Name: a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba at JoVE.com

KP と書き、原稿を改訂します。KP は、実験と解析を実行します。この作品は、名前を付けてに国立衛生研究所 (NIH) キャリア遷移賞 (K22AI112816) によって支えられました。

すべての実験手順は、カリフォルニア大学アーバイン校で行われました。
1. バッファーとソリューション
<ol><li>ホストゲノム スープ (LB) 1 L のガラス瓶を準備するには、1 l 二重蒸留水 (ddH2O) の LB ミラー ミックス 25 g を追加します。ペトリ皿、寒天の追加 20 グラムを追加します。オートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天培地を 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。室温で液体のメディアと寒天 4 ° C で保存します。</li>
	<li>D-グルコースの 1 g を混合することによってグルコース酵母ペプトン (激痛) プレート 1 L のガラス瓶を準備、2 g ペプトン、酵母の 0.25 g のエキス、KH2PO4の 4.2 g、ナ2HPO47 H2O の 5.1 g、1 l の ddH2寒天 25 gO をオートクレーブ滅菌します。10 cm 径シャーレに溶融寒天の 25 mL を注ぎ、室温で固化することができます。4 ° C でのストア</li>
	<li>ペプトン 10 g を混合して 1 L のガラス瓶にペプトン S (PS) メディアの準備、7 グラム酵母エキス、D-グルコース、0.12 g の Na2HPO47 H2O、KH2PO41.4 g、40 μ g ビタミン B12の 15 g、80 μ g 葉酸 ddH2o. の 800 の mL での校正日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターと。<ol>
<li>PH メーターを使用して PS の培地の pH を測定します。5 M 島または 5 M H3PO4 6.5 に pH を調整する追加します。1 L に最終的な音量を調整する ddH2o. フィルターを使用して滅菌 0.22 μ m の真空フィルター、4 ° C で保存 注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>開発バッファー総理 × 10 を準備 (DB') KH2PO4Na2HPO4 7 H2O と ddH2O の 13.4 g 3.4 g を 800 mL の容量に追加することで 1 リットルのガラス瓶内のバッファー。日以内 pH メーターが使用されていない場合、pH 4 と 7 の pH の基準を使用して電子 pH メーターを調整します。<ol>
<li>電子 pH メーターを使用してバッファーの pH を測定します。優しく、5 M 島または必要に応じて 5 M H、3PO4を追加して 6.5 に pH を調整します。1 l ddH2O を使用して最終的な音量を調整し、オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。常温で保存します。 注: は、pH 調整など手袋、防護服、眼の保護具保護具を着用して慎重に進めるし、保護に直面します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 の 100 mL を混合することによって開発のバッファー (DB) x 1 を作る DB x' バッファーの 1 mL を滅菌 2 M MgCl21 mL の滅菌 1 M CaCl2。室温でオートクレーブ滅菌 ddH2o ・ ストアを使用して 1 L 瓶で 1 L に最終的な音量を調整します。</li>
	<li>滅菌 PS 媒体の 100 mL を混合することによって 1 リットルのガラス瓶の中の PS:DB メディアの準備、100 mL の滅菌 10 DB x' バッファー、および滅菌 ddH2O の 1 mL と 1 l. サプリメントの合計ボリュームに滅菌 2 M MgCl2 1 mL の滅菌 1 M CaCl2. 4 ° C でのストア</li>
