Das Trypanosoma-Cruzi-Erreger der Chagas-Krankheit kann langanhaltende symptomatische Infektionen hervorrufen, die in die klinisch anerkannte Pathologie aufbrechen können. Der Fund der Trypanosoma cruzi Nester in der Seminifertube eines Jungen, der an der Chagas-Krankheit gestorben ist, legt das Forschungsprotokoll nahe, um die mögliche sexuelle Übertragung der Chagas-Parasiten zu entwirren. Bieten Sie gesundheitsbezogene Versorgung für den Zeitraum von fünf Jahren und rekrutieren Sie die Familien, zeigt Teilnehmer mit klinischen Symptomen der akuten Chagas-Krankheit, ACG.
Erhalten 15 ml venöses Blut der Familienmitglieder bei drei Gelegenheiten ein Jahr auseinander, aufgeteilt in drei, fünf Mil Aliquots und lagern bei vier Centigrades. Gesammelt ejakulat von erwachsenen Freiwilligen zeigen die T.cruzi im Blut der ACG-Fälle, um die molekularen Assays zu validieren. Isolieren Sie die T.cruzi aus dem ACG Blut aliquot wird in sterilen 10 ml Tube mit Antikoagulans gelagert.
Fünf ml des Blutes in 50 ml Tubenneigungen plus fünf ml Leberinfusion Tryptose-Medium impfen und drei Monate lang in einem Shaker bei 27 Grad Celsius inkubieren. Suchen Sie die Mikroskopie nach dem T.cruzi in 100 Mikroliter des Überstandes auf der Glasrutsche. Die Flagellate von der mittleren Zentrifuge mit 1.000 x G 10 min ernten und in PBS pH 7.4 waschen.
Impfen 75 ml L6 Muskelzellkulturkolben mit je 10 bis der sechsten T.cruzi Isolate. Füttern Sie die Kulturzellen mit 15 ml Dulbecco Minimal Essential Medium, DMEM bei 37 Grad Celsius. Wachsen Sie die Parasitenisolate und die positiv zu kontrollierenBerenice T.cruzi.
Wachsen Sie die T.cruzi relative Leishmania braziliensis in DMEM als Negativkontrolle. Verwenden Sie 10 x 10 bis zur sechsten Gewebekultur abgeleiteten T.cruzi Trypomastigotes, um Mäuse zu infizieren. Suchen Sie nach den Nestern der T.cruzi in den Abschnitten der Muskeln und Organe der Fortpflanzung nach einem Monat.
Verwenden Sie die Blut-Aliquots in der EDTA Corning sterile 10 ml Tube und sammeln Sie die weißen Zellen durch Dichte Gradient Zentrifugation bei 3.000 x G für 45 min. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und Zentrifuge bei 1, 500 x G für 10 min an einem anderen Rohr. Extrahieren Sie die DNA aus dem Isolat, das aus dem Berenice T.cruzi von L.braziliensis von 109 Familiensubjekten gesendet wird, und aus der Spermatozoe von 21 Teilnehmern wie im Schritt 3.3 des Protokolls.
Messen Sie die DNA-Konzentrationen an 0,8%Agarose-Gel und absorbiert bei 206 Nanometern. Verwenden Sie die T.cruzi TCZ ein Strich zwei Primer anneal zur 188 Nukleotidsonde in der PCR-Analyse. Machen Sie die PCR-Mischung mit 10 Nanogramm-Vorlagen-DNA, 0,4 Mikromolaren jedes Paar Primer, zwei Einheiten Lager-DNA-Polymerase, 0,2 Mikromolar-DNA-TPs und 5 mikromolares Magnesiumchlorid in einem 25-Mikroliter-Endvolumen.
Führen Sie die DNA-Verstärkung wie in Schritt 3.5.2 durch und zeigen Sie die DNA-Bänder im Gel. Verwenden Sie die T.cruzi 188 Nukleotid-Sonde Anneals bis heute Primer Label mit alpha 32P dATP und trennen Sie das PCR-Produkt auf einem 1,3%Agarose-Gel und übertragen Sie auf eine positiv geladene Nylonmembran. Waschen Sie die Membran und setzen Sie sie nun für variable Zeiträume dem Röntgenfeld aus.
