סוכן cruzi trypanosoma של מחלת צ'אגס עשוי לייצר זיהומים סימפטומטיים לאורך זמן שעלולים לפרוץ פתוח לפתולוגיה קלינית מוכרת. הממצא של קן קרוזי טריפנוסומה בצינור החצי-חצי של ילד שמת ממחלת צ'אגס מרמז על פרוטוקול המחקר כדי לפענח את השידור המיני האפשרי של טפילי צ'אגס. לספק טיפול רפואי לתקופה של חמש שנים ולגייס את המשפחות, מראה משתתפים עם סימפטומים קליניים של מחלת צ'אגס חריפה, ACG.
השיג 15 מ"ל של דם ורידי של משתתפי המשפחה בשלוש הזדמנויות שנה בנפרד, מחולק לשלושה, חמישה מיליון aliquots ולאחסן בארבעה Centigrades. אסף שני מ"ל של השפיכה סרום ממתנדבים מבוגרים להראות את T.cruzi בדם של מקרי ACG כדי לאמת את בדיקות מולקולריות. לבודד את T.cruzi מן aliquot דם ACG מאוחסן בצינור סטרילי 10 מ"ל עם נוגד קרישה.
לחסן חמישה מ"ל של הדם לתוך 50 מ"ל שיפוע צינור בתוספת חמישה מ"ל של עירוי כבד לנסות בינוני דגירה בשייקר ב 27 Centigrades במשך שלושה חודשים. חפש מיקרוסקופיה עבור T.cruzi ב 100 microliter של supernatant על מגלשת הזכוכית. לקצור את הדגלים מן הצנטריפוגות בינוני ב 1, 000 x G במשך 10 דקות שטף PBS pH 7.4.
לחסן 75 מ"ל L6 שריר תאים תרבות בקבוק כל אחד עם 10 כדי השישי T.cruzi מבודד. להאכיל את תאי התרבות עם 15 מ"ל של Dulbecco מינימלי חיוני בינוני, DMEM ב 37 Centigrades. לגדל את הטפיל מבודד ואת השליטה החיובית ברניס T.cruzi.
הגדל את יחסי T.cruzi לישמניה ברזילינסיס ב DMEM כשליטה שלילית. השתמש 10 x 10 לתרבות הרקמה השישית נגזר T.cruzi trypomastigotes להדביק עכברים. חפש את הקינים של T.cruzi בחלקים של השרירים והאיברים של רבייה לאחר חודש אחד.
השתמש aliquots הדם בצינור EDTA קורנינג סטרילי 10 מ"ל ולאסוף את התאים הלבנים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות ב 3, 000 x G במשך 45 דקות. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS וצנטריפוגה ב 1, 500 x G במשך 10 דקות בצינור אחר. לחלץ את ה-DNA מן לבודד שנשלח מן Berenice T.cruzi מ L.braziliensis מ 109 נבדקים משפחתיים מן spermatozoa מ 21 משתתפים כמו בשלב 3.3 של הפרוטוקול.
למדוד את ריכוזי ה-DNA על 0.8% ג'ל אגרוז נספג ב 206 ננומטר. השתמש T.cruzi TCZ מקף אחד שני פריימרים anneal לבדיקה 188 נוקלאוטיד בניתוח PCR. הפוך את תערובת PCR עם 10 ננוגרם תבנית DNA, 0.4 micromolar של כל זוג פריימרים, שתי יחידות מלאי DNA פולימראז, 0.2 מיקרומולרית DNA-TPs, ו 5 micromolar מגנזיום כלוריד בנפח סופי 25 מיקרוליטר.
לנהל את הגברה DNA כמו בשלב 3.5.2 ולהראות את רצועות DNA בג'ל. השתמש T.cruzi 188 נוקלאוטיד בדיקה anneals עד כה תווית פריימרים עם אלפא 32P dATP ולהפריד את המוצר PCR על 1.3% agarose ג'ל ולהעביר קרום ניילון טעון חיובית. לשטוף את הממברנה ועכשיו לחשוף לשדה צילומי רנטגן לתקופות משתנות.