	<li>カルセイン AM 原液を準備するには、製造元によって提供されたプラスチック コンテナーのカルセイン AM の 50 μ g に DMSO の 50 μ L を追加します。-20 ° C にてストア</li>
</ol>2. 成長とアメーバの維持
<ol><li>初期生育期間中にアメーバの食料源として大腸菌株 B/r17を成長します。連勝エシェリヒア属大腸菌の凍結ストックからバックアップ/リストア LB 寒天培地プレート-80 ° C で保存し、シングル コロニーを取得する 37 ° C は一晩で孵化させなさい。</li>
	<li>LB 培地 2 mL にエシェリヒア属大腸菌のバックアップ/リカバリの単一コロニーを接種してローラー ドラムまたは 37 ° C でシェーカーで一晩インキュベートします。</li>
	<li>部屋の温度に一晩大腸菌文化をもたらします。木の棒を使用して、-80 ° C で一晩かけて培養の 750 μ L に冷凍在庫からアメーバを接種します。 無菌成長18のことができる注: 使用D. キイロタマホコリカビひずみ AX3。この手順は、無菌の成長を必要はありませんが、以降のステップは彼の要件を持っています。</li>
	<li>すぐにブドウ糖酵母ペプトン (激痛) プレート大腸菌アメーバ-混合物の 700 μ L を追加します。行ったり来たり、サイドにサイド必要に応じてそれを傾けることによってプレートの表面に均等に文化を広めます。拡散機の使用を避けます。</li>
	<li>高湿度を保持するボックスの上向き寒天と石膏板を配置します。2 つの使い捨て可能なプラスチック容器を使用 (183 cm × 183 cm × 91 cm) 互いの上にスタックします。約 25 mL の水で、下のコンテナーを埋める、水貯留層から最上位のコンテナーに移動する水分が許可されるようにコンテナーの床に開けられたいくつかの 0.5 cm 直径穴を持つ最上位のコンテナーを配置します。</li>
	<li>アメーバの胞子が観察された (図 2) プレートの表面近く成長するまで 4-5 日、石膏板、22 ° C でボックスを孵化させなさい。冷蔵インキュベータを使用すると、室温で放置ではなく、プレートを孵化させなさい。 注: 胞子が成長して後、彼ら実行可能なまま数週間プレートに 4 ° C で保存する場合寒天面を上向きにプレートを格納します。インキュベーションの 3-4 日後、アメーバの胞子形成の発症を示すが、細菌の芝生内のクリアのゾーンを観察できます。<ol>
<li>インキュベーション (図 2) の 4-5 日後、小さなアメーバ版面の上の胞子を観察します。 注: はにつれて胞子の質の低下はこの期間を超えても、一週間以上のアメーバがないです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 mL の滅菌ピペット チップの板の表面に平行をスイープすることにより、アメーバの無菌の成長に備えてアメーバ胞子を収集します。10 cm シャーレの半分から胞子を収集します。 注: は、このモーションエシェリヒア属大腸菌の多数を収集として寒天プレートの表面に先端は触れないでください。</li>
	<li>PS 培地 1 mL に先端を浸すと、上下に軽くピペッティングによるピペットの先端に、アメーバを再懸濁します。</li>
	<li>0.25 倍の濃度で抗生物質抗真菌薬ソリューションと PS 培の 25 mL を含む 250 mL フラスコに接種の混合物を転送します。 注: は、-20 ° C で 250 μ 因数として抗生物質抗真菌薬ソリューションを格納します。融解とこれはその有効性を減らすかもしれない、このソリューションの凍結の繰り返しは避けてください。</li>
	<li>100 rpm で回転シェーカーの 22 ° C で axenically アメーバを成長します。600 で測定光学密度に細胞を成長ステップ 5 で病原性試金のための 0.2 〜 0.5 nm (外径600)。 注: この手順 (手順 2.7) 接種の時から成長の 3-4 日が必要です。細胞より高い密度に成長している場合、外径600 0.05 以下 PS 媒体に戻って文化を希釈し、0.2 〜 0.5 の OD600に戻る。</li>
