합물을 품 어. 참고: 시간, 시간이 지남에 배경 형광 증가의 동일한 금액에 대 한 모든 샘플을 품 어 중요 하다. 1 h의 외피 시간 것이 좋습니다. 1 시간 이상 외피는 덜 재현할 amoebae 셀 버스트를 시작할 수 있습니다.</li>
</ol>6입니다. 현미경-이미지 수집
<ol><li>이미지 amoebae 명시 및 녹색 형광 이미지 수 있는 형광 현미경을 사용 하 여. 474/27와 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터 사용 녹색 형광에 대 한 및 525/45 nm 여기 및 방출, 각각. 10 X (≥0.3 숫자 조리개) 목표는 amoebae의 이미지를 사용 합니다. 참고:는 agar에 calcein 오전 녹색 형광 채널에서 죽어가는 amoebae 형광을 발생 합니다. 건강 한 amoebae는 달리 형광.</li>
	<li>GFP 이미지 농도의 동적 범위를 최적화 하 고 phototoxicity, 제한 채널 위상 대조에 대 한 수집 시간을 조정 합니다. 필요한 경우 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 단계 대조를 대체 합니다. 참고: 가능 하면 위상 대비 및 GFP 형광 100-200 ms 노출을 사용 합니다. 전체 실험을 통해 그대로 노출 및 악기 설정을 유지 합니다. 이것은 호스트 살인 지 계산 중요 합니다.</li>
	<li>살인 지 계산 하는 호스트에 대 한 좋은 통계를 얻기 위하여 적어도 100 아메바 세포에 대 한 이미지를 취득 합니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석 및 호스트 살인 인덱스
<ol><li>ImageJ를 사용 하 여 이미지 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>ImageJ에서 파일을 클릭 하 여 단계 대조 이미지 파일을 열고 | 오픈 이미지를 선택 하 고. 이미지를 클릭 하 여 임계값을 조정 | 분석 | 임계값. 강도 피크 (그림 3A)만 선택 하는 하위 및 상위 임계값을 조정 합니다.</li>
	<li>프로세스를 클릭 하 여 이진 이미지를 변환 | 이진 | 이진 하 게. 프로세스를 선택 하 여 구멍을 채우기 | 이진 | 구멍 채우기. 참고: 그림 1 에서 이미지를 사용 하 여 원본으로, 단계 7.1-7.2 amoebae 및 표면 연결 박테리아 어두운 영역 (그림 3B)으로 표시 한 이미지를 생산할 예정 이다.</li>
	<li>지역 및 회색 값 의미 상자 분석에에서 체크 확인 | 측정을 설정. 주 도구 모음에서 타원 도구를 선택 하 여는 amoebae의 대략적인 크기를 측정 합니다. 클릭 분석 | 측정 고 대표 amoebae의 영역.</li>
	<li>분석을 클릭 하 여는 amoebae에 대 한 마스크를 만들기 | 입자 분석. 크기 상자에는 amoebae 포함 되지만 박테리아 제외 영역을 입력 합니다. 보기 옵션에 대 한 드롭다운 메뉴 막대에서 마스크 를 선택 합니다. 관리자 추가 상자가 선택 되어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>확인 및 이미지 표시만 amoebae와 ROI 관리자 대화 상자가 나타납니다 (그림 3C) 클릭 합니다.</li>
	<li>파일을 사용 하 여 형광 이미지를 엽니다 | 오픈 적절 한 파일을 선택 하 고. Shift 키를 누른 채 목록 (그림 3D)에서 각 지역에 클릭 수익 관리자 에서 모든 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>투자 수익 관리자에서 측정 버튼을 클릭 합니다. 이 각 아메바의 평균 휘도 값 표시 결과 창이 열립니다.</li>
	<li>스프레드시트 프로그램에 각 아메바의 형광 값을 복사 하 고 모든 형광 값의 평균을 취 함으로써 인덱스를 죽이고 호스트를 계산.</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation.">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 P. 녹 농 균에 독성 분석 결과를 신속 하 고 양적 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아와 테스트할 수 있습니다. 그러나, 그것은 성장 매체 아메바 성장 조건와 호환 되어야 하는 마음에 유지 하는 것이 중요입니다. 특히, 우리는 세균성 성장 매체로 PS:DB를 사용 하 여 프로토콜을 최적화 했습니다. 다른 미디어를 사용 하는 경우에는 셀이 없으면 세균성 매체는 amoebae...

