El agente trypanosoma cruzi de la enfermedad de Chagas puede producir infecciones sintomáticas de larga duración que pueden abrirse a la patología clínica reconocida. El hallazgo de los nidos de Trypanosoma cruzi en el tubo seminifero de un niño que murió de la enfermedad de Chagas sugiere el protocolo de investigación para desentrañar la posible transmisión sexual de los parásitos Chagas. Brindar atención médica por el período de cinco años y reclutar a las familias, mostrando a los participantes síntomas clínicos de la enfermedad aguda de Chagas, ACG.
Obtuvo 15 ml de sangre venosa de los participantes de la familia en tres ocasiones con un año de diferencia, divididos en tres, cinco mil alícuotas y almacenar en cuatro Centígrados. Recogida de dos ml de la eyaculación sérica de voluntarios adultos muestran el T.cruzi en la sangre de los casos de ACG para validar los ensayos moleculares. Aislar el T.cruzi de la alícuota sanguínea ACG se almacena en un tubo estéril de 10 ml con anticoagulante.
Inocular cinco ml de sangre en inclinaciones de tubo de 50 ml más cinco ml de infusión hepática de triptosa media e incubar en una coctelera a 27 centígrados durante tres meses. Microscopio de búsqueda del T.cruzi en 100 microlitros del sobrenadante en el portaobjetos de vidrio. Cosechar los flagelados del medio centrifugado a 1.000 x G durante 10 min y lavar en pH PBS 7.4.
Inocular 75 ml de matraz de cultivo de células musculares L6 cada uno con 10 a la sexta T.cruzi aislados. Alimentar las células de cultivo con 15 ml de Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM a 37 Centigrados. Crecer los aislados del parásito y el control positivo Berenice T.cruzi.
Cultivar el pariente de T.cruzi Leishmania braziliensis en DMEM como un control negativo. Utilice 10 x 10 para el sexto cultivo de tejido derivado T.cruzi trypomastigotes para infectar ratones. Buscar los nidos de los T.cruzi en las secciones de los músculos y órganos de reproducción después de un mes.
Utilice las alícuotas de sangre en el tubo estéril de 10 ml de EDTA Corning y recoja las células blancas por centrifugación de gradiente de densidad a 3.000 x G durante 45 min. Lavar las células dos veces con PBS y centrífuga a 1,500 x G durante 10 minutos en un tubo diferente. Extraer el ADN del aislado enviado del Berenice T.cruzi de L.braziliensis de 109 sujetos de la familia y de los espermatozoides de 21 participantes como en el paso 3.3 del protocolo.
Mida las concentraciones de ADN en gel de 0,8% de agarosa y absorbida a 206 nanómetros. Utilice el T.cruzi TCZ un guión dos imprimaciones recocidos a la sonda de nucleótido 188 en el análisis de PCR. Haga la mezcla de PCR con 10 nanogramos de plantilla de ADN, 0,4 micromolares de cada par de imprimaciones, dos unidades de ADN polimerasa, 0,2 micromolarES DNA-TPs y 5 micromolares de magnesio en un volumen final de 25 microlitros.
Lleve a cabo la amplificación del ADN como en el paso 3.5.2 y muestre las bandas de ADN en el gel. Utilice la etiqueta de la sonda de nucleótidos T.cruzi 188 para datar la etiqueta de imprimaciones con dATP alfa 32P y separe el producto PCR en un gel de agarosa al 1,3% y transfiera a una membrana de nylon cargada positivamente. Lave la membrana y ahora exponga al campo de rayos X durante períodos variables.
Haga crecer los clones seleccionados del campo de rayos X y secuencia comercialmente con el TCZ un guión dos imprimaciones. Realizar tres ensayos de inmunofluorescencia independientes y triplicar de uno a 100 dilución sérica en PBS de 109 participantes del estudio. Centrifugar los cinco ml de alícuota de la sangre cerrada a 1.000 x G durante 30 min y almacenar el suero en menos 20 Centigrados.
Ejecutar diluciones séricas de inmunofluorescencia independientes a partir de las muestras de estudio obtenidas en tres ocasiones con un año de diferencia. Utilice 5 microlitros de los T.cruzi amastigotes o promastigotes L.braziliensis, 10 parásitos por microlitro en suspensiones PBS en el tobogán de vidrio y déjelo secar durante la noche, como en el paso 5.3.3. Incubar el parásito en el vaso con 100 microlitros de una a 100 diluciones séricas y cubrir con deslizamiento en una cámara húmeda durante una hora a 37 centígrados, luego lavar dos veces con PBS.
Incubar los portaobjetos de vidrio secado al aire con una a 1.000 dilución de un anticuerpo de conejo con etiqueta de fluoresceína a IgG humano, lavar y secar también. Monte el portaobjetos de vidrio con un resbalón de cubierta y examínelo bajo el microscopio de luz UV. Detectar el T.cruzi y el antígeno soluble L.braziliensis un microgramo en 100 microlitro de tampón de carbonato pH 9.6.
Incubar con 100 microlitros de uno a 100 dilución sérica en pozos triplicados. Lave las placas dos veces con las soluciones PBS-Tween y espere a secarse. Incubar con 100 microlitros del uno a 1.000 diluciones de conjugado de fosfatasa alcalina, igG anti-conejo de cabra.