</ol>3.緑膿菌の成長
<ol><li>LB プレートから膿のシングル コロニーをピックアップ、2 mL の PS:DB 文化に接種し、飽和する 37 ° C で一晩成長します。 注: は、PS:DB メディアに抗生物質抗真菌薬ソリューションを追加しないでください。</li>
	<li>PS:DB を使用して 6 cm 径シャーレに一晩文化 1: 100 または縮尺を希釈します。浮遊性細胞の病原性は試金されるだけ場合、は、代わりに従来の培養管を使用して文化を育てます。37 ° C で 100 rpm に設定ベンチトップ回転子の文化を振る</li>
	<li>再現性を確保するための特定の時間ポイントで文化を収穫します。病原性を評価する前に 1 時間 30 分は、セクション 4 で説明した寒天パッドを準備します。 注: P. 緑膿菌の病原性は表面に成長の約 8 h によって誘導されます。</li>
	<li>表面接続型細胞を分離するには、液体培地をシャーレから削除、浮遊性細胞を除去する DB バッファーの 1 つの mL で十分に洗い流して、すぐに 5.1 の手順に進みます。 注意: 30 以上洗っていない同志として s を混乱させる細胞の表面接続をデタッチし、病原性測定に影響を与える可能性があります。</li>
	<li>浮遊性細胞を分離するには、きれいなシャーレにシャーレから文化の 10 μ L を転送し、5.1 のステップに進んでください。</li>
</ol>4. 顕微鏡 - 寒天パッドの準備
<ol><li>アメーバは膿と混合する準備ができている前に、寒天パッド 1 時間に約 30 分を準備します。</li>
	<li>250 mL フラスコにバッファーが DB の 1% (w/v) 寒天の 50 mL を電子レンジします。寒天の塊までミックスすべての 20 s が消えます。</li>
	<li>15 分間予熱した 55 ° C の水浴にそれを置くことによって溶融寒天をクールします。</li>
	<li>円錐管に溶融寒天培地 15 mL にカルセイン AM 原液の 15 μ L を追加します。ミックスを軽く反転管 4-5 回、次のステップに進んでください。 注: は、ポリプロピレン 15 mL 遠心管でこの手順を実行します。これは余りにすぐに固めるため寒天になります厚いガラス製の容器は使用しないでください。</li>
	<li>12 cm × 10 cm のガラス板の上に溶融寒天混合物を注ぎ、室温で 10 分間を固めるに寒天を許可します。1.5 cm × 1.5 cm に小さいセクションに印刷されたグリッド上にガラス板を置くと金属製の定規を使用してグリッドに沿って切断によって凝固寒天パッドをカットします。</li>
	<li>使用する準備ができるまで、湿気のあるボックスで水和ゲルを維持します。</li>
</ol>5. 顕微鏡イメージング用細菌アメーバ サンプルの調製
<ol><li>細菌細胞の表面接続型の病原性を試金するには、ステップ 3.4 からの細菌の表面接続型にステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を追加します。 注: この手順では、バクテリアとアメーバの混合について説明します。</li>
	<li>浮遊性細胞毒性アッセイ、ステップ 3.5 から浮遊性細菌の 10 μ L でステップ 2.10 からアメーバ細胞の 10 μ L を混ぜます。 注: は、細菌と混合する前に (0.2 〜 0.5 の600を OD) で axenically 栽培アメーバ細胞を洗浄しないでください。抗生物質・抗真菌薬のソリューションを使用するためアメーバ文化では、大腸菌の成長は観察されなかった.</li>
	<li>すぐにペトリ皿表面の細菌アメーバ混合物の上にステップ 4.5 から 1.5 cm × 1.5 cm カルセイン AM 寒天パッドを配置します。 注: は、クイック滑らかな動きを使用して混合物の上に寒天パッドを配置します。この動きはパッドの下側から外周に向かって細胞をプッシュする傾向があるのでゆっくりと混合物の上にパッドを低くしてはいけない。この手順により、細菌やアメーバに均等に混合、固定化、両方の細胞の種類と同じ平面に限られています。</li>