Wachsen Sie die Ausflütigen aus dem Röntgenfeld ausgewählt und sequenzieren Sie kommerziell mit dem TCZ ein Strich zwei Primer. Führen Sie drei unabhängige Immunfluoreszenz-Assays durch und dreifache 1 bis 100 Serumverdünnung in PBS von 109 Studienteilnehmern. Zentrifugieren Sie die fünf ml Aliquot des beiliegenden Blutes bei 1.000 x G für 30 min und lagern Sie das Serum bei minus 20 Grad Celsius.
Führen Sie unabhängige Immunfluoreszenz-Serumverdünnungen aus den Studienproben aus, die dreimal im Abstand von einem Jahr gewonnen wurden. Verwenden Sie 5 Mikroliter der formal inkubierten T.cruzi amastigotes oder L.braziliensis promastigotes, 10 Parasiten pro Mikroliter in PBS Suspensionen auf Glasschlitten und lassen Sie es über Nacht trocknen, wie in Schritt 5.3.3. Den Parasiten mit 100 Mikrolitern der einbis zu 100 Serumverdünnungen auf das Glas bebrüten und in einer feuchten Kammer eine Stunde lang bei 37 Grad abrutschen, dann zweimal mit PBS waschen.
Inkubieren Sie die luftgetrockneten Glasgletten mit einer bis 1 000 Verdünnung eines fluorescein markierten Kaninchenantikörpers zum menschlichen IgG, waschen und trocknen. Montieren Sie den Glasschlitten mit einem Deckelschlupf und untersuchen Sie ihn unter dem UV-Lichtmikroskop. Detektieren Sie das lösliche Antigen T.cruzi und L.braziliensis um ein Mikrogramm in 100 Mikroliter Karbonatpuffer pH 9,6.
Inkubieren Sie mit 100 Mikroliter der ein bis 100 Serumverdünnung in dreifach geviertelten Brunnen. Waschen Sie die Platten zweimal mit PBS-Tween Lösungen und warten Sie auf das Trocknen. Inkubieren Sie mit 100 Mikroliter der ein bis 1 000 Verdünnungen des alkalischen Phosphatase-Konjugats, Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG.
Waschen Sie die Platten zweimal mit PBS-Tween, fügen Sie das Substrat para-nitrophenylphospate hinzu und warten Sie auf die Farbentwicklung. Lesen Sie die optischen Dichten bei 630 Nanometern in einem Multimode-Plattenleser. Beleuchten Sie fruchtbare Hühnereier und machen Sie ein Loch in der Schale an ihrer Blase.
Impfen Sie 100 Trypomastigoten auf jedem Schalenkulturmedium in den Scheinkontrolleiern. Versiegeln Sie das Loch mit Klebeband. Inkubieren Sie die Eier bei 37 Grad Celsius, 65% Luftfeuchtigkeit für 21 Tage.
Wachsen Sie die Küken aus lebenden Kontrolleiern Gruppe A aus den Scheinkontrollen, Gruppe B und aus den T.cruzi geimpften Eiern, Gruppe C bis zu ihrem Erwachsenenleben geschlüpft. Fordern Sie die Hühner der Gruppe B und C zweimal mit 10 x 10 zum siebten formell inkubierten Trypomastigotwöchentlich heraus. Erhalten Sie fünf Wochen nach der Herausforderung zwei ml venöses Blut von einer Flügelvene der A-, B- und C-Hühner.
Trennen Sie das Serum und führen Sie einen Immunfluoreszenzanalysator aus, um den T.cruzi-Antikörper zu erkennen. Sichern Sie den Tierschutz mit ausgezeichneter Unterkunft, Nahrung und Wasserversorgung. Verwenden Sie das Sperma Ejakulat von einem Erwachsenen, und eine APCR positive Chagas-Krankheit Fall, und von einem Kontrollsubjekt wie in Schritt 1.5 des Protokolls.
100 Mikroliter Samen in das Peritoneal und in die Vagina von Mäusen einfließen. Die sexuelle Übertragung der T.cruzi-Infektion bei Eltern- und Nachkommenmäusen. Der Fußabdruck des Trypanosoma-Cruzi aus der akuten Chagas-Krankheit zeigte sich bei den nDNA-PCR-Produkten, die sich im Voraus mit der radiomarkierten Sonde bilden.