세균 감염 인간과 동물1,2사망률의 주요 원인 중 하나입니다. 문화 또는 biofilms에 박테리아의 독성을 측정 하는 능력은 의료 및 연구 설정에 중요 합니다. 여기, 세균성 독성을 계량 하는 다재 다능 한, 빠른, 그리고 상대적으로 간단한 방법을 설명 합니다. 진 핵 유기 체 Dictyostelium discoideum (아메바) 모델 호스트 유기 체로 사용 됩니다. D. discoideum 은 녹 농 균 (P. 녹 농 균)3,,45 에 다른 박테리아6,7 독성 요소를 식별 하는 호스트로 사용 되었습니다. ,8 주로 같은 독성 요인 유형 III 분 비9,10을 포함 한 포유류 세포를 죽이 게 쉽습니다. D. discoideum 를 사용 하 여 이전 독성 분석 실험 시간3,,45의 과정을 통해 디 discoideum 세포를 가진 박테리아의 장기간된 노출을 관련 있다. 프로토콜, 여기,이 아메바를 사용 하 여 독성을 결정 하는 빠른 방법을 제공 합니다. 이 프로토콜 (그림 1) 설명 하는 방법: (1) axenically (에서 박테리아의 부재) amoebae 성장, (2) 분석 결과 대 한 박테리아, (3) 준비 박테리아 성장과 현미경 검사 법, (4)에 대 한 호스트 셀 epifluorescence 현미경 검사 법, 수행 하 고 (5) 아메바 분석 형광입니다.
Amoebae 처음 냉동된 주식에서 줄무늬 고는 amoebae 포자를 생산 하는 곳의 대장균 (대장균), 잔디밭에 성장. 이 포자는 포착 하 고 axenic 성장 위한 풍부한 매체에 주사. amoebae는 영양분이 풍부한 조건에서 axenic 성장을 통해 세균 독성의 평가 대 한 박테리아와 혼합 될 준비가 될 때까지 유지 됩니다. 생존 또는 amoebae의 죽음은 calcein-acetoxymethyl (calcein-오전), 세포내 esterases에 의해 죽 습 이며, 따라서, 형광11,12에 대 한 활성화의 형광을 측정 하 여 정량. 강조 하는 반면 라이브 amoebae 거의 비슷하게 형광을 전시 하 고 죽어가는 세포 형광 강렬 하지. 이 결과 calcein-오전 건강 amoebae와 법인의 조금 또는 전혀 설립 및 스트레스 amoebae13기판의 분열. 이 문제는 특히 포유류 세포11,,1415,16calcein 오전 형광 다릅니다.
박테리아 독성에 대 한 평가 별도로 성장 된다. 여기, 우리는 기회 주의 병원 체 피 녹 농 균 의 독성을 측정 planktonic (수영) 및 표면 부착 부분 모집단의 독성을 계량 하는 방법에 자세히 설명 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 박테리아의 독성 테스트를 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과 섹션에서 우리는 독성 표면 부착 세포에서 활성화 되 고 보여줄 낮은 planktonic 셀에 이전13보고 했다. 비 악성 planktonic 세포는 amoebae 소비 하는 동안 표면에 부착 된 독성 활성화 P. 농 균 amoebae 죽인다. Planktonic 박테리아의 독성은 전적으로 분석 되 고, 박테리아는 프로토콜에 설명 된 대로 접시를 사용 하는 것 보다는 일반 문화 관에서 경작 될 수 있습니다.
P. 농 균 문화는 amoebae 영양분이 풍부한 조건에서 안정 된 상태에서 성장 하는 동안 의도 성장 단계에 도달 되도록 amoebae의 P. 농 균 문화 성장 조정 해야 합니다. 이 상태는 일반적으로 그들은 박테리아와 혼합 되어 적어도 1 일 하기 전에 희석 amoebae 문화를 필요 합니다. Amoebae 및 박테리아 천 패드를 사용 하 여 움직일 수는, 1 시간에 대 한 공동 incubated 이며 객관적인, 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터, 낮은 해상도 (10 X, 숫자 조리개 0.3)와 이미징 카메라를 사용 하 여 몇 군데. 분석은 ImageJ 소프트웨어를 자유롭게 사용할 수를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 이미지 분석 소프트웨어를 사용자 정의. 우리의 분석은 과학적인 분석 패키지13를 사용 하 여 작성 하는 우리 자신의 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 소프트웨어 단계 명암 이미지를 사용 하 여 마스크를 만들고 형광 이미지의 마스크 된 영역에서 형광 값을 추출 해야 합니다. 형광 값은 적어도 100 셀, 숫자 호스트 살인 색인 결과 이상 평균 했다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