	<li>優しく周囲の寒天パッド残りの液体をピペットで余分な液体を削除します。室温で 20 分間乾燥にペトリ皿を許可します。</li>
	<li>フタ付きシャーレでカバーし、室温 6.1 の手順に追加 40 分続行で固定化したアメーバ細菌混合物を孵化させなさい。 注: 時間の経過とともにバック グラウンド蛍光が増加するにつれて、時間の同じ量のすべてのサンプルをインキュベートすることが重要です。1 h のインキュベーション時間をお勧めします。1 h 以上孵化、バーストし始めるかもしれないアメーバ細胞、以下再現。</li>
</ol>6. 顕微鏡画像の取得
<ol><li>明視野観察と緑の蛍光画像を取得できる蛍光顕微鏡を用いたイメージ アメーバ。蛍光グリーンの 474/27 緑色蛍光タンパク質 (GFP) フィルターを使用して、nm、525/45 nm 励起と放射、それぞれ。(開口数 ≥0.3) の対物レンズが 10 倍を使用して、アメーバをイメージします。 注: 寒天のカルセイン AM 蛍光グリーン チャンネルで蛍光死んでアメーバが発生します。健康なアメーバは蛍光以外の場合です。</li>
	<li>集録時間位相コントラストの光毒性を制限し、像の強度のダイナミック レンジを最適化する GFP チャンネルを調整します。必要に応じて差動干渉の対照 (DIC) の位相コントラストに置き換えて。 注: は、可能であれば位相差顕微鏡および GFP 蛍光の 100-200 ms のエクスポー ジャーを使用します。実験全体を通じてそのまま露出と計測器の設定をしてください。これはホスト殺害のインデックスを計算するために重要です。</li>
	<li>殺害インデックス計算ホスト良いの統計情報を取得するために、少なくとも 100 のアメーバ細胞のイメージを取得します。</li>
</ol>7. 画像解析とホスト殺害インデックス
<ol><li>ImageJ を用いた画像解析を実行します。</li>
	<li>ファイルをクリックして ImageJ で位相コントラストの画像ファイルを開く |オープンイメージを選択するとします。画像をクリックすると、しきい値を調整 |分析 |しきい値。強度ピーク (図 3A) のみを選択する上限と下限のしきい値を調整します。</li>
	<li>プロセスをクリックして、画像をバイナリに変換 |バイナリ |バイナリを作る。プロセスを選択することで穴を埋める |バイナリ |穴を埋める。 注: は、ソースとして、図 1のイメージを使用して、手順 7.1 7.2 暗い領域 (図 3B) としてアメーバや細菌の表面接続が表示されます、画像が生成されます。</li>
	<li>分析で面積と平均グレー値のボックスを確認 |測定の設定。メイン ツールバーの [楕円] ツールを選択することで、アメーバのおおよそのサイズを測定します。[分析 |測定と代表的なアメーバの領域に注意してください。</li>
	<li>分析をクリックして、アメーバのマスクを作成 |粒子の分析。[サイズ] ボックス、アメーバが含まれますが、細菌を除外する領域を入力します。オプションを表示ドロップ ダウン メニュー バーでマスクを選択します。マネージャーに追加] ボックスがチェックされていることを確認します。</li>
	<li>[Ok]と表示だけアメーバと ROI マネージャー] ダイアログが表示されます (図 3C) イメージをクリックします。</li>
	<li>ファイルを使用して蛍光画像を開く |オープンし適切なファイルを選択します。Shift キーを押し、リスト (図 3D) の各地域をクリックするROI マネージャーですべての地域を選択します。</li>
	<li>ROI マネージャーでメジャーボタンをクリックします。これは、各アメーバの平均強度の値を表示する結果ウィンドウが開きます。</li>
	<li>各アメーバの蛍光値を表計算プログラムにコピーし、蛍光のすべての値の平均を取ることによってインデックスを殺害ホストを計算します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