הגדל את השיבוטים שנבחרו מהשדה של צילומי הרנטגן ורצף מסחרי עם TCZ מקף אחד שני פריימרים. לנהל שלוש בדיקות immunofluorescence עצמאית ולהכשיל אחד עד 100 דילול סרום ב- PBS מ 109 משתתפי המחקר. צנטריפוגה חמשת מיליליטר aliquot של הדם הסגור ב 1, 000 x G במשך 30 דקות ולאחסן את הנסיוב במינוס 20 Centigrades.
הפעל דילול עצמאי של סרום immunofluorescence מדגימות המחקר שהושגו בשלוש הזדמנויות שנה אחת בנפרד. השתמש 5 microliter של T.cruzi צמות רשמית או L.braziliensis promastigotes, 10 טפילים לכל microliter במתלי PBS על מגלשת זכוכית ולתת לו להתייבש לילה, כמו בשלב 5.3.3. הדגירה את הטפיל על הזכוכית עם 100 microliters של אחד עד 100 דילול סרום לכסות עם להחליק בתא לח במשך שעה אחת ב 37 Centigrades, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
הדגירה את מגלשות הזכוכית המיובשות באוויר עם דילול של 1 עד 1,000 של נוגדן ארנב שכותרתו פלואורסין ל- IgG האנושי, לשטוף ולייבש גם כן. הר את מגלשת הזכוכית עם פתק כיסוי ובדוק אותה תחת מיקרוסקופ אור UV. לזהות את T.cruzi ואת אנטיגן מסיס L.braziliensis מיקרוגרם אחד ב 100 מיקרוליטר של pH מאגר קרבונט 9.6.
דגירה עם 100 microliter של אחד עד 100 דילול סרום בארות רבעים טרילייט. לשטוף את הצלחות פעמיים עם פתרונות PBS-Tween ולחכות להתייבש. דגירה עם 100 microliter של אחד עד 1, 000 דילול של אלקליין פוספטאז להצטייד, עז נגד ארנב IgG.
לשטוף את הצלחות פעמיים עם PBS-Tween, להוסיף את המצע para-nitrophenylphospate ולחכות להתפתחות הצבע. קרא את הצפיפות האופטית ב- 630 ננומטר אצל קורא לוחות מרובה מצבים. טרנסילומינציה ביצי עוף פוריות ולעשות חור בקליפה בבועה שלהם.
לחסן 100 טריפומסטיגוטים על כל מדיום תרבות פגז בביצים שליטה מדומה. לאטום את החור עם סרט דבק. הדגירה את הביצים ב 37 סנטיגרדים, 65% לחות במשך 21 ימים.
לגדל את הגוזלים בקעו מקבוצה חיה של ביצי בקרה א' מהבקרות המדומה, קבוצה ב' ומהביצים שחוסנו על ידי טי-קרוזי, קבוצה ג' עד לחייהם הבוגרים. אתגר את התרנגולות של קבוצה B ו- C פעמיים עם 10 x 10 כדי השביעי באופן רשמי דגירה טריפומסטיגוטה שבועי. השג שני מ"ל של הדם הוורידי מוריד כנף של תרנגולות A, B ו- C חמישה שבועות לאחר האתגר.
הפרד את הסרום והפעל מנתח שפעת חיסונית כדי לזהות את הנוגדן T.cruzi. להבטיח את רווחת בעלי החיים עם דיור מעולה, מזון ואספקת מים. השתמש שפיכה הזרע ממבוגר, ומקרה מחלת צ'אגס חיובי APCR, ומנושא שליטה כמו בשלב 1.5 של הפרוטוקול.
להחדיר 100 aliquots microliter של זרע לתוך צפירתי לתוך הנרתיק של עכברים. השידור המיני של זיהום T.cruzi בעכברים הורים וצאצאים. טביעת הרגל של טריפאנוסומה cruzi ממחלת צ'אגס חריפה הראה על ידי מוצרי nDNA-PCR כי טופס מראש עם בדיקה שכותרתו רדיו.