전통적인 세균 독성 분석 실험 호스트 셀에 몇 시간에 걸쳐 박테리아의 장기간된 노출을 포함 됩니다. 이 기간 동안 박테리아 호스트 성장 환경에 노출 하 고 호스트 세포의 존재로 인해 생리에 변화를 받을 수 있습니다. 우리는 빠르게는 박테리아 호스트 세포의 성장 정도 최소화 하는 박테리아의 독성 상태를 측정 하는 분석 결과 개발. 박테리아와 amoebae 함께 혼합 하 고 천 패드를 사용 하 여 단일 영상 평면에 움직일 수 있다. 절차는 호스트 세포 건강의 지표로 서 에스테 르 calcein acetoxymethyl (calcein-오전) 단일 셀 형광 이미징을 사용합니다. 호스트 세포의 형광 박테리아 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 호스트 세포의 노출의 1 시간 후 분석 된다. 이미지 분석 소프트웨어는 호스트 살인 인덱스를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 planktonic 및 표면 부착 녹 농 균 에서 독성을 측정 하기 위해 사용 되었습니다 biofilm 형성의 초기 단계에서 하위 인구 및 다른 박테리아와 biofilm 성장의 다른 단계에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜 독성을 측정 하는 신속 하 고 강력한 방법을 제공 합니다 그리고 많은 성장과 포유류 세포의 유지 보수와 관련 된 복잡성을 방지 합니다. 여기 amoebae를 사용 하 여 측정 하는 독성 고기 또한 마우스 대 식 세포를 사용 하 여 확인 되었습니다. 특히,이 분석 결과 피 녹 농 균에 그 표면 첨부 파일 upregulates 독성 설정 하 사용 되었다.

우리 야생-타입 성장 P. 농 균 PA1419 스트레인 또는 ΔlasR 6 cm 직경 접시에 동일한 PA14 배경에서20 를 변형 하 고 planktonic 및 표면에 연결 된 세포의 독성을 분석. 문화는 PS:DB 문화, 채도를 37 ° C에서 롤러 드럼에 문화 관에서 하룻밤 성장에 단일 식민지에서 주사 했다, PS:DB, 100 rpm, 떨고 6 cm 직경 접시에 8 h에 대 한 성장 planktonic ?...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K 조회수.  University of California. 여기, 선물이 D. discoideum (아메바)를 사용 하 여 호스트 planktonic 또는 표면에 부착 된 세균의 독성을 측정 하는 프로토콜. 독성은 1 시간 동안 측정 하 고 호스트를 죽이 형광 현미경 검사 법 및 이미지 분석을 사용 하 여 계량. 이 프로토콜 P. 농 균박테리아를 사용 하 여 설명 합니다.

비디오: A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

연구

면역학 및 감염병학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Acanthamoeba 종 운동성의 장기 추적 및 정량화

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Acanthamoeba 각막염 예방을 위한 표적 전략 개발을 위한 Acanthamoeba 행동 연구

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

요약

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이 비디오의 챕터

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

방법 감지 세포 독성 Amyloids 다음 감염의 폐 내 피 세포 녹 농 균 에 의해

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

높은 처리량, 높은 콘텐츠, 액체 기반의 C. 선 충 Pathosystem

Acanthamoeba spp.의 정량화 운동성

Acanthamoeba spp.의 정량화 운동성

Acanthamoeba spp.의 정량화 운동성