このプロトコルでは、膿で病原性を試金する迅速・定量法について説明します。このプロトコルは、他の細菌テスト可能性があります。ただし、成長媒体がアメーバの成長条件と互換性があることを留意することが重要です。特に、我々 は細菌の成長媒体として PS:DB を使用してプロトコルを最適化してきました。その他のメディアを使用している場合、細菌細胞培地が、アメーバと?...

細菌感染は、人間と動物の1,2の死亡率の主要な原因のひとつです。文化やバイオ フィルム中の細菌の毒性を測定する能力は、医療と研究の設定で重要です。ここでは、細菌の病原性を定量化する汎用性の高い、迅速かつ比較的簡単な方法をについて説明します。真核生物キイロタマホコリカビ(アメーバ) は、ホストのモデル有機体として使用されます。D. キイロタマホコリカビは、緑膿菌(P. aeruginosa)3,4,5その他細菌6,7 病原性因子を同定するホストとして使用されています ,8タイプ III 分泌9,10を含む哺乳類の細胞を殺す病原因子が同じ主に影響を受けやすい。D. キイロタマホコリカビを使用して前の病原性アッセイは、時間3,4、5のコース上D. キイロタマホコリカビの細胞と細菌の長期暴露を関与しています。ここでは、プロトコルこのアメーバを使用して病原性を決定する急速な手法を提案します。(図 1) このプロトコルを記述する方法: (1) axenically (細菌の不在) のアメーバを成長、(2) 試金のための細菌の成長, (3) 細菌の準備、顕微鏡、(4) のホスト細胞を落射蛍光顕微鏡を実行および (5) アメーバの分析蛍光。
アメーバ最初凍結する在庫からを縞になる、エシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) の芝生上に成長した、アメーバが胞子を作り出します。これらの胞子が選ばれ、無菌成長用濃縮培地に接種します。細菌の病原性の評価のための細菌と混合する準備ができるまで、栄養豊富な条件で無菌の成長を通じて、アメーバが維持されます。生存率や、アメーバの死は、カルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン (カルセイン AM) で、細胞内エステラーゼによって切断され、蛍光11,12の活性化により、蛍光を測定することによって定量化されます。強調したに対し、ライブ アメーバがほとんど、あるいはまったく蛍光を展示し、死細胞蛍光激しくないです。この結果は、ほとんどあるいは全く健全なアメーバと定款にカルセイン AM 定款と胸の谷間強調したアメーバ13で基板の原因です。この現象は、特に哺乳類セル11,14,,1516カルセイン AM 蛍光から区別されます。
細菌の病原性を評価することは、別に栽培しています。ここでは、膿の日和見病原体の病原性を測定し、浮遊性 (水泳) および表面接続型のサブ集団の病原性を定量化する方法について詳しく説明する方法をについて説明します。このプロトコルは、他の細菌の病原性をテストに適応させること。病原性表面接続型セルでアクティブにされ浮遊性細胞では低いことを示す代表結果セクションで以前13に報告しました。表面接続型の病原性活性化膿は、非病原性の浮遊性細胞が、アメーバによって消費されている間にアメーバを殺します。浮遊性細菌の病原性は試金されるだけ、細菌がプロトコルで説明されているようにペトリ皿を使用するのではなく、普通の培養管で培養することができます。
アメーバや膿文化の成長は、膿の文化、アメーバは定常状態の栄養豊富な条件で育っている間目的の成長フェーズに到達するように調整しなければなりません。この状態は通常、細菌と混合されるとき、少なくとも 1 日前に希釈するアメーバ文化を必要です。アメーバや細菌寒天パッドを使用して固定、1 h の共同培養、低解像度 (10 X 開口数 0.3) 客観的、緑色蛍光タンパク質 (GFP) をフィルターして撮像カメラを使用してイメージを作成します。分析は、ImageJ の自由に利用できるソフトウェアを使用して実行することができます。 または、画像解析ソフトをカスタマイズします。我々 の分析は、科学的な分析パッケージ13を使用して作成された独自のソフトウェアを使用して行った。ソフトウェア位相コントラストを使用してマスクを作成し、蛍光画像のマスクされた領域から蛍光値を抽出.蛍光値の少なくとも 100 の細胞、数値ホスト殺害のインデックスの結果を平均値します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar, dehydrated</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Aliquot &amp;lt; 1 mL and store at -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calcein Acetoxymethyl (AM)</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Special peptone</td><td>Oxoid</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hyroxide</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain AX3&lt;sup&gt;18&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Siryaporn lab</td><td>Strain B/r&lt;sup&gt;17&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Siryaporn lab</td><td>PA14</td><td>PA14 strain&lt;sup&gt;19&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &amp;Delta;lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>PA14-derived strain&lt;sup&gt;20&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m filter&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>For filter sterilization</td></tr><tr><td>Conical tube, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Glass storage bottles</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Petri dish, 6 cm diameter</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Petri dish, 10 cm diameter</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>100 x 15 mm polystyrene plates</td></tr><tr><td>Plastic containers with lid</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Square 3-cup containers</td></tr><tr><td>Glass plates</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.</td></tr><tr><td>Wooden sticks</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objective&amp;nbsp; 0.3 NA</td><td>Nikon</td><td>MRH20101</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence excitation source</td><td>Lumencor</td><td>Sola light engine</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&amp;nbsp;</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Microscope setup</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software for image analysis</td></tr><tr><td>Orbital shaker incubator</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>For growth of bacteria at 37 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Platform shaker</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Undercounter refrigerated incubator</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>For growth of amoebae at 22 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Isotemp waterbath&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>For cooling media to 55 &amp;deg;C</td></tr></tbody></table>