הפנוטיפ של ה-T.cruzi התגלה עם ההתמדה האימונו-פלואורסצנטית. האנטי-טי. נוגדן קרוזי אינו מזהה L.braziliensis.
ייצוג גרפי של ELISA והמסילים של nDNA-PCR. קבוצות 1 ו-2 בהתאמה, שליטה שלילית וחיובית. קבוצה שלישית, nDNA-PCR חיובי ואת בדיקות הנוגדנים הספציפיות.
קבוצה 4 עם זיהומים T.cruzi זוהה על ידי nDNA-PCR אבל בהיעדר הנוגדן הספציפי. קבוצה חמש, משתתפים ללא זיהום. ההכאן והמיפוי של אוכלוסיית המשפחה הראו פערים בין היחסים של האנטי-טי.
נוגדן קרוזי ואלה של בדיקות nDNA-PCR. פתוח הוא מרובע ומעגל, זכר ונקבה שליליים. אדום עם אנטי טי.
נוגדן קרוזי ו- nDNA-PCR חיוביים. שחור, חיובי nDNA-PCR לבד. הסובלנות החיסונית בתרנגולות בקעו מביצים מחוסנות של טי קרוזי.
א', שליטה מדומה, ב', תרנגולות מבוקרות חיות מאותגרות עם האנטיגן של טי קרוזי. ג', תרנגולות בקעו מהביצים שחוסנו על ידי טי קרוזי לאחר אתגר עם האנטיגן הספציפי. ההידביקות של T.cruzi הראה על הזרע החדיר לתוך חלל הצפי לתוך הנרתיק.
העכברים הקריבו שלושה שבועות של תמונות סטילס אלה הראו את קן הממסטיגוט בלב, בשריר השלד, ובאגרטלים ובצינור הרחם. השידור המיני של זיהומים T.cruzi במערכת מודל העכבר. T.cruzi נגוע זכרים ונקבות, העביר את הזיהום לחברים נאיביים.
זיהום T.cruzi הועבר אנכית מההורים לעכברים צאצאים. הכתמים הדרומיים חשפו את רצועת הטפילים הנגוע ברוב המלטה של F1. כתם האימונופרוקסידאז T.cruzi amastigotes הראה engoniablast ובאינטרסטיציאלי של אפידידימיטיס ולתוך הלומן של צינורות חצי-חצי-שנתיים של העכברים בני האדון.
ההדגמה הצנחנית של הפרוטוזואן ב -21 מקרים חריפים של מחלת צ'אגס הייתה חיונית כדי לאמת את טביעת הרגל של T.cruzi בכל הנבדקים הנגועים. הפערים בין היחסים בין מבחני הנוגדנים לטפילים לבין אלה של בדיקות חומצות הגרעין חשפו את רוב טביעות הרגליים בחולים נטולי הנוגדנים. ההבדל הרחב מסביר היטב במודל העוף המשתקף ל- T.cruzi לאחר השבוע הראשון של התפתחות העובר.
הסובלנות החיסונית תרנגולות בוגרות הראו את עקבות הטפיל אבל עם היעדר הנוגדן הספציפי. האנטי-קרוזי החיוני בחולה צ'אגס פולט זיהומים נרחבים על החדירות לתוך הנרתיק של העכבר, כמו גם לתוך חלל הצפק. הפתולוגיה הראתה את הקינים של T.cruzi amastigote בשרירי הלב ו השלד ובאגרטלים ובצינור הרחם.
הרבייה של עכברי צ'אגס עם בני זוג נאיביים חשפה את הנקבות והזכרים הנגועים העבירו את ה- T.cruzi לחברים הנאיבים הבלתי נגועים ורוב המלטה שלהם רכשה את הזיהום שהועבר אנכית לצאצאים. הפרוטוקול המשפחתי התייחס לתקלת חומצות הגרעין על מנת לבצע עירויי דם אמינים וחקירות אפידמיולוגיות ולהבהר את פוטנציאל המחלה המתמשכת המועברת במגע מיני של צ'אגס.