Lavar las placas dos veces con PBS-Tween, añadir el sustrato para-nitrofenilfospate y esperar el desarrollo del color. Lea las densidades ópticas a 630 nanómetros en un lector de placas multimodo. Transiminar huevos de pollo fértiles y hacer un agujero en la cáscara en su burbuja.
Inocular 100 trypomastigotes en cada medio de cultivo de concha en los huevos de control simulado. Selle el orificio con cinta adhesiva. Incubar los huevos a 37 Centigrados, 65% de humedad durante 21 días.
Cultivar los polluelos eclosionados de huevos de control vivo grupo A de los controles simulados, grupo B y de los huevos inoculados T.cruzi, grupo C hasta su vida adulta. Desafía a los pollos del grupo B y C dos veces con 10 x 10 al séptimo trypomastigote incubado formalmente semanalmente. Obtener dos ml de sangre venosa de una vena de ala de los pollos A, B y C cinco semanas después del desafío.
Separe el suero y ejecute el analizador de inmunofluorescencia para detectar el anticuerpo T.cruzi. Asegurar el bienestar animal con excelente alojamiento, alimentos y suministro de agua. Utilice el semen eyaculado de un adulto, y un caso de enfermedad de Chagas positiva APCR, y de un sujeto de control como en el paso 1.5 del protocolo.
Inculcar 100 microlitros alícuotas de semen en el peritoneal y en la vagina de los ratones. La transmisión sexual de la infección por T.cruzi en ratones parentales y progenie. La huella del Trypanosoma cruzi de la enfermedad aguda de Chagas mostró por los productos nDNA-PCR que se forman de antemano con la sonda radioeléctrica.
El fenotipo del T.cruzi reveló con el ensayo de inmunofluorescencia. El anti-T. cruzi anticuerpo no reconoce L.braziliensis.
Representación gráfica de los ensayos ELISA y de nDNA-PCR. Agrupa uno y dos respectivamente, control negativo y positivo. Grupo tres, nDNA-PCR positivo y los ensayos de anticuerpos específicos.
Grupo cuatro con las infecciones T.cruzi detectadas por el nDNA-PCR pero en ausencia del anticuerpo específico. Grupo cinco, participantes libres de infección. Los heredogramas y el mapeo de la población familiar mostraron discrepancias entre las proporciones de la anti-T.
contrai y los de los ensayos de NDNA-PCR. Abierto es cuadrado y círculo, macho negativo y hembra. Rojo con anti-T.
anticuerpos cruzados y nDNA-PCR positivos. Negro, positivo nDNA-PCR solo. La tolerancia inmune en los pollos eclosionado a partir de huevos inoculados de T.cruzi.
A, control simulado, B, pollos controlados en vivo desafiados con el antígeno T.cruzi. C, pollos eclosionados de los huevos inoculados T.cruzi después de desafío con el antígeno específico. La infectividad de los T.cruzi mostró sobre el semen infunde en la cavidad peritoneal y en la vagina.
Los ratones sacrificados tres semanas de estos alambiques mostraron el nido de amastigo en el corazón, en el músculo esquelético, y en los vasos deferens y en el tubo uterino. La transmisión sexual de las infecciones T.cruzi en el sistema modelo de ratón. Los T.cruzi infectaron a machos y hembras, transmitieron la infección a parejas ingenuas.
La infección por T.cruzi se transfirió verticalmente de los padres a los ratones progenie. La hinchazón del sur reveló la banda de angina de parásitos en la mayoría de las camadas de F1. La mancha inmunoperoxidasa T.cruzi amastigotes mostró engoniablast y en el intersticial de la epididimitis y en el lumen de los tubos semíferos de los ratones progenie.
La demostración parasitológica del protozoo en 21 casos agudos de la enfermedad de Chagas fue crucial para validar la huella de T.cruzi en todos los sujetos infectados. Las discrepancias entre las proporciones de los ensayos de anticuerpos del parásito y las de las pruebas de ácidos nucleicos revelaron la mayoría de las huellas en los pacientes libres de anticuerpos. La amplia diferencia bien explica en el modelo de pollo reflejado a la T.cruzi después de la primera semana del desarrollo del embrión.
La tolerancia inmunitaria a los pollos adultos mostró las huellas del parásito, pero con la ausencia del anticuerpo específico. Los anti-cruzi vitales en los eyaculadores del paciente de Chagas iniciaron infecciones generalizadas sobre inculca en la vagina del ratón y también en la cavidad peritoneal. La patología mostró los nidos de T.cruzi amastigote en el corazón y los músculos esqueléticos y en los vasos deferens y el tubo uterino.
La cría de ratones Chagas con parejas ingenuas reveló que las hembras infectadas y los machos transmitían el T.cruzi a los compañeros ingenuos no infectados y la mayoría de sus camadas adquirieron la infección transferida verticalmente a la progenie. El protocolo basado en la familia abordó el ensayo de ácidos nucleicos con el fin de realizar transfusiones de sangre fiables y consultas epidemiológicas y para dilucidar la posible enfermedad de Chagas de transmisión sexual en curso.