a rapid image-based bacterial virulence assay using amoeba

伝統的な細菌の病原性アッセイは、宿主細胞に数時間にわたって細菌の長期暴露を含みます。この時、細菌はホスト生育環境への暴露と宿主細胞の存在のための生理学の変更を受けることができます。細菌が宿主細胞の存在下で成長する範囲を最小限にする細菌の病原性の状態を迅速に測定するアッセイを開発しました。細菌やアメーバ一緒に、寒天のパッドを使用して単一画像平面に固定化しました。手順は、ホスト細胞の健康の指標としてカルセイン-アセトキシメチルセファロスポリン エステル (カルセイン AM) と単一細胞の蛍光イメージングを使用します。宿主細胞の蛍光は、落射蛍光顕微鏡による細菌の宿主細胞の露出の 1 時間後に分析されます。画像解析ソフトを使用して、ホスト殺害のインデックスを計算します。このメソッドは、浮遊性と表面に接続された緑膿菌の病原性を測定するために使用されていますバイオ フィルム形成の初期段階でのサブ集団と他の細菌とバイオ フィルムの成長の他のステージに適応があります。このプロトコル病原性を測定する迅速で堅牢な方法を提供し、成長と哺乳類セルラインの維持に関連する複雑さの多くを回避できます。病原性表現型を用いてここでアメーバもマウスのマクロファージを使用して検証されています。特に、このアッセイは、膿が付着 upregulates 病原性を確立する使用されました。

育った野生型膿ひずみ PA1419または ΔlasR 6 cm 径シャーレで同じ PA14 背景に20をひずみし、浮遊性および表面接続型細胞の病原性を検定します。文化は、PS:DB 文化、彩度を 37 ° C でローラー ドラムの培養管で一晩栽培にシングル コロニーから接種、PS:DB、100 rpm で揺れ 6 cm 径シャーレで 8 h の成長と浮遊性表面接続に 1: 100...

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A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.1K ビュー.  University of California. ここでは、ホストとしてD. キイロタマホコリカビ(アメーバ) を用いた浮遊性や表面に接続された細菌の病原性を測定するためのプロトコルを提案する.1 時間の期間にわたって病原性を測定し、ホストを殺すは、蛍光顕微鏡、画像解析を用いた定量化されます。緑膿菌を使用してこのプロトコルを示す.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

免疫・感染学

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

<meta charset="utf8"></head><body>アカントアメーバ種の運動性の長期追跡と定量化

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential contamination of contact lenses after water exposure, the natural behavior of this pathogen remains elusive. Understanding Acanthamoeba's movement patterns can inform us about how it colonizes contact lenses and contaminates the patient's cornea. It is fortunate that Acanthamoeba spp. are visible via brightfield microscopy starting at 4x magnification. Previous techniques have been developed to quantify Acanthamoeba motility in regard to cytopathic effects or under-exposure to the electric field. Here, we describe a method to track and quantify Acanthamoeba spp. motility long-term (hours to days), which is a protocol applicable to multiple amoeba strains, surfaces, and nutritional status of amoeba. This procedure is germane to determining many core motility quantifications, such as distance, speed, confinement, and directionality, which are necessary to monitor different stages of infection, proliferation, or behavioral change.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:アカントアメーバ角膜炎を予防するための的を絞った戦略を開発するためのアカントアメーバの行動の研究

This procedure describes how to visualize, track, and quantify Acanthamoeba spp. motility.

アメーバを用いた急速なイメージに基づく細菌の病原性試験

要約

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この動画の章

T6SS媒介細菌競争を監視するには、Visualアッセイ

細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

原虫でプライミング細菌で扱いやすい哺乳動物細胞感染

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

検出細胞毒性アミロイド次感染症の肺による内皮細胞緑膿菌法

貪食細胞における細胞内のレプリケーションの結核菌 abscessusの病原性マーカーの同定

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

アカントアメーバ属の定量化運動

アカントアメーバ属の定量化運動

アカントアメーバ属の定量化運動