Der Phänotyp des T.cruzi zeigte sich mit dem Immunfluoreszenz-Assay. Die Anti-T. cruzi Antikörper erkennt L.braziliensis nicht.
Grafische Darstellung des ELISA und der nDNA-PCR-Assays. Gruppen eins und zwei, negative und positive Kontrolle. Gruppe drei, positive nDNA-PCR und die spezifischen Antikörper-Assays.
Gruppe vier mit den T.cruzi-Infektionen, die von der nDNA-PCR, aber in Ermangelung des spezifischen Antikörpers, nachgewiesen wurden. Gruppe fünf, infektionsfreie Teilnehmer. Die Ketdogramme und kartographierten der Familienbevölkerung zeigten Diskrepanzen zwischen den Verhältnissen des Anti-T.
cruzi-Antikörper und die der nDNA-PCR-Assays. Offen ist Quadrat und Kreis, negativ männlich und weiblich. Rot mit Anti-T.
cruzi Antikörper und nDNA-PCR positiv. Schwarz, positive nDNA-PCR allein. Die Immuntoleranz bei Hühnern, die aus t.cruzi geimpften Eiern geschlüpft sind.
A, Mock Control, B, lebende kontrollierte Hühner, die mit dem T.cruzi-Antigen herausgefordert werden. C, Hühner aus den T.cruzi geimpften Eiern nach Herausforderung mit dem spezifischen Antigen geschlüpft. Die Infektiosität des T.cruzi zeigte sich bei Samen in der Peritonealhöhle und in die Vagina.
Die Mäuse, die drei Wochen dieser Stills geopfert wurden, zeigten das Amastigotennest im Herzen, im Skelettmuskel und in den Vasen und in der Gebärmutterröhre. Die sexuelle Übertragung der T.cruzi-Infektionen im Mausmodellsystem. Die T.cruzi infizierten Männchen und Weibchen, übertrug die Infektion auf naive Kumpels.
Die T.cruzi-Infektion wurde vertikal von der Elterin auf die Nachkommenmäuse übertragen. Die Southern Blotting zeigte das Parasiten-Anginat-Band in einem Großteil der F1-Würfe. Der Immunperoxidase-Fleck T.cruzi amastigotes zeigte Engoniablast und im Interstitiell der Epididymitis und in das Lumen der Samenröhrchen der Nachkommenmäuse.
Die parasitologische Demonstration des Protozoens in 21 akuten Fällen der Chagas-Krankheit war entscheidend, um den T.cruzi-Fußabdruck bei allen infizierten Probanden zu validieren. Die Diskrepanzen zwischen den Verhältnissen der Parasiten-Antikörper-Assays und denen der Nukleinsäuretests ergaben den Großteil der Fußabdrücke bei den antikörperfreien Patienten. Der große Unterschied erklärt sich gut im Hühnermodell, das sich nach der ersten Woche der Embryoentwicklung in der T.cruzi widerspiegelt.
Die immunverträglichkeit enthäubten Hühner zeigten die Parasiten-Fußabdrücke, jedoch ohne den spezifischen Antikörper. Die lebenswichtigen Anti-Cruzi in Chagas-Patientenejakulaten lösten weit verbreitete Infektionen bei Einflößen in die Vagina der Maus und auch in die Peritonealhöhle ein. Die Pathologie zeigte die T.cruzi Amastigote Nester in der Herz- und Skelettmuskulatur und in den Vas deferens und der Gebärmutterröhre.
Die Zucht von Chagas-Mäusen mit naiven Kumpels ergab, dass die infizierten Weibchen und Männchen die T.cruzi an die nicht infizierten naiven Partner übertrugen und die Mehrheit ihrer Würfe die Infektion vertikal auf die Nachkommen übertragen. Das familienbasierte Protokoll befasste sich mit dem Nukleinsäure-Assay, um zuverlässige Bluttransfusionen und epidemiologische Untersuchungen durchzuführen und die mögliche laufende sexuell übertragbare Chagas-Krankheit aufzuklären